亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        利用HRM標記檢測山東省稻瘟病菌群體的交配型分布

        2022-06-13 09:43:04房文文姜艷芳王海鳳郭濤薛芳張煥霞張士永
        山東農(nóng)業(yè)科學 2022年5期
        關鍵詞:交配稻瘟病真菌

        房文文,姜艷芳,王海鳳,郭濤,薛芳,張煥霞,張士永

        (山東省農(nóng)業(yè)科學院濕地農(nóng)業(yè)與生態(tài)研究所/山東省水稻工程技術研究中心,山東 濟南 250100)

        由稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)引起的稻瘟病是水稻上的重要病害,危害性大、流行速度快,流行年份可造成嚴重減產(chǎn)[1]。山東省為黃淮海地區(qū)水稻主產(chǎn)區(qū),以粳稻為主,年均種植面積達13萬公頃。2014年臨沂、日照稻區(qū)發(fā)生稻瘟病,損失嚴重[2,3]。目前生產(chǎn)上防治稻瘟病經(jīng)濟有效的措施是種植抗病品種[4],但由于田間稻瘟病菌小種類型多樣,易發(fā)生變異[5],導致一些抗病水稻品種連續(xù)種植3~5年后抗性喪失,田間表現(xiàn)為感?。?,7],造成減產(chǎn)。

        高分辨率熔解曲線(high resolution melting,HRM)技術是一種新興的基因分型方法,能夠區(qū)分SNP、SSR及Indel等不同變異[8]。此技術無需凝膠電泳,減少了污染;PCR擴增后僅需8~10 min便可以讀取96個樣品數(shù)據(jù),真正實現(xiàn)了快速高通量檢測[9]。目前在稻瘟病菌無毒基因pex31(Avr-Pik/kp/km)檢測中已有應用[10]。

        有性生殖是真菌的一種生殖方式,分為同宗配合和異宗配合。同宗配合真菌通常具有一個交配型基因座,而異宗配合真菌有一對交配型基因座[11]。異宗配合真菌必須由不同交配型的菌絲細胞結合后才能產(chǎn)生子代。稻瘟病菌屬子囊菌廣大角間座殼屬的異宗配合真菌,具有MAT1-1和MAT1-2兩種交配型[12],只有兩個不同交配型的菌株對峙培養(yǎng)才能誘導產(chǎn)生有性態(tài)[13]。目前在自然條件下還沒有發(fā)現(xiàn)稻瘟病菌的有性生殖,在實驗室研究有性生殖較多[14]。MAT交配型基因控制稻瘟病菌等真菌的“性別”,對真菌的遺傳進化起著決定性作用。研究稻瘟病菌有性態(tài),有利于解析稻瘟病菌群體遺傳多樣性,并為群體變異、交配識別等提供理論基礎,同時可以獲得可育性菌株,為新的無毒基因的研究提供材料。

        國內外有關稻瘟病菌有性生殖的研究工作已有大量報道。印度稻瘟病菌存在MAT1-1和MAT1-2兩種交配型[11],美國稻瘟病菌僅存在MAT1-1交配型[15],泰國稻瘟病菌僅存在MAT1-2交配型[16]。我國廣東省稻瘟病菌交配型MAT1-2占優(yōu)勢[17],寧夏稻瘟病菌都是MAT1-1交配型[14],黑龍江省稻瘟病菌存在MAT1-1和MAT1-2兩種交配型,以交配型MAT1-1占優(yōu)勢[18]。迄今未見關于山東省稻瘟病菌株有性態(tài)研究報道。因此本研究連續(xù)5年收集山東稻區(qū)的稻瘟病菌群體,基于高分辨率熔解曲線技術測定菌株群體的交配型,明確交配型在不同稻區(qū)的分布及年份間的動態(tài)變化趨勢,以期為解析稻瘟病菌有性態(tài)及遺傳多樣性提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        供試菌株:標準菌株S1528和P131,交配型分別為MAT1-1和MAT1-2[19],均由中國農(nóng)業(yè)大學彭友良教授課題組贈予。于2016—2020年從山東省濟南、濟寧、臨沂、日照、濱州及東營6市水稻產(chǎn)區(qū)采集稻瘟病樣。

        供試培養(yǎng)基:水瓊脂培養(yǎng)基(20 g瓊脂粉溶于1 L蒸餾水,分裝至三角瓶,121℃濕熱滅菌20 min);番茄燕麥培養(yǎng)基(30~40 g燕麥片、20 g瓊脂粉、150 mL番茄汁、850 mL蒸餾水,分裝至三角瓶,121℃濕熱滅菌20 min)。

        試劑及儀器:鹽酸四環(huán)素、氨芐青霉素鈉、硫磺卡那霉素、次氯酸鈉溶液、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB),購于生工生物工程(上海)股份有限公司;PCR試劑,北京全式金生物技術(TransGen Biotech)有限公司;EvaGreen qPCR核酸染料,美國Biotium公司。血球計數(shù)板(XB-K-25),上海XB-K-25求精生化試劑儀器有限公司;Optika B-383PLi顯微鏡,意大利M.A.D.公司;Nikon D90相機,尼康光學儀器(中國)有限公司;SPX智能型生化培養(yǎng)箱、RXZ-500C-LED人工氣候培養(yǎng)箱,寧波江南儀器廠;BCD-290W 型立式冰箱,青島海爾股份有限公司;羅氏LightCycler?96實時熒光定量PCR儀,Roche公司。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 稻瘟病樣本采集及病菌分離、培養(yǎng) 在山東省濟南、濟寧、臨沂、日照、濱州、東營6市代表性地區(qū)和多年稻瘟病重發(fā)區(qū)采集典型稻瘟病樣本。挑選單個典型病斑剪成約5 mm大小于次氯酸鈉消毒2.5 min,無菌水沖洗干凈后平鋪至水瓊脂平板上。顯微鏡下將分生孢子稀釋至1個視野下2~3個孢子,轉移至新的水瓊脂平板上。待分生孢子萌發(fā)后,鏡檢挑取單個孢子放至番茄燕麥培養(yǎng)基培養(yǎng),2~3 d得到單孢菌落。將單孢菌株純化后,選菌落邊緣菌絲點接至鋪滿濾紙片的番茄燕麥培養(yǎng)基上,培養(yǎng)5~7 d后將濾紙片揭下放入硫酸紙袋內,干燥完全后-20℃保存。將待活化菌株的濾紙片點接到番茄燕麥培養(yǎng)基上,28℃光照培養(yǎng),5~7 d后取菌絲[20]。

        1.2.2 稻瘟病菌交配型分析 采用CTAB法提取稻瘟病菌基因組DNA。參照稻瘟病菌交配型基因序列[19]設計兩對引物[生工生物工程(上海)股份有限公司合成,表1]進行PCR擴增。反應體系(10μL):2×EasyTaq?PCR SuperMix 5μL、DNA 3 μL、正反向引物各0.2μL(0.1 mmol/L)、20×Evagreen 0.125μL、ddH2O 1.475μL。擴增程序:94℃預變性3 min;94℃變性10 s,60℃退火30 s,72℃延伸20 s,共40個循環(huán);72℃延伸10 min,4℃保存。熔解曲線分析程序為:95℃變性15 s;60℃退火15 s;以0.07℃/s的速率升溫,10次/℃采集熒光信號,至90℃保持1 s。采用軟件Light Cycler 96進行熔解曲線分析。

        表1 稻瘟病菌交配型基因的引物序列

        為了解山東省稻瘟病菌群體交配型,對不同地區(qū)間及不同年份間稻瘟病菌交配型多樣性分布進行分析[18]。H=N/(N-1)×(1-ΣXi2),式中,H為多樣性指數(shù),N為群體總菌株數(shù),Xi為某交配型在其群體中的出現(xiàn)頻率。采用Microsoft Excel進行數(shù)據(jù)處理。

        2 結果與分析

        2.1 山東省稻瘟病菌的交配型

        本試驗共分離到稻瘟病菌株415株(表2)。利用兩對特異性引物檢測稻瘟病菌交配型,對照標準菌株得到的熔解曲線,根據(jù)擴增產(chǎn)物雙鏈突變位點的退火溫度(Tm值)不同區(qū)分不同的基因型,結果(圖1)表明,當熔解溫度為78~80℃時,稻瘟病菌為MAT1-1交配型;當熔解溫度為82~84℃時,稻瘟病菌為MAT1-2交配型。熔解曲線檢測結果顯示,山東省稻瘟病菌交配型分布不均衡:415株稻瘟病菌株中交配型為MAT1-1的菌株有12株,出現(xiàn)頻率為2.89%;交配型為MAT1-2的菌株有329株,出現(xiàn)頻率為79.28%;雙交配型的菌株有4株,出現(xiàn)頻率為0.96%;未檢測出交配型的菌株有70株,出現(xiàn)頻率為16.87%。

        表2 本研究分離稻瘟病菌情況

        橙色曲線代表MAT1-1交配型,綠色曲線代表MAT1-2交配型。

        2.2 不同年份間稻瘟病菌的交配型

        由表3可知,2016年供試菌株總計45株,交配型為MAT1-2的菌株有33株,出現(xiàn)頻率為73.33%;未檢測出交配型的菌株有10株,出現(xiàn)頻率為22.22%;交配型為MAT1-1的菌株有2株,出現(xiàn)頻率為4.44%;不存在雙交配型的菌株。2017年供試菌株總計63株,交配型為MAT1-2的菌株有52株,出現(xiàn)頻率為82.54%;交配型為MAT1-1的菌株有6株,出現(xiàn)頻率為9.52%;未檢測出交配型的菌株有5株,出現(xiàn)頻率為7.94%;不存在雙交配型的菌株。2018年供試菌株總計108株,交配型為MAT1-2的菌株有71株,出現(xiàn)頻率為65.74%;未檢測出交配型的菌株有32株,出現(xiàn)頻率為29.63%;交配型為MAT1-1的菌株有4株,出現(xiàn)頻率為3.70%;雙交配型的菌株有1株,出現(xiàn)頻率為0.93%。2019年供試菌株總計91株,交配型為MAT1-2的菌株有66株,出現(xiàn)頻率為72.53%;未檢測出交配型的菌株有22株,出現(xiàn)頻率為24.18%;不存在MAT1-1的菌株;雙交配型的菌株有3株,出現(xiàn)頻率為3.30%。2020年供試菌株總計108株,交配型為MAT1-2的菌株有107株,出現(xiàn)頻率為99.07%;未檢測出交配型的菌株有1株,出現(xiàn)頻率為0.93%;不存在交配型為MAT1-1和雙交配型菌株。

        2016年山東省稻瘟病菌群體交配型多樣性指數(shù)為0.471,2017年為0.315,2018年為0.572,2019年為0.478,2020年為0.019。表明2018年稻瘟病菌群體多態(tài)性最高,2020年稻瘟病菌群體多態(tài)性最低。

        表3 2016—2020年山東省稻瘟病菌株交配型測定結果 (株,%)

        2.3 各地區(qū)稻瘟病菌的交配型

        對供試菌株的交配型按照地區(qū)進行分析,結果(表4)表明,魯北地區(qū)稻瘟病菌群體中MAT1-2、未檢測出交配型、雙交配型菌株的出現(xiàn)頻率分別為87.40%、11.81%、0.79%,不存在MAT1-1交配型菌株;魯中地區(qū)稻瘟病菌群體中MAT1-2、未檢測出交配型、MAT1-1、雙交配型菌株的出現(xiàn)頻率分別為79.67%、17.07%、2.44%、0.81%;魯南地區(qū)稻瘟病菌群體中MAT1-2、未檢測出交配型、MAT1-1、雙交配型菌株的出現(xiàn)頻率分別為72.73%、20.61%、5.45%、1.21%。

        對供試菌株群體交配型進行多樣性指數(shù)分析,發(fā)現(xiàn)山東省供試稻瘟病菌群體交配型多樣性指數(shù)為0.371。魯北、魯中及魯南地區(qū)稻瘟病菌群體交配型多樣性指數(shù)分別為0.238、0.368、0.471,表明魯南地區(qū)稻瘟病菌群體的多態(tài)性比北部和中部地區(qū)高。

        表4 山東省不同地區(qū)稻瘟病菌交配型測定結果 (株,%)

        3 討論與結論

        目前常規(guī)檢測交配型的方法主要是PCR擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,該方法效率較低,難以實現(xiàn)批量化檢測。本試驗采用高分辨率熔解曲線(HRM)技術測定稻瘟病菌群體交配型,可快速、準確區(qū)分交配型基因分型,顯著縮短檢測所需時間,能夠實現(xiàn)大批量稻瘟病菌交配型的快速檢測。本試驗方法可用于異宗配合的子囊真菌交配型的檢測,有利于在絲狀真菌交配型檢測領域推廣應用,對研究真菌遺傳變異具有重大意義。

        本研究發(fā)現(xiàn)山東省水稻種植區(qū)的稻瘟病菌群體中存在MAT1-1和MAT1-2兩種交配型,且以交配型MAT1-2占優(yōu)勢,出現(xiàn)頻率為79.28%,交配型MAT1-1出現(xiàn)頻率僅為2.89%。已有研究結果[14-18]也表明,不同地區(qū)的稻瘟病菌交配型分布存在差異。在自然條件下山東省稻瘟病菌很難發(fā)生有性生殖,是否存在有性生殖還需進一步研究驗證。

        盡管基于PCR-HRM方法測定了山東稻瘟病菌群體的交配型,但是不能檢測菌株的育性,后續(xù)將通過對峙培養(yǎng)檢測育性,并與PCR方法檢測交配型結果進行結合,從而使結論更加準確。

        致謝:中國農(nóng)業(yè)大學彭友良教授、趙文生教授、楊俊教授贈予標準菌株P131和S1528,特此致謝!

        猜你喜歡
        交配稻瘟病真菌
        基于Meta-QTL和RNA-seq的整合分析挖掘水稻抗稻瘟病候選基因
        作物學報(2022年6期)2022-04-08 01:26:44
        不同交配方式對家蠶種性影響
        高等大型真菌與人類
        科學(2020年2期)2020-08-24 07:56:56
        二化螟的多次交配及其對雌蛾產(chǎn)卵量的影響
        昆蟲學報(2020年6期)2020-08-06 06:42:52
        真菌造房子
        不同藥劑防治苗稻瘟病、葉稻瘟病效果試驗研究
        生物綠肥在稻瘟病防治中的應用與示范
        當自由交配遇上自由組合的幾種解法淺析
        中學生物學(2016年8期)2016-01-18 09:08:26
        黑龍江省發(fā)現(xiàn)馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)A2交配型
        中國馬鈴薯(2015年3期)2015-12-19 08:03:56
        艾滋病合并侵襲性真菌感染的診治
        论理视频二区三区四区在线观看 | 精品久久精品久久精品| 亚洲精品一区三区三区在线 | 国产精品自拍午夜伦理福利| 扒开美女内裤舔出白水| 国产精品久久久久免费观看| 国产精品久久久久9999赢消| 性一交一乱一伦| 亚洲v日本v欧美v综合v| 一本色道久久综合亚洲精品蜜臀| 久久亚洲免费精品视频| 疯狂做受xxxx高潮视频免费| 国产精品午夜爆乳美女视频| 老男人久久青草AV高清| 日韩精品中文字幕人妻中出| 日韩av一区二区观看| 亚洲日产一线二线三线精华液| 中文字幕精品亚洲人成| 欧美性xxx久久| 国产诱惑人的视频在线观看| 午夜少妇高潮在线观看| 亚洲午夜福利在线视频| 亚洲产在线精品亚洲第一站一| av永远在线免费观看| 国产桃色一区二区三区| 国产成人a人亚洲精品无码| 国产精品九九九无码喷水| 日本视频一区二区三区三州| 欧美性生交大片免费看app麻豆| 无码人妻丰满熟妇啪啪网站| 婷婷色中文字幕综合在线| 妞干网中文字幕| 亚洲中文字幕诱惑第一页| 精品一区二区三区人妻久久福利 | 免费一区二区三区久久| 日本一区二区三区小视频| 亚洲免费一区二区三区四区| 影音先锋男人av鲁色资源网| 国产欧美一区二区精品仙草咪| 蜜桃在线播放免费一区二区三区| 精选二区在线观看视频|