張明靜，龐彩紅，李際紅，李雙云，付茵茵，哈新英，夏陽

（1．山東省林業(yè)科學(xué)研究院/山東省林木遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黃河三角洲林木遺傳育種國家林草局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014；2．山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014；3．山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，山東 泰安 271018；4．濟(jì)南市城鄉(xiāng)建設(shè)發(fā)展中心，山東 濟(jì)南 250000）

國槐（Sophora japonica L．）為豆科（Leguminosae sp．）蝶形花亞科（Papilionoideae）槐屬（Sophora L．）落葉喬木，是我國北方重要的鄉(xiāng)土樹種和城市綠化樹種，具有較高的觀賞價(jià)值［1］；其速生性較強(qiáng)，材質(zhì)堅(jiān)硬，花、枝、果實(shí)等均可入藥［2］，也是良好的材用和藥用經(jīng)濟(jì)樹種。目前，國內(nèi)關(guān)于國槐的研究還主要集中在繁殖技術(shù)［3］、遺傳轉(zhuǎn)化［4］以及種子表型性狀的變異［5］等方面，針對(duì)其分子方面的研究開展較少，嚴(yán)重影響國槐種質(zhì)資源的創(chuàng)新和利用。

目前應(yīng)用于植物遺傳育種研究的分子標(biāo)記技術(shù)主要有AFLP、RAPD、RFLP、SSR、ISSR等。SSR（simple sequence repeat）即簡(jiǎn)單重復(fù)序列，又稱微衛(wèi)星。通常采用聚丙烯酰胺凝膠電泳或高濃度的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)SSR-PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果可以顯示出不同品種間重復(fù)次數(shù)帶來的差異性［6］。SSR標(biāo)記由于多態(tài)性高、數(shù)量豐富、在遺傳上呈共顯性、實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單、結(jié)果相對(duì)穩(wěn)定可靠等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于DNA指紋圖譜構(gòu)建［7，8］、分子輔助選擇［9］和遺傳多樣性分析［10］等研究中，是目前應(yīng)用比較廣泛的一種分子標(biāo)記技術(shù)。

本研究旨在利用單因素試驗(yàn)結(jié)合正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，建立一套適用于國槐SSR標(biāo)記的穩(wěn)定、可靠的PCR反應(yīng)體系，以期為利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)國槐進(jìn)行遺傳多樣性分析、指紋圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源鑒定等方面的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料與試劑

選用國槐種質(zhì)WF56、TA11、BZ26、DY17、ZB9、LY86、42、201、396，均為嫁接保存于山東省林業(yè)科學(xué)研究院飲馬泉苗圃及章丘實(shí)驗(yàn)基地的國槐古樹，具體源生地見表1。2016年春天，從國槐嫁接苗上采集嫩葉，清洗干凈，放入2 mL離心管中，編號(hào)，液氮迅速冷凍后放入-50℃冰箱備用。

植物基因組DNA提取試劑盒購自北京天根公司；DNA Marker、ExTaq酶、10×Taq Buffer、MgCl2、dNTPs、6×Loading Buffer等均購自寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）；冰乙酸、硝酸銀、無水乙醇購自天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。

表1 國槐種質(zhì)材料的源生地

利用高通量測(cè)序平臺(tái)Illumina HiSeq 2000進(jìn)行國槐轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，測(cè)得7 Gb數(shù)據(jù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)denovo組裝，共獲得68 846個(gè)uigene，使用SSR軟件MIcroSAtellite（MISA）尋找所有的SSR位點(diǎn)，對(duì)所有SSR重復(fù)單元在Unigene上前后序列的長(zhǎng)度進(jìn)行篩選，得到8 718條包含SSR位點(diǎn)的序列，共含有10 236個(gè)SSR位點(diǎn)，設(shè)計(jì)完成6 611條引物。從中選出226對(duì)引物由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司合成，每對(duì)引物5 OD，分裝兩管，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。?26對(duì)引物中隨機(jī)挑選5對(duì)引物（表2）用于本試驗(yàn)。

表2 選用的SSR-PCR引物及其序列

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 國槐基因組DNA的提取與檢測(cè) 采用植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取。利用0．8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的DNA質(zhì)量，使用分光光度計(jì)測(cè)定提取的DNA濃度，根據(jù)分光光度計(jì)測(cè)定的DNA原液濃度將樣品稀釋至所需濃度，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．2 PCR擴(kuò)增程序及產(chǎn)物檢測(cè) 采用Touchdown PCR擴(kuò)增，程序如下：94℃5 min；94℃15 s，66．5～57．0℃15 s（每循環(huán)降0．5℃），72℃30 s，19個(gè)循環(huán)；94℃15 s，57℃15 s，72℃30 s，15個(gè)循環(huán)；72℃10 min，4℃保存。擴(kuò)增后的產(chǎn)物利用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，銀染顯色，相機(jī)拍照保存。

1．2．3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系優(yōu)化 隨機(jī)挑選WF56國槐DNA為模板，利用2114引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，初始反應(yīng)體系（10μL）：5 U/μL ExTaq酶0．1μL，25 mmol/L Mg2+1．0μL，2．5 mmol/L dNTPs 0．4μL，10μmol/L引物0．2μL（上下游引物合計(jì)），70 ng/μL模板DNA 1．0μL，10×PCR Buffer 1．0μL，ddH2O補(bǔ)足到10μL。

采用單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法對(duì)SSR-PCR反應(yīng)體系中的Mg2+、引物、dNTPs、Ex-Taq酶、模板DNA用量五個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化。單因素試驗(yàn)中每個(gè)因素設(shè)置6個(gè)水平（表3），根據(jù)擴(kuò)增條帶清晰度確定各因素的適宜用量范圍；再根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選用合適的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表對(duì)5個(gè)因素的用量組合進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，以確定適合國槐的10μL SSR-PCR最佳反應(yīng)體系。

表3 國槐SSR-PCR反應(yīng)體系單因素試驗(yàn)因素及水平

1．2．4 PCR優(yōu)化體系的驗(yàn)證 隨機(jī)挑選出8個(gè)國槐種質(zhì)和4對(duì)SSR引物，利用篩選出的最佳反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的分析對(duì)PCR反應(yīng)體系進(jìn)行有效驗(yàn)證。如果擴(kuò)增出的條帶清晰、穩(wěn)定，則表明試驗(yàn)確定的反應(yīng)體系適宜國槐SSR-PCR反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2．1 國槐DNA提取質(zhì)量檢測(cè)

經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，提取的國槐基因組DNA的OD260/OD280值在1．7～2．0之間；經(jīng)0．8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖1），條帶清晰完整且無明顯的拖尾。說明提取的DNA樣品濃度和純度較高，足以滿足后續(xù)試驗(yàn)的要求。

M為DL15000 DNAMarker；1～9分別代表國槐種質(zhì)WF56、TA11、BZ26、DY17、ZB9、LY86、42、201、396的基因組DNA。

2．2 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2．2．1 Mg2+用量對(duì)國槐SSR-PCR反應(yīng)的影響

在PCR反應(yīng)體系中，Mg2+與dNTPs相互作用影響酶的活性，進(jìn)而影響PCR擴(kuò)增效果［11］。Mg2+濃度過高會(huì)降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過低則可能使PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量減少甚至擴(kuò)增不出條帶［12］。如圖2所示，Mg2+用量為0．2μL時(shí)未擴(kuò)增出條帶，用量為0．5μL時(shí)擴(kuò)增出的條帶較弱；用量為1．0～2．5μL時(shí)均擴(kuò)增出清晰條帶，但隨著Mg2+用量的增加，條帶的背景也呈逐漸加深趨勢(shì)。綜合考慮，Mg2+用量1．0μL較為適宜，擴(kuò)增出的條帶清晰且無明顯背景?；诖?，選擇0．5～2．0μL的Mg2+用量用于后續(xù)正交試驗(yàn)分析。

2．2．2 引物用量對(duì)國槐SSR-PCR反應(yīng)的影響

M指DL500 DNA Marker；1～6分別指25 mmol/L Mg2+用量為0．2、0．5、1．0、1．5、2．0、2．5μL。

引物濃度是影響PCR擴(kuò)增結(jié)果的重要因素，濃度較低時(shí)很難進(jìn)行有效擴(kuò)增，往往擴(kuò)增不出目的條帶，而濃度過高則很容易引起錯(cuò)配或擴(kuò)增出很多非特異性條帶［11］。由圖3可以看出，當(dāng)引物用量在0．2μL時(shí)，擴(kuò)增條帶較弱，當(dāng)引物用量達(dá)0．5 μL時(shí)，條帶明顯清晰，隨著引物濃度的不斷增加，條帶的清晰度不斷增加，但也逐漸出現(xiàn)彌散現(xiàn)象。因而用量最少且又?jǐn)U增出清晰條帶的0．5μL為引物適用量，并選擇引物0．2～1．5μL用量范圍用于正交試驗(yàn)分析。

M指DL500 DNA Marker；1～6分別指10μmol/L引物用量為0．2、0．5、1．0、1．5、2．0、2．5μL。

2．2．3 dNTPs用量對(duì)國槐SSR-PCR反應(yīng)的影響 dNTPs的濃度與PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，濃度過低，PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量減少，擴(kuò)增出的條帶不清晰；濃度過高，則會(huì)與Mg2+結(jié)合，降低游離Mg2+濃度，從而使酶的聚合效率降低，影響擴(kuò)增結(jié)果［13］。由圖4可知，當(dāng)dNTPs用量在0．1μL時(shí)，擴(kuò)增出的條帶較弱，從0．2μL開始均擴(kuò)增出清晰條帶，且之后變化不大，因而0．2μL為較佳的dNTPs用量，選擇0．2～0．8μL dNTPs用于正交試驗(yàn)分析。

M指DL500 DNA Marker；1～6分別指2．5 mmol/L dNTPs用量為0．1、0．2、0．4、0．6、0．8、1．0μL。

2．2．4 ExTaq酶用量對(duì)國槐SSR-PCR反應(yīng)的影響 ExTaq酶是PCR反應(yīng)的關(guān)鍵，但濃度較高時(shí)會(huì)使非特異性產(chǎn)物增加，而濃度較低時(shí)則會(huì)使擴(kuò)增量不足，擴(kuò)增出的條帶較弱［11］。由圖5可以看出，ExTaq酶用量在0．01、0．02μL擴(kuò)增出的條帶微弱，用量繼續(xù)增加，條帶逐漸清晰，但同時(shí)背景也在逐漸加深。綜合考慮，可以選擇擴(kuò)增條帶清晰且無明顯背景的0．05μL作為適宜的ExTaq酶用量。基于此，選擇0．02～0．15μL ExTaq酶設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。

M指DL500 DNA Marker；1～6分別指5 U/μL ExTaq酶用量為0．01、0．02、0．05、0．10、0．15、0．20μL。

2．2．5 模板DNA用量對(duì)SSR-PCR反應(yīng)體系的影響 如圖6所示，模板DNA用量為5 ng和15 ng時(shí)，擴(kuò)增出的條帶極其微弱；當(dāng)用量增加到30 ng時(shí)，能擴(kuò)增出清晰的條帶；用量為50、70 ng時(shí)，條帶清晰度相對(duì)于30 ng時(shí)有所增加，但無較大區(qū)別；當(dāng)用量增加到90 ng時(shí)，條帶出現(xiàn)較弱的虛化現(xiàn)象。因而模板DNA用量為30 ng時(shí)較為適宜，在此基礎(chǔ)上選擇15～70 ng模板DNA用于后續(xù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

M指DL500 DNA Marker；1～6分別指模板DNA用量為5、15、30、50、70、90 ng。

2．3 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)選擇的各因素用量范圍，設(shè)計(jì)5因素4水平正交試驗(yàn)，選用L16（45）正交表設(shè)計(jì)因素組合（表4），然后利用引物2114對(duì)國槐WF56進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

電泳結(jié)果（圖7）顯示，不同因素組合的PCR擴(kuò)增結(jié)果存在較大差異，其中，組合1、2、12未擴(kuò)增出條帶，組合3、4擴(kuò)增出的條帶較弱，其余組合均擴(kuò)增出清晰的條帶。

M為DL500 DNA Marker；1～16指正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的16個(gè)處理組合。

依據(jù)擴(kuò)增出的特異條帶清晰度并結(jié)合背景深淺進(jìn)行打分，條帶最清晰且無明顯背景的打16分，以此類推，得到16個(gè)組合的分值依次為3、3、4、5、7、16、14、13、9、15、10、3、6、8、11、12，然后對(duì)同一因素相同水平下的分值平均值Xi（i＝1，2，3，4，表示4個(gè)不同水平）以及各因素的極差R進(jìn)行計(jì)算［14］，結(jié)果（表4）顯示，Mg2+用量對(duì)SSRPCR反應(yīng)體系的影響最大，其次為引物和dNTPs，ExTaq 酶 和 模 板 DNA 影 響 較 小；組 合A2B2C1D4E1，即Mg2+用量1．0μL、引物用量0．5 μL、dNTPs用量0．2μL、ExTaq酶用量0．15μL、模板DNA用量15 ng時(shí)PCR擴(kuò)增效果最好。

但由于ExTaq酶和模板DNA對(duì)SSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響相對(duì)較小，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，綜合考慮。最終確定含有Mg2+1．0μL、引物0．5 μL、dNTPs 0．2μL、ExTaq酶0．05μL、模板DNA 30 ng的PCR反應(yīng)體系（10μL）最優(yōu)。

2．4 優(yōu)化反應(yīng)體系的驗(yàn)證

利用8個(gè)國槐種質(zhì)TA11、BZ26、DY17、ZB9、LY86、42、201、396和4對(duì)引物1302、1970、2541、3049對(duì)試驗(yàn)獲得的最佳反應(yīng)體系進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果（圖8）顯示，每對(duì)引物均擴(kuò)增出清晰穩(wěn)定的條帶，其中引物1302和3049擴(kuò)增出了多樣性條帶。表明上述試驗(yàn)確定的反應(yīng)體系穩(wěn)定、可靠，可用于國槐SSR標(biāo)記開發(fā)及遺傳多樣性分析和指紋圖譜構(gòu)建等研究中。

表4 國槐SSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化的L16（45）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及直觀分析結(jié)果

M指DL500 DNA Marker；1～8分別代表國槐種質(zhì)TA11、BZ26、DY17、ZB9、LY86、42、201、396。

3 討論與結(jié)論

PCR擴(kuò)增是SSR分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)的重要環(huán)節(jié)，可靠的PCR反應(yīng)體系是開發(fā)和利用SSR標(biāo)記的基礎(chǔ)［15］。優(yōu)化PCR反應(yīng)體系，篩選最優(yōu)因素組合，可以有效降低非特異性擴(kuò)增，提高PCR擴(kuò)增效率［16］。

單因素試驗(yàn)結(jié)合正交試驗(yàn)的方法能用較少的試驗(yàn)處理獲得較好的試驗(yàn)結(jié)果，大大減少工作量。如利用該方法，宋偉栓［17］確立了適用于國槐SRAP的PCR反應(yīng)體系，王健兵等［18］優(yōu)化了白蠟SSR-PCR反應(yīng)體系，趙克奇等［14］建立了適用于刺槐EST-SSR標(biāo)記的PCR反應(yīng)體系。

本研究利用單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法對(duì)國槐SSR-PCR反應(yīng)體系中的Mg2+、dNTPs、引物、ExTaq酶、模板DNA用量進(jìn)行了優(yōu)化，最終得到最佳反應(yīng)體系（10μL）：25 mmol/L Mg2+1．0μL，2．5 mmol/L dNTPs 0．2μL，10μmol/L上下游引物共0．5μL，5 U/μL ExTaq酶0．05μL，30 ng/μL DNA模板1．0μL，10×PCR Buffer 1．0μL，ddH2O 6．25μL。并選用4對(duì)引物、8個(gè)國槐種質(zhì)對(duì)該P(yáng)CR反應(yīng)體系的擴(kuò)增效果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明在該反應(yīng)體系下均能擴(kuò)增出清晰、穩(wěn)定的多態(tài)性條帶。本試驗(yàn)結(jié)果為利用SSR標(biāo)記深入研究國槐種質(zhì)資源奠定了基礎(chǔ)。