陳杰鋒 高 艷

(無限極(中國)有限公司，廣東廣州510000)

引言

中草藥牙膏是我國口腔清潔護(hù)理用品行業(yè)的特色，開發(fā)中草藥牙膏是促進(jìn)中醫(yī)藥傳承創(chuàng)新發(fā)展的具體體現(xiàn)之一。中藥黃芩為草本植物黃芩根的提取物，在中藥學(xué)中，被認(rèn)為味苦、性寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效，在口腔護(hù)理用品的應(yīng)用歷史由來已久?，F(xiàn)代藥理研究表明中藥黃芩提取物的主要成分為黃酮類分子，其中較高的是黃芩素和黃芩甙[1]。黃芩苷具有降壓、鎮(zhèn)靜、保肝、抗菌、消炎等多種藥理作用[2]?！吨袊幍洹酚涊d黃芩苷是黃芩藥材的活性成分之一，且對藥材中黃芩苷的含量有要求。研究了牙膏中黃芩苷含量的測定方法，用于去判斷牙膏中加了黃芩提取物以及其在牙膏產(chǎn)品中穩(wěn)定性。

1 實(shí)驗(yàn)和方法

1.1 儀器與材料

①Agilent 1200Series高效液相色譜儀系統(tǒng)(G1329A ALS，G1311A Quat Pump，G1322A Degasser，G1316A TCC，G1315D DAD)；

②梅特勒-托利多XSE205型電子天平(感量0.01mg)；

③梅特勒-托利多ML204T型電子天平(感量0.1mg)；

④昆山市超聲儀器有限公司KQ-400DE型數(shù)控超聲波清洗器；

⑤Thermo Fisher Sorvall ST 16R離心機(jī)；

⑥IKA MS3渦旋振蕩器；

⑦黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究所，含量以95.4%計(jì))；

⑧植雅牙膏(規(guī)格：140克/支，無限極(中國)有限公司生產(chǎn))；

⑨乙腈(色譜純，默克股份兩合公司)；

⑩無水乙醇(色譜純，賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；

1.2 色譜條件

①色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18(250mm×4.6mm，5μm)；

②流動(dòng)相：A相(乙腈)，B相(0.1%磷酸溶液)，梯度洗脫，見表1；

表1 流動(dòng)相梯度洗脫表

③流量：1.0mL/min；

④柱溫：30℃；

⑤進(jìn)樣量：10μL；

⑥檢測波長：277nm。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：精密稱取黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品50mg(精確至0.01mg)至250mL容量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成200μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

1.4 供試品溶液的制備

稱取試樣1g(精確至0.1mg)于50ml具塞刻度離心管中，加入約1g石英砂，再準(zhǔn)確加入乙醇-磷酸混合溶液(無水乙醇+磷酸+水=50+6+44，體積比)20mL，稱定質(zhì)量，渦旋振蕩2min，25℃水浴中超聲提取40min，冷卻至室溫后用乙醇-磷酸混合溶液補(bǔ)足損失質(zhì)量，5000r/min離心分離10min，取上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，濾液作為試樣溶液上機(jī)待測。

1.5 測定和計(jì)算

按上述條件測定標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和待測溶液，根據(jù)色譜峰的保留時(shí)間和紫外光譜圖定性，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度和色譜峰面積回歸直線方程定量，按公式(1)計(jì)算樣品中黃芩苷的含量。

(1)

式中：X——試樣中黃芩苷的含量，mg/kg；

C——從標(biāo)準(zhǔn)曲線中得出的黃芩苷濃度，μg/mL；

V——試樣溶液的體積，mL；

m——試樣質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的確定

2.1.1 根據(jù)黃芩苷的結(jié)構(gòu)以及理化性質(zhì)，對提取溶劑和提取方法進(jìn)行考察，篩選合理的提取方法?？紤]到牙膏試樣在水中分散效果較好，本次實(shí)驗(yàn)采用有機(jī)溶劑-水體系作為提取溶劑?？疾炝瞬煌壤募状妓芤汉鸵掖妓芤?30%，50%，70%，90%，100%)對含有黃芩苷的牙膏試樣的提取效果，結(jié)果見圖1。當(dāng)有機(jī)溶劑比例從30%增大到50%時(shí)，甲醇-水和乙醇-水作為提取溶劑，均測得試樣中黃芩苷的含量逐漸增多，在比例在50%時(shí)，測得含量最大值。有機(jī)溶劑比例超過50%后，繼續(xù)增大其比例，黃芩苷的含量逐漸減少。綜合兩個(gè)溶劑體系對黃芩苷的提取情況，使用50%乙醇水溶液測得的黃芩苷含量最高。同時(shí)，考慮到牙膏一般具有較好的水分散性，提取溶劑中有機(jī)溶劑的比例越高，牙膏在提取溶劑中的分散效果越差。因此選擇50%乙醇水作為黃芩苷的提取溶劑。另外，為了提高牙膏在提取溶劑中的分散效果，本次實(shí)驗(yàn)選擇加入適量石英砂對牙膏試樣進(jìn)行輔助分散。

圖1 不同比例有機(jī)溶劑水溶液的提取效果對比

2.1.2 提取溶劑中磷酸濃度的選擇

黃芩苷在酸性條件下的化學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定[3]，在提取溶劑中添加一定濃度的磷酸可使碳酸鈣基質(zhì)牙膏溶解更充分，提高黃芩苷的提取效率。本次實(shí)驗(yàn)考察了在溶劑中添加不同濃度的磷酸(0%，0.5%，1%，2%，4%，6%，8%，10%)(體積分?jǐn)?shù))對含有黃芩苷的牙膏試樣的提取效果影響，結(jié)果見圖2。隨提取溶劑中磷酸濃度逐漸增大，測得試樣中黃芩苷含量逐漸增多，其中提取溶劑中添加磷酸濃度為6%、8%、10%時(shí)，黃芩苷提取的效果明顯優(yōu)于其他濃度。同時(shí)測得提取溶劑中磷酸濃度為6%、8%、10%時(shí)，其pH值分別為1.41、1.24、1.11。綜合考慮到提取溶劑酸性過大可能會(huì)對色譜柱的性能及使用壽命造成一定影響，且提取溶劑中磷酸濃度為6%、8%、10%時(shí)，提取效果差異較小，因此選擇在提取溶劑添加磷酸的濃度為6%，即乙醇-磷酸-水溶液(50+6+44)(體積比)作為本方法的提取溶劑。

圖2 提取溶劑中不同磷酸濃度的提取效果對比

2.2 儀器色譜條件的確定

2.2.1 檢測波長的選擇

通過使用二極管陣列檢測器(DAD)對黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液在190-400nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示(見圖3)，黃芩苷在紫外光214nm，277nm，316nm波長處均有特征收。由于214nm波長處容易受到流動(dòng)相的影響，316nm波長處吸光度值較小，皆不適合作為檢測波長，綜合考慮，本方法選擇277nm作為檢測波長。

圖3 黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的紫外吸收光譜圖

2.2.2 色譜柱的選擇

本次實(shí)驗(yàn)考察了Agilent Eclipse Plus C18、Agilent ZORBAX SB-Aq、Waters Xbridge C18和Agilent TC-C18(2)等不同型號相同規(guī)格(250mm×4.6mm，5μm)的C18色譜柱對黃芩苷和試樣基質(zhì)的分離效果。結(jié)果顯示，在優(yōu)化的流動(dòng)相條件下各種C18色譜柱能實(shí)現(xiàn)黃芩苷和試樣基質(zhì)的有效分離，尤其使用Agilent Eclipse Plus C18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱時(shí)，峰形尖銳對稱。綜合考慮，最終選擇使用C18色譜柱作為分離色譜柱。

2.2.3 流動(dòng)相的選擇

本次實(shí)驗(yàn)比較了甲醇-水溶液及乙腈-水溶液兩種流動(dòng)相體系對黃芩苷和試樣基質(zhì)的分離效果。結(jié)果顯示，在乙腈-水溶液流動(dòng)相體系下采用梯度洗脫能夠?qū)崿F(xiàn)黃芩苷和試樣基質(zhì)的良好分離，尤其當(dāng)水相中加入0.1%濃度的磷酸時(shí)，色譜峰峰形對稱、響應(yīng)值較高。因此，本方法采用乙腈-0.1%磷酸作為流動(dòng)相。

2.3 線性范圍與檢出限

分別精密量取1.3步驟中黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液0.25mL、2.5mL、5.0mL、10.0mL、15.0mL、25.0mL置于50mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，分別配制成濃度為1.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、40.0μg/mL、60.0μg/mL、100.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，依前述色譜條件進(jìn)行測定。記錄色譜峰峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得出黃芩苷的回歸方程為：

y=27.6365x-2.3628

R2=0.9999

由以上回歸方程可知黃芩苷在1.0μg/mL～100.0μg/mL之間呈良好線性關(guān)系。

取牙膏試樣按1.4步驟制備待測溶液，通過將該測試溶液逐級稀釋并上機(jī)測試，測定目標(biāo)物的信噪比(S/N)，將所得信噪比大于3時(shí)對應(yīng)的稀釋后濃度作為方法的檢出濃度，結(jié)果顯示，本方法的檢出濃度為0.05μg/mL。當(dāng)試樣稱樣量為1g，溶液定容體積為20mL時(shí)，方法檢出限為1mg/kg。

2.4 方法特異性

本次實(shí)驗(yàn)分別考察了3種基質(zhì)牙膏(二氧化硅基質(zhì)、碳酸鈣基質(zhì)和磷酸氫鈣基質(zhì))陰性樣品和添加黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品后的色譜圖。結(jié)果如圖4～9所示，表明三種基質(zhì)中存在的物質(zhì)對本方法目標(biāo)檢測物質(zhì)沒有干擾。

圖4 二氧化硅基質(zhì)(陰性樣品)牙膏溶液譜圖

圖5 二氧化硅基質(zhì)(陰性樣品)牙膏加標(biāo)溶液譜圖(1：黃芩苷)

圖6 碳酸鈣基質(zhì)(陰性樣品)牙膏溶液譜圖

圖7 碳酸鈣基質(zhì)(陰性樣品)牙膏加標(biāo)溶液譜圖(1：黃芩苷)

圖8 磷酸氫鈣基質(zhì)(陰性樣品)牙膏溶液譜圖

圖9 磷酸氫鈣基質(zhì)(陰性樣品)牙膏加標(biāo)溶液譜圖(1：黃芩苷)

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

分別平行稱取三種不同基質(zhì)牙膏試樣6份，依照1.4步驟制備的供試品溶液，依前述色譜條件進(jìn)樣測定黃芩苷含量，結(jié)果見表2。6次進(jìn)樣測得三種不同基質(zhì)牙膏中黃芩苷含量平均值分別為799mg/kg、749mg/kg、780mg/kg，RSD分別為0.6%、2.2%、2.9%。結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

表2 三種基質(zhì)試樣重復(fù)性測定結(jié)果

2.6 中間精密度試驗(yàn)

由不同操作人員A、B，分別對同一批次牙膏試樣平行稱取樣品6份，依照1.4步驟制備供試品溶液，依前述色譜條件進(jìn)樣測定黃芩苷含量，結(jié)果見表3。測得牙膏試樣中黃芩苷含量平均值分別為749mg/kg和748mg/kg，RSD為1.9%。結(jié)果表明，該方法中間精密度良好。

表3 黃芩苷含量測定的中間精密度實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.7 準(zhǔn)確度(回收率)試驗(yàn)

分別平行稱取三種基質(zhì)(二氧化硅、碳酸鈣、磷酸氫鈣)牙膏試樣(陽性樣品)各9份，每份約0.5g(稱樣量減半)，共三組，分別定量加入黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加濃度水平為試樣本底含量的50%、100%、150%，按1.4步驟處理后進(jìn)行上機(jī)測定，結(jié)果見表4～6。從表中可看出，三種基質(zhì)牙膏試樣在不同加標(biāo)濃度下的平均加標(biāo)回收率為94.0%～97.9%，RSD為0.4%～2.4%。結(jié)果表明，本方法準(zhǔn)確可靠，精密度高。

表4 二氧化硅基質(zhì)牙膏試樣加標(biāo)回收率測定結(jié)果

表5 碳酸鈣基質(zhì)牙膏試樣加標(biāo)回收率測定結(jié)果

表6 磷酸氫鈣基質(zhì)牙膏試樣加標(biāo)回收率測定結(jié)果

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取牙膏試樣按1.4步驟制備供試品溶液，依前述的色譜條件在0h、6h、12h、18h、24h分別進(jìn)樣，測定黃芩苷含量，結(jié)果見表7。牙膏試樣中黃芩苷含量平均值為727mg/kg，RSD為0.9%，結(jié)果表明，在24小時(shí)內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

表7 放置時(shí)間對黃芩苷測試結(jié)果的影響

2.9 樣品測試

分別取5個(gè)不同批次天然本草類牙膏試樣，每批次平行取樣2份，依照1.4步驟制備供試品溶液，上機(jī)進(jìn)樣測定黃芩苷含量，結(jié)果分別見表8。

表8 天然本草類牙膏試樣中黃芩苷含量測定結(jié)果

3 討論

本研究根據(jù)黃芩苷的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)，對提取溶劑和提取方法進(jìn)行了系統(tǒng)考察，并結(jié)合牙膏試樣在水中分散效果較好的特點(diǎn)，通過實(shí)驗(yàn)最終選擇50%乙醇-水溶液作為提取溶劑，為了提高牙膏在提取溶劑中的分散效果，實(shí)驗(yàn)中加入了適量石英砂對牙膏進(jìn)行輔助分散。同時(shí)，考慮到黃芩苷在酸性條件下的化學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定，在提取溶劑中添加6%磷酸(體積分?jǐn)?shù))使碳酸鈣基質(zhì)牙膏溶解更充分，通過實(shí)驗(yàn)證明，能有效提升黃芩苷的提取效率。

經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，最終確定使用Agilent Eclipse Plus C18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫：0～2min(13%A)，2～18min(13%A->30%A)，18～25min(30%A)，25～28min(30%A->13%A)，28～30min(13%A)；流速1.0mL/min；柱溫：30℃；檢測波長277nm；進(jìn)樣量：10μL。結(jié)果表明，此方法條件下黃芩苷色譜峰形較理想，分離效果好，黃芩苷質(zhì)量濃度在1.0μg/mL～100.0μg/mL范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系(R2= 0.9999)，將該方法應(yīng)用于牙膏試樣的測定，其方法特異性、重復(fù)性、中間精密度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性良好。

本次實(shí)驗(yàn)針對不同基質(zhì)的牙膏試樣，利用高效液相色譜法(HPLC)建立了簡便、靈敏、準(zhǔn)確測定牙膏中黃芩苷的含量檢測方法，可作為天然本草類牙膏中黃芩苷含量的質(zhì)量控制方法，在牙膏產(chǎn)品安全質(zhì)量和應(yīng)用研究領(lǐng)域發(fā)揮作用，更好優(yōu)化研發(fā)產(chǎn)品，為消費(fèi)者提供值得信賴的數(shù)據(jù)支持。

參考文獻(xiàn)(略)