戴富才，張欣，張晶晶，張曉軒，盧玉偉，肖立偉

廊坊師范學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院（廊坊 065000）

車前草別名車前、車輪菜、豬耳草、錢串草等，具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、利尿通淋、清肝明目、清熱解毒等功效[1]，還可以促進(jìn)呼吸道黏膜分泌黏液，稀釋痰液、清肺化痰。車前草中的有效成分有多糖、黃酮、生物堿等[2]，其中，黃酮類化合物是一類呈黃色或橙黃色的化合物[3]，具有抗癌、抗腫瘤、抗氧化自由基等功能，有很好的藥用價(jià)值[4]。

分離純化黃酮類化合物方法眾多[5]，由于大孔樹脂有選擇性好、成本低、易再生處理等優(yōu)點(diǎn)，大孔樹脂吸附法被廣泛用于中草藥活性成分的研究[6-8]，徐懷德等[9]研究大孔吸附樹脂純化洋蔥皮總黃酮，發(fā)現(xiàn)X-5型樹脂分離純化效果較好，洪雪娥等[10]研究大孔樹脂對(duì)薯蔓黃酮吸附分離特性，表明AB-8型大孔吸附樹脂比較適用于薯蔓黃酮的純化。但對(duì)車前草總黃酮的大孔樹脂純化工藝研究卻少有報(bào)道。

試驗(yàn)以車前草為原料，采用正交試驗(yàn)法，優(yōu)選大孔樹脂提純車前草中總黃酮的最佳工藝，并以抗壞血酸和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，對(duì)車前草總黃酮的抗氧化活性進(jìn)行研究，可為車前草的開(kāi)發(fā)利用提供一定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

車前草產(chǎn)自湖北省武漢市蔡甸區(qū)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%，武漢天植生物技術(shù)有限公司）；大孔樹脂NKA-9、NKA-Ⅱ、HPD400、AB-8、D101、X-5等（分析純，天津市精細(xì)化工研究所）；2,2-聯(lián)氮-雙（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）（分析純，上海泰坦科技有限公司）；無(wú)水乙醇、三氯乙酸等試劑（均為國(guó)產(chǎn)分析純）。

1.2 儀器與設(shè)備

722N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；XFB-400高速中藥粉碎機(jī)（湖南吉首市中湘制藥機(jī)械廠）；KQ-250B超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）；RE-5203A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；FA1640A電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；DZF-6050真空干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；THZ-82A水浴恒溫振蕩器（金壇市榮華儀器制造有限公司）；TDL-80-2B低速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；酒精計(jì)（河北省武強(qiáng)紅星玻璃儀表廠）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蘆丁對(duì)照品的配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取20.0 mg蘆丁對(duì)照品于50 mL容量瓶中，用50%乙醇溶解，得0.4 mg/mL對(duì)照品溶液。分別精密吸取0，0.2，0.5，1.0，2.0和3.0 mL的上述溶液于25 mL容量瓶，各加30%乙醇水溶液至10 mL，加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻靜置10 min，加10%氯化鋁溶液0.3 mL，搖勻靜置10 min，5%氫氧化鈉溶液4 mL，加水至刻度，搖勻靜置15 min，配成質(zhì)量濃度分別為0，0.003 2，0.008，0.016，0.032和0.048 mg/mL的系列對(duì)照品溶液，在507 nm處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算其線性回歸方程[11]。

1.3.2 車前草總黃酮得率、含量和產(chǎn)率的計(jì)算

車前草總黃酮吸附率、解吸率、得率、含量和產(chǎn)率計(jì)算[9]如式（1）～（5）所示。

式中：E為車前草總黃酮吸附率，%；D為車前草總黃酮解吸率，%；η為車前草總黃酮得率，%；W為車前草總黃酮含量，mg/g；Y為車前草總黃酮產(chǎn)率，%；C0為車前草總黃酮起始質(zhì)量濃度，mg/mL；Ce為車前草總黃酮平衡質(zhì)量濃度，mg/mL；Cd為車前草總黃酮解吸液質(zhì)量濃度，mg/mL；Vd為車前草樣品解吸后體積；V0為車前草樣品吸附平衡時(shí)的體積；C為溶液中車前草總黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為所取車前草樣品溶液體積，mL；M為所取車前草樣品溶液烘干后干物質(zhì)質(zhì)量，g；G1為純化后樣品烘干后質(zhì)量，g；G2為車前草質(zhì)量，g。

1.3.3 樹脂預(yù)處理

按文獻(xiàn)[12]將大孔樹脂進(jìn)行活化，備用。

1.3.4 車前草總黃酮粗提液的制備

將車前草用XFB-400高速中藥粉碎機(jī)攪碎，用0.25 mm即60目篩過(guò)篩，得車前草粉末。

稱取車前草粉末6.0 g，按料液比1∶20（g/mL），用70%乙醇溶解，放在60 ℃、210 W的超聲清洗器中工作80 min，抽濾，棄去沉淀，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸，除去大部分乙醇（酒精計(jì)測(cè)得乙醇體積分?jǐn)?shù)約2%），用去離子水定容于250 mL容量瓶中，得車前草總黃酮粗提液[13]，備用。

1.3.5 大孔樹脂提純車前草中總黃酮的單因素試驗(yàn)

以車前草總黃酮粗提液為原料，以樹脂提純后樣品中總黃酮的得率為指標(biāo)，研究樹脂種類、吸附液pH、吸附液質(zhì)量濃度和解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)這4個(gè)因素對(duì)大孔樹脂純化總黃酮的影響。

1.3.5.1 樹脂種類對(duì)大孔樹脂提純車前草中總黃酮的影響

取1.0 g處理好的AB-8、X-5、NKA-9、NKA-II、D101、HPD400等6種樹脂，放于150 mL的錐形瓶中并加15 mL 0.1 mg/mL的粗提液，置于25 ℃、120 r/min的水浴恒溫振蕩器中震蕩6 h至吸附完全[14]，過(guò)濾，取1 mL濾液放入25 mL容量瓶中，按步驟1.3.1顯色法測(cè)定吸光度，計(jì)算吸附液中總黃酮質(zhì)量濃度。用去離子水洗凈并抽干樹脂置于錐形瓶中，加入25 mL 80%乙醇，震蕩6 h至解吸完全，取出過(guò)濾，測(cè)定解吸液中總黃酮的質(zhì)量濃度，計(jì)算總黃酮得率。

1.3.5.2 吸附液pH對(duì)大孔樹脂提純車前草總黃酮的影響

調(diào)節(jié)粗提液至pH 3，4，5，6和7（鹽酸溶液和NaOH溶液調(diào)節(jié)），其他條件不變，參照1.3.5.1進(jìn)行吸附解吸試驗(yàn)，研究吸附液pH對(duì)大孔樹脂提純車前草總黃酮的影響。

1.3.5.3 吸附液質(zhì)量濃度對(duì)大孔樹脂提純車前草中總黃酮的影響

將粗提液質(zhì)量濃度調(diào)為0.1，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mg/mL，其他條件不變，參照1.3.5.1進(jìn)行吸附解吸試驗(yàn)，研究吸附液質(zhì)量濃度對(duì)大孔樹脂提純車前草總黃酮的影響。

1.3.5.4 解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)大孔樹脂提純車前草中總黃酮的影響

將解吸液的乙醇體積分?jǐn)?shù)調(diào)整為50%，60%，70%，80%和90%，其他條件保持不變。吸附和解吸試驗(yàn)參照1.3.5.1，研究解吸液的乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)大孔樹脂提純車前草總黃酮的影響。

1.3.6 正交試驗(yàn)

在4個(gè)單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以總黃酮含量為指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，優(yōu)化工藝。

1.3.7 動(dòng)態(tài)分離純化車前草中的總黃酮

1.3.7.1 上樣液體積和流速的測(cè)定

把處理好的樹脂分別裝在3支1.2 cm×40 cm的玻璃層析柱中，高度15 cm左右，按照正交試驗(yàn)的最優(yōu)條件上樣，分別控制流速1，2和3 BV/h，收集每1 BV并根據(jù)步驟1.3.1測(cè)定吸光度。洗脫液的吸光度達(dá)到上樣溶液吸光度的1/10時(shí)，即為泄漏點(diǎn)。認(rèn)為黃酮類物質(zhì)已通過(guò)，停止上樣[9]。選擇最佳的上樣液體積和吸附流速。

1.3.7.2 解吸液體積的測(cè)定

將吸附總黃酮達(dá)到泄漏點(diǎn)的樹脂，按照正交試驗(yàn)得出的最優(yōu)解吸條件進(jìn)行解吸。每1 BV收集1次，分別取樣檢測(cè)，測(cè)定解吸液中總黃酮含量，確定最優(yōu)解吸液體積。

1.3.7.3 最佳工藝條件的驗(yàn)證

在最佳工藝條件下，以總黃酮含量為檢驗(yàn)指標(biāo)進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)[14]。

1.3.8 車前草總黃酮含量的計(jì)算

在最佳工藝條件下將粗提液經(jīng)樹脂純化，收集解吸液，取1 mL的解吸液于25 mL容量瓶中，按照1.3.1步驟中的顯色方法測(cè)其吸光度，計(jì)算總黃酮的質(zhì)量濃度C。將剩余的解吸液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后進(jìn)行真空干燥，稱重，得M。由式（4）計(jì)算車前草總黃酮含量。

1.3.9 車前草總黃酮產(chǎn)品產(chǎn)率的計(jì)算

稱取6.045 4 g車前草粉末制成粗提液，在最佳工藝條件下進(jìn)行純化，蒸發(fā)濃縮，真空干燥，得到干物質(zhì)的質(zhì)量為0.190 9 g。由式（5）計(jì)算車前草總黃酮產(chǎn)率。

1.3.10 ABTS+·清除率的測(cè)定

ABTS+·溶液：稱取1.892 2 g K2S2O8定容至50.0 mL，取440 μL，用電子天平稱取0.096 0 g ABTS定容至25 mL，二者混合，避光反應(yīng)20 h，使ABTS+·溶液吸光度達(dá)到0.700±0.002（用乙醇稀釋）[15]。取乙醇1.0 mL加ABTS+·溶液9.0 mL，過(guò)10 min，以乙醇為空白，在734 nm處測(cè)量溶液吸光度，記為A0，取各濃度試樣溶液1.0 mL，加ABTS+·溶液9.0 mL，反應(yīng)10 min，以各濃度試樣溶液1.0 mL，加乙醇9.0 mL為空白，在734 nm處測(cè)量溶液吸光度，記為A。每個(gè)濃度平行測(cè)定3次，取平均值。根據(jù)式（6）計(jì)算樣品對(duì)ABTS+·清除率，并以抗壞血酸、蘆丁做對(duì)比試驗(yàn)，比較各試樣對(duì)ABTS+·清除率的大小。

式中：SA為試樣對(duì)ABTS+·清除率，%；A0為樣品濃度為0時(shí)的A734nm值；A不同濃度樣品的A734nm值。

1.3.11 鐵氰化鉀還原能力的測(cè)定

取1.0 mL不同質(zhì)量濃度的總黃酮溶液，分別加①號(hào)溶液1.0 mL，②號(hào)溶液1.0 mL，50 ℃水浴中反應(yīng)20 min，加③號(hào)溶液1.0 mL，取2.5 mL，在小試管中加2.5 mL去離子水，加④號(hào)溶液1.0 mL混勻后靜置15 min?？瞻祝浩渌麠l件不變，①號(hào)溶液用1.0 mL去離子水替代，在700 nm處測(cè)吸光度，按照式（7）計(jì)算樣品對(duì)鐵氰化鉀的還原能力[16]，并以抗壞血酸、蘆丁做對(duì)照試驗(yàn)，比較試樣對(duì)鐵氰化鉀還原能力的大小。

式中：Sf為樣品對(duì)鐵氰化鉀的還原能力；Af為待測(cè)樣品吸光度；Af0為空白組吸光度；①～④號(hào)溶液分別為：①0.5000 g K3Fe(CN)6，定容至50 mL；②NaH2PO42.4930 g，Na2HPO41.4397 g混合定容至100 mL；③5.000 g CCl3COOH，定容至50 mL；④0.1000 g FeCl3（為防止水解，滴入少量鹽酸），定容至100 mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.0057+12.68452x，R2=0.9989。在0～0.048 mg/mL之間，蘆丁的質(zhì)量濃度與樣品吸光度呈線性關(guān)系。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果與討論

2.2.1 樹脂的篩選

由表1可知，不同極性的樹脂對(duì)黃酮的吸附和解吸結(jié)果不同，AB-8、D101、X-5這3種樹脂有較高的吸附率，HPD-400、AB-8、X-5樹脂具有較高的解吸率。綜合得率、吸附率、解吸率，得出AB-8樹脂對(duì)靜態(tài)吸附黃酮的效果最好，所以最優(yōu)樹脂為AB-8；AB-8、X-5、D101型樹脂為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。

表1 不同樹脂對(duì)車前草總黃酮的吸附和解吸結(jié)果

2.2.2 吸附液pH對(duì)車前草中總黃酮分離與純化的影響

由圖2可知，吸附液pH 6時(shí)，得率最高，達(dá)到85.25%。由于黃酮類化合物是具有一定酸性的多羥基酚類化合物，當(dāng)pH＜6或pH＞6時(shí)，黃酮類化合物的穩(wěn)定性會(huì)降低。所以最優(yōu)pH為6，選擇pH 5，6和7作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。

圖2 吸附液pH對(duì)吸附效果的影響

2.2.3 吸附液質(zhì)量濃度對(duì)車前草中總黃酮的分離與純化的影響

從圖3知，隨著吸附液質(zhì)量濃度增加，總黃酮得率也隨之增加，吸附液質(zhì)量濃度0.8 mg/mL時(shí)，總黃酮得率為93.01%，為最高。吸附液質(zhì)量濃度大于0.8 mg/mL時(shí)，樣品液中的雜質(zhì)也會(huì)隨之增加，雜質(zhì)與黃酮產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)吸附反而抑制黃酮分子在樹脂中的擴(kuò)散[17]。所以選擇0.8 mg/mL為最佳吸附液質(zhì)量濃度，正交試驗(yàn)的3個(gè)水平選擇0.6，0.8和1.0 mg/mL。

圖3 吸附液質(zhì)量濃度對(duì)吸附效果的影響

2.2.4 解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)車前草中總黃酮的分離與純化的影響

從圖4知，車前草總黃酮得率隨著解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而增加。解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)80%時(shí)，車前草總黃酮得率最高，為91.92%。但是，如果乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高，大部分雜質(zhì)也會(huì)一起洗脫，從而降低總黃酮純度[7]。因此，解吸液的最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，正交試驗(yàn)的3個(gè)水平選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，80%和90%。

圖4 洗脫劑的體積分?jǐn)?shù)對(duì)車前草總黃酮純化的影響

2.3 優(yōu)化樹脂靜態(tài)分離純化車前草中總黃酮的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)，如表2所示。研究這4個(gè)因素對(duì)總黃酮含量的影響，進(jìn)一步優(yōu)化大孔樹脂的純化工藝。L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

表3 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)極差分析得出RB＞RA＞RC＞RD，各因素對(duì)黃酮類化合物含量的影響順序?yàn)椋何揭簆H＞樹脂種類＞吸附液質(zhì)量濃度＞解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)。其中，對(duì)黃酮含量的影響最大的是吸附液的pH。在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，純化總黃酮的最佳工藝條件為A1B2C3D3，即AB-8樹脂、吸附液pH 6、吸附液質(zhì)量濃度1.0 mg/mL、解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)90%。

3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)得出黃酮含量的平均值為732 mg/g。

2.4 動(dòng)態(tài)試驗(yàn)分離純化車前草中的總黃酮

2.4.1 泄漏點(diǎn)的測(cè)定及流速對(duì)純化工藝的影響

由圖5可以看出，上樣液流速1 BV/h效果最好，泄漏點(diǎn)出現(xiàn)的最晚。但過(guò)低的流速會(huì)使試驗(yàn)的循環(huán)周期變長(zhǎng)，又因?yàn)?和2 BV/h泄漏點(diǎn)出現(xiàn)時(shí)吸附液的體積相差較少，所以綜合考慮，選擇上樣液流速2 BV/h。此時(shí)上樣液體積為14 BV。

圖5 上樣液流速對(duì)AB-8樹脂吸附黃酮的影響

為便于操作，解吸液和吸附液選擇相同流速，即2 BV/h。

2.4.2 解吸液體積對(duì)純化工藝的影響

由圖6可知，解吸液體積達(dá)到4 BV時(shí)可以基本解吸完全，再添加解吸液時(shí)，也會(huì)有少量總黃酮流出，但濃度很低。從成本方面考慮，選取4 BV洗脫液進(jìn)行洗脫。

圖6 解吸液體積對(duì)純化工藝的影響

2.5 最佳工藝條件的驗(yàn)證

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，選擇最佳純化工藝參數(shù)，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，黃酮含量的平均值為875 mg/g。

2.6 車前草總黃酮含量

表4 純化過(guò)程中總黃酮含量的變化

2.7 車前草總黃酮產(chǎn)率

表5 車前草總黃酮產(chǎn)率

2.8 總黃酮對(duì)ABTS+·的清除能力

由圖7可知，抗壞血酸、車前草總黃酮、蘆丁對(duì)ABTS+·都有一定清除能力，在0.2～2.1 mg/mL范圍內(nèi)自由基清除能力的大小為抗壞血酸＞車前草總黃酮＞蘆丁。質(zhì)量濃度達(dá)到1.6 mg/mL時(shí)，抗壞血酸對(duì)ABTS+·清除率為43.18%，車前草總黃酮為41.67%，蘆丁為26.32%，可見(jiàn)車前草總黃酮的清除能力與抗壞血酸接近。

圖7 ABTS+·清除能力的測(cè)定

2.9 總黃酮對(duì)Fe3+的還原能力測(cè)定

由圖8可知，抗壞血酸、車前草總黃酮、蘆丁對(duì)Fe3+都有一定還原能力，在0.2～2.1 mg/mL范圍內(nèi)它們的大小為抗壞血酸＞車前草總黃酮＞蘆丁。在同樣條件下，最大質(zhì)量濃度2.1 mg/mL時(shí)，抗壞血酸對(duì)Fe3+的還原能力值達(dá)4.77，總黃酮達(dá)4.71，蘆丁達(dá)4.59。質(zhì)量濃度達(dá)到1.6 mg/mL時(shí)，繼續(xù)增大濃度，F(xiàn)e3+還原能力變化不大。

圖8 Fe3+還原能力的測(cè)定

3 結(jié)論

用正交試驗(yàn)法優(yōu)化并得到一條大孔樹脂提純車前草總黃酮的提純工藝，在此工藝下，車前草總黃酮產(chǎn)率為3.16%，車前草總黃酮含量由249 mg/g提高到875 mg/g。抗氧化活性數(shù)據(jù)顯示，純化后的車前草總黃酮在0.2～2.1 mg/mL范圍內(nèi)，對(duì)ABTS+·、Fe3+均有不同程度的清除作用，清除率強(qiáng)弱順序?yàn)榭箟难幔拒嚽安菘傸S酮＞蘆丁。表明車前草總黃酮具有一定抗氧化活性，可為車前草的深入開(kāi)發(fā)、產(chǎn)業(yè)附加值的提高提供參考數(shù)據(jù)。