楊麗紅 王娟娟 丁向輝 吉玉潔

（中國(guó)人民解放軍陸軍第八十一集團(tuán)軍醫(yī)院，張家口 075000）

慢性盆腔炎是女性內(nèi)生殖器及其周圍結(jié)締組織、盆腔腹膜的慢性炎癥，常為急性盆腔炎未徹底治療，或急性盆腔炎的病程遷延及反復(fù)發(fā)作。 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor，TGF-β）和Smad蛋白（drosophila mothers against decapentaplegic protein，Smad） 參與了盆腔炎的發(fā)生發(fā)展，是盆腔炎調(diào)控的重要分子[1]。miRNAs在真核生物中表達(dá)具有組織特異性和時(shí)序性，決定組織和細(xì)胞的功能特異性，在細(xì)胞生長(zhǎng)和機(jī)體發(fā)育調(diào)節(jié)過程中起多種作用，研究表明miR-224與組織炎癥具有顯著的調(diào)控關(guān)系，并可通過TGF-β/Smad信號(hào)通路調(diào)控動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和血管重塑，但miR-224在盆腔炎中的作用及機(jī)制尚不清晰[2]。因此本研究將通過機(jī)械損傷及接種混合菌構(gòu)建大鼠慢性盆腔炎模型，探究miR-224-3P及TGF-β/Smads信號(hào)通路在慢性盆腔炎模型大鼠模型表達(dá)及相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物

8～10周齡雌性SPF級(jí)SD大鼠，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 藥品、試劑

水合氯醛購(gòu)自天津市申泰化學(xué)試劑有限公司；混合菌液購(gòu)自無錫賽維科技公司；Rat TNF-α ELISA Kit（RAB0479），購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，Rat NF-κB ELISA Kit（201803）購(gòu)于惠佳生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（6110A）購(gòu)于日本TaKaRa公司；熒光定量PCR試劑盒（RT0411-01）購(gòu)于美國(guó)Biomiga公司；引物由上海生工合成；TGF-β（ab205150）、Smad3 （ab40854），Smad3（ab40854）和二抗（ab150113）抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。

1.3 大鼠分組及飼養(yǎng)條件

40只8～10周齡雌性SD大鼠于SPF級(jí)鼠房飼養(yǎng)，室溫調(diào)節(jié)在25℃±2℃，相對(duì)濕度40%～65%，12 h/12 h晝夜交替照明，自由攝取食物和飲用水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為2組，每組20只。

1.4 大鼠慢性盆腔炎模型的建立

大鼠稱重后按0.4 mL/100 g 10%水合氯醛行腹腔注射麻醉。菌液配置：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、乙型溶血型鏈球菌，按照1∶2∶1混合，用0.9%的NaCl配置終濃度為2×109/mL菌液混合液。用水合氯醛麻醉大鼠后，將大鼠固定，無菌條件下腹部中央切1 cm切口，固定并暴露大鼠雙側(cè)子宮，機(jī)械損傷子宮內(nèi)膜組織，并分別向雙側(cè)子宮腔注入0.1 mL混合菌液，建立慢性盆腔炎模型[3]。

1.5 采血方式及ELISA檢測(cè)

大鼠采用毛細(xì)管眼眶采血，每只大鼠取1 mL。用大鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）、 核因子κB（nuclear factor κB，NFκB） ELISA檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)血清樣本中TNF-α、NF-κB含量水平，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行[4]。

1.6 qPCR檢測(cè)

大鼠眼眶取血后取子宮組織，用TRIzol法提取總mRNA，并立刻反轉(zhuǎn)錄，所有操作在冰上進(jìn)行并避免RNA酶污染，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行qPCR分析，相對(duì)表達(dá)量采用2-△△CT計(jì)算[5]。miR-29c-3p引物，F(xiàn)：GCTGGTTTCATATGGTGG，R：GAACATG TCTGCGTATCTC。TGF-β引物，F(xiàn)：AGCAACAAT TCCTGGCGTTACCT，R：CCTGTATTCCGTCTCC TTGGTTCA。Smad3引物，F(xiàn)：GAAGTCCTCGGA ACTGCCTACCT，R：ACTGTGCCATAGTCACC TGGAAGA。β-actin引物，F(xiàn)：GAGACCTTCAACA CCCCAGCC，R：AATGTCACGCACGAT TTCCC。

1.7 免疫印跡檢測(cè)

采用RIPA蛋白裂解液提取大鼠子宮組織細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳80 v 15 min，120 v 2 h，PVDF膜轉(zhuǎn)膜120 v 2.5 h，TBST 漂洗3次，使用5%脫脂奶粉封閉，TBST漂洗3次每次10 min，加入一抗、二抗孵育后，TBST漂洗3次，每次10 min，ECL 顯色，發(fā)光儀曝光、拍照[6]。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，計(jì)量資料以±s表示，t檢驗(yàn)，相關(guān)性采用雙因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢性盆腔炎大鼠模型構(gòu)建及其子宮炎癥水平的組織學(xué)評(píng)價(jià)

對(duì)照組大鼠宮腔正常，宮壁組織結(jié)構(gòu)清晰，上皮細(xì)胞整齊排列，各層無充血血管，炎癥細(xì)胞無浸潤(rùn)。實(shí)驗(yàn)組宮壁組織結(jié)構(gòu)不清晰，各層分界不明顯，上皮細(xì)胞變性，可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；子宮平滑肌纖維組織增生、粘連，間質(zhì)充血、水腫，出現(xiàn)典型的慢性盆腔炎表征（圖1）。

圖1 大鼠子宮（A1、B1）及H-E染色（A2、B2）

2.2 慢性盆腔炎大鼠外周血炎癥因子的表達(dá)水平變化

ELISA結(jié)果顯示盆腔炎組大鼠外周血TNF-α與NF-κB水平顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）（表1）。

表1 慢性盆腔炎對(duì)大鼠血漿炎癥因子的影響（±s，pg/mL）

表1 慢性盆腔炎對(duì)大鼠血漿炎癥因子的影響（±s，pg/mL）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs 對(duì)照組

組別 TNF-α NF-κB對(duì)照組 107.08±11.48 87.54±9.43實(shí)驗(yàn)組 113.06±8.65* 103.62±3.91**

2.3 慢性盆腔炎大鼠子宮組織中miR-224-3P，TGF-β和Smad3的mRNA表達(dá)水平

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠miR-224-3P表達(dá)水平顯著下降，TGF-β和Smad3 mRNA表達(dá)水平顯著上 升（P＜0.05），miR-224-3P與TGF-β mRNA呈 顯著正相關(guān)（r=0.867，P＜0.01），miR-224-3P與Smad3 mRNA呈顯著正相關(guān)（r=0.826，P＜0.01）（表2）。

表2 慢性盆腔炎大鼠子宮組織miR-224-3P、TGF-β和Smad3 mRNA的表達(dá)（±s）

表2 慢性盆腔炎大鼠子宮組織miR-224-3P、TGF-β和Smad3 mRNA的表達(dá)（±s）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs對(duì)照組

組別 miR-224-3P TGF-β mRNA Smad3 mRNA對(duì)照組 2.05±0.62 1.34±0.30 0.98±0.06實(shí)驗(yàn)組 2.89±0.36* 2.04±0.51** 2.03±0.69**

2.4 慢性盆腔炎大鼠子宮組織TGF-β、Smad3及p-Smad3的蛋白表達(dá)水平

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠子宮組織TGF-β、Smad3和p-Smad3的蛋白表達(dá)水平顯著上升，相對(duì)定量結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)這種趨勢(shì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖2）。

圖2 大鼠子宮組織TGF-β、Smad3及p-Smad3的蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

盆腔炎性是女性上生殖道的一組感染性疾病，其中包括子宮內(nèi)膜炎、輸卵管炎、輸卵管卵巢膿腫、盆腔腹膜炎[7]。盆腔炎癥時(shí)可表現(xiàn)為局部一個(gè)部位，也可表現(xiàn)為同時(shí)累及幾個(gè)部位，以輸卵管炎、卵巢炎最為常見。盆腔炎性疾病在初潮前、無性生活和絕經(jīng)后婦女很少發(fā)生，即使發(fā)生也常常是鄰近器官炎癥的擴(kuò)散，而在性活躍期、有月經(jīng)的婦女中盆腔炎性疾病高發(fā)，盆腔炎性疾病若未能得到及時(shí)、徹底治療，可導(dǎo)致輸卵管妊娠、慢性盆腔痛、炎性反復(fù)發(fā)作，甚至不孕，嚴(yán)重影響婦女的生殖健康[8-10]。本研究通過機(jī)械損傷及接種混合菌構(gòu)建大鼠慢性盆腔炎模型，分離大鼠附件組織，發(fā)現(xiàn)盆腔炎大鼠子宮組織明顯慢性炎癥表征，子宮組織出現(xiàn)出血、黏連等惡性病變，腺體明顯減少，子宮平滑肌纖維組織增生、粘連，上皮細(xì)胞變性、脫落、壞死，宮內(nèi)膜缺失，可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

非編碼RNA（non-coding RNA）是指不編碼蛋白質(zhì)的RNA。其中包括rRNA、tRNA、snRNA，snoRNA 和microRNA 等多種已知功能的RNA，以及未知功能的RNA[11]。這些RNA的共同特點(diǎn)是都能從基因組上轉(zhuǎn)錄而來，但并不轉(zhuǎn)錄翻譯成蛋白質(zhì)，在RNA調(diào)控水平上就能行使各自的生物學(xué)功能。microRNAs （miRNAs）是小型、高度保守的RNA分子，通過與它們的堿基配對(duì)調(diào)節(jié)其同源mRNA的表達(dá)，已成為發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞周期的重要調(diào)控分子[12]。本研究結(jié)果顯示盆腔炎大鼠中miR-224-3P顯著下調(diào)，并且與TGF-β/Smads信號(hào)通路呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)，提示miR-224-3P、TGF-β/Smads信號(hào)通路在慢性盆腔炎發(fā)病中發(fā)揮重要作用。

TGF-β主要在炎癥、組織修復(fù)和胚胎發(fā)育等方面發(fā)揮作用，但對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和免疫功能也都有重要的調(diào)節(jié)作用[13]。Smads家族蛋白可以在將TGF-β信號(hào)從細(xì)胞表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核的過程中起到關(guān)鍵性作用，且不同的Smad介導(dǎo)不同的TGF-β家族成員的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。TGF-β作為配體形成的受體復(fù)合物，激活Smads進(jìn)入核內(nèi)，共同激活或抑制它們調(diào)節(jié)的靶基因的轉(zhuǎn)錄[16]。本研究結(jié)果表明，在大鼠慢性盆腔炎過程中，TGF-β、Smad3在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平均出現(xiàn)了高表達(dá)的變化，同時(shí)p-Smad3表達(dá)也隨之上升，提示miR-224-3P在慢性盆腔炎中發(fā)揮作用可能與TGF-β、Smad3通路的磷酸化相關(guān)。

綜上，本研究表明慢性盆腔炎模型大鼠子宮組織中miR-224-3P表達(dá)與TGF-β、Smad3呈顯著正相關(guān)，其機(jī)制可能與TGF-β/Smad3信號(hào)通路的磷酸化相關(guān)。