武傳香，薛霞，盧蘭香，魏莉莉，丁一，劉艷明*

1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院（濟(jì)南 250101）；2.山東省食品藥品安全檢測(cè)工程技術(shù)研究中心（濟(jì)南 250101）；3.山東省特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心（濟(jì)南 250101）

雞蛋作為生活中必不可缺的食品，因其具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值一直深受廣大消費(fèi)者的喜愛[1-2]。目前市場(chǎng)上雞蛋種類繁多，如山雞蛋、草雞蛋、洋雞蛋，烏雞蛋，土雞蛋等，各類雞蛋的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值成為了評(píng)定其價(jià)格高低的重要指標(biāo)[3-4]。2019年的3·15晚會(huì)指出，標(biāo)稱土雞蛋、柴雞蛋、笨雞蛋的價(jià)格比普通散裝雞蛋（洋雞蛋）高出不少，有的甚至高出一兩倍，但對(duì)其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的高低缺乏評(píng)價(jià)。其中維生素B1（VB1）作為雞蛋中重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[5-10]，研究雞蛋中維生素B1的含量對(duì)評(píng)價(jià)各類雞蛋中營(yíng)養(yǎng)價(jià)值是否存在差異具有重要的理論價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。維生素B1（VB1），又稱硫胺素或抗神經(jīng)炎維生素，化學(xué)式C12H16N4OS（HCl），是由嘧啶環(huán)和噻唑環(huán)結(jié)合而成的一種B族維生素。VB1具有維持人體正常代謝和生長(zhǎng)發(fā)育的作用，是人體不可或缺的營(yíng)養(yǎng)元素[11-13]，成人每天需攝入1～2 mg。VB1在食物中有三種形式[14]，即游離形式、硫胺素焦磷酸脂和蛋白磷酸復(fù)合物。

目前，VB1的測(cè)定方法主要包括熒光分光光度計(jì)法[15-16]、微生物法、高效液相色譜法（HLPC）[17-25]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HLPC-MS）[26-27]等。熒光分光光度計(jì)法耗時(shí)、費(fèi)力，已難以滿足當(dāng)前分析要求和發(fā)展趨勢(shì)[15]，不適用于檢測(cè)更微量的樣品[16]。微生物法和液相色譜法比較常用，雖然微生物法檢測(cè)成本低，具有較高的靈敏度和精確度，但步驟繁瑣、檢測(cè)周期長(zhǎng)、重復(fù)性差，不適用于在較短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)大量樣品[28]?；趯?shí)驗(yàn)室一般條件，HLPC-MS起點(diǎn)較高，所以本研究采取高效液相色譜法進(jìn)行雞蛋樣品檢測(cè)。目前不同基質(zhì)中VB1前處理方法有沉淀蛋白法和GB 5009.84—2016（第一法）中樣品酸解和酶解的方法。雞蛋含有大量的維生素、礦物質(zhì)和蛋白質(zhì)，基質(zhì)復(fù)雜，目前有必要優(yōu)化樣品前處理方法，建立一個(gè)快速、靈敏、準(zhǔn)確的雞蛋中VB1的檢測(cè)方法。試驗(yàn)采用高效液相色譜-熒光法對(duì)從市場(chǎng)上采集的不同品牌的60個(gè)雞蛋中VB1進(jìn)行測(cè)定。通過優(yōu)化樣品前處理及色譜條件，建立一種高效、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，分析了市售不同品種雞蛋中的VB1的含量差異，取得了較好的效果，提高了檢測(cè)效率和結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 試驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

硫胺素鹽酸鹽（純度≥98.6%，Bepure）；甲醇、乙腈（色譜純，德國(guó)Merck公司）；無水乙醇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)有限公司）；正丁醇（優(yōu)級(jí)純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；木瓜蛋白酶（酶活力≥6 000 U/mg，國(guó)藥集團(tuán)有限公司）；alpha-淀粉酶（酶活力≥1 500 U/g，美國(guó)Sigma公司）；試驗(yàn)用水為超純水；其他試劑均為分析純。雞蛋均購(gòu)自山東省各大超市。方法優(yōu)化采用的雞蛋經(jīng)GB 5009.84—2016（第一法）測(cè)定結(jié)果為1.125 mg/kg。

Agilent 1260高效液相色譜儀配備熒光檢測(cè)器（美國(guó)安捷倫公司）；pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；Milli-Q超純水制備器（美國(guó)Millipore公司）；AB-204S型電子天平（瑞士mettler Toledo公司）；SB-800DTD數(shù)控超聲波清洗器（中國(guó)寧波新芝生物科技有限公司）；MS3渦旋混合器（德國(guó)IKA公司）；GM-300型粉碎機(jī)（德國(guó)萊馳公司）。

1.2 液相儀器條件

色譜柱：Xbridge C18（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相：0.01 mol/L乙酸鈉溶液-甲醇（80∶20）；熒光檢測(cè)器：激發(fā)波長(zhǎng)375 nm，發(fā)射波長(zhǎng)435 nm；流速：0.7 mL/min；進(jìn)樣體積：20 μL；柱溫：35 ℃。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（500 μg/mL）：準(zhǔn)確稱取5.00 mg的硫胺素鹽酸鹽于10 mL容量瓶中，用0.01 mol/L的鹽酸溶液溶解并定容至容量瓶刻度。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用水逐級(jí)稀釋為1.0，10.0，50.0，100.0和500.0 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 樣品處理

1.4.1 提取方式

VB1在食物中有三種形式[14]，即游離形式、硫胺素焦磷酸脂和蛋白磷酸復(fù)合物，結(jié)合態(tài)VB1必須采用酸解或酶解得到游離態(tài)，游離態(tài)可以直接沉淀蛋白后測(cè)定，因此試驗(yàn)分別考察了沉淀蛋白法、酶解、酸解及其組合模式對(duì)雞蛋中VB1的提取效果（圖1和圖2）。

1) 酶解法：稱取5 g粉碎均勻的雞蛋液體于100 mL錐形瓶中，加入適量溫水溶解混勻后，加入0.5 g淀粉酶和0.5 g木瓜蛋白酶，在55 ℃條件下酶解30 min后冷卻至室溫，用2.0 mol/L乙酸鈉溶液調(diào)pH至4.0±0.2。

2) 酸解法：稱取5 g粉碎均勻的雞蛋液體于100 mL錐形瓶中，加60 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液，充分搖勻，塞上塞子，在120 ℃條件下酸解20 min，冷卻至室溫后取出，用2.0 mol/L乙酸鈉溶液調(diào)pH至4.0加減0.2。

3) 酸解酶解法：樣品經(jīng)與（2）相同的方式酸解后，加入3 mL蛋白酶-淀粉酶混合液（分別稱取1.27 g淀粉酶和1.76 g木瓜蛋白酶，加水定容至50 mL，混勻），在37 ℃條件下酶解16 h后，冷卻至室溫。

4) 沉淀蛋白法：稱取5 g粉碎均勻的雞蛋液體于100 mL錐形瓶中，加入適量溫水溶解混勻后，選擇4種不同的沉淀蛋白法（乙酸鋅-亞鐵氰化鉀沉淀法、5%三氯乙酸沉淀法、甲醇沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法）進(jìn)行沉淀，然后調(diào)節(jié)試樣溶液的pH至4.0±0.2。

以上四種處理方式后，試樣溶液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用水沖洗錐形瓶，洗液合并于容量瓶中，并用水定容至刻度，搖勻后經(jīng)濾紙過濾，濾液待衍生。

1.4.2 衍生

樣品衍生：準(zhǔn)確移取上述濾液5 mL于50 mL離心管中，加入3 mL堿性鐵氰化鉀溶液，渦旋混勻后，準(zhǔn)確加入5 mL正丁醇，渦旋混勻1.5 min后離心，吸取正丁醇相（上層）經(jīng)0.45 μm有機(jī)微孔濾膜過濾后，供液相色譜儀分析用。

標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生：步驟與樣品衍生相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方式的選擇

1.4.1 小節(jié)中采用四種不同的樣品提取方法，測(cè)得雞蛋不同提取方法中的VB1含量和回收率分別見圖1和圖2，樣品加標(biāo)水平為1.00 mg/kg。結(jié)果顯示（圖1和圖2），亞鐵氰化鉀-乙酸鋅沉淀法測(cè)定的雞蛋中的VB1明顯偏低，且回收率低于10%，原因可能是雞蛋中部分VB1被這種沉淀法一起包裹沉淀；除亞鐵氰化鉀-乙酸鋅沉淀法外，其他三種沉淀蛋白法測(cè)得的雞蛋中VB1含量和回收率均低于其他三種樣品提取法（酶解、酸解及其組合模式）；只有酸解法和酸解+酶解法的濾液澄清，衍生后分層明顯，無乳化現(xiàn)象，其他幾種提取方法均出現(xiàn)不同程度的乳化現(xiàn)象，原因可能是高溫酸解不僅可以水解蛋白，還有沉淀蛋白等凈化作用。酸解法和酸解+酶解法都經(jīng)過了高溫酸解，因此濾液澄清，結(jié)果無差異。考慮到酸解+酶解法，不僅增加檢驗(yàn)成本，而且增加了檢驗(yàn)周期，所以選擇酸解的提取方式。

圖1 不同提取方式對(duì)雞蛋中VB1含量的影響

圖2 不同提取方式對(duì)雞蛋中VB1回收率的影響

2.2 提取條件的優(yōu)化

2.2.1 鹽酸濃度的優(yōu)化

考察了HCl不同濃度（0.01，0.05，0.1，0.2，0.3和0.5 mol/L）對(duì)雞蛋樣品中VB1的提取效果。結(jié)果顯示，不同濃度的HCl對(duì)VB1的提取效果差異不大，當(dāng)濃度為0.1 mol/L時(shí)，測(cè)得雞蛋中VB1的含量最高，所以選擇HCl濃度為0.1 mol/L。

2.2.2 酸解溫度的優(yōu)化

考察了溫度為30，60，90，120，150和180 ℃對(duì)VB1提取效率的影響。研究發(fā)現(xiàn)，不同溫度對(duì)VB1的提取效果差異不大，當(dāng)溫度低于120 ℃時(shí)，樣品酸解溶液渾濁難以過濾，且衍生后有嚴(yán)重的白色乳化現(xiàn)象。鑒于試驗(yàn)安全，所以選擇最佳酸解溫度為120 ℃。

2.2.3 酸解時(shí)間的優(yōu)化

酸解時(shí)間是影響VB1提取的重要因素之一，分別考察了酸解時(shí)間為10，20，30，40，50和60 min對(duì)提取效果的影響（圖3）。結(jié)果表明，40 min內(nèi)，VB1的提取效率相同，40 min后開始有下降趨勢(shì)。由于酸解10 min，樣品酸解溶液不易過濾，所以選擇最佳酸解時(shí)間為20 min。

圖3 不同酸解時(shí)間對(duì)VB1提取的影響

2.3 色譜條件優(yōu)化

2.3.1 色譜柱的選擇

試驗(yàn)比較了Xbridge C18柱（4.6×150 mm，3.5 μm）、Atlantis C18柱（4.6×150 mm，5 μm）和Agilent Poroshell 120 EC-C18柱（4.6×150 mm，4 μm）三種色譜柱的分離效果。結(jié)果表明，在選定的條件下Xbridge C18保留分離效果最好，峰型對(duì)稱，且峰寬小。原因可能是VB1結(jié)構(gòu)式含有羥基和氨基，衍生后顯堿性，而Xbridge C18專有的端基封尾技術(shù)可以確保堿性化合物具有完美的色譜峰形，所以試驗(yàn)最終選擇Xbridge C18色譜柱進(jìn)行分離分析。

2.3.2 流動(dòng)相的優(yōu)化

2.3.2.1 流動(dòng)相種類的選擇

經(jīng)相關(guān)文獻(xiàn)[21, 29]調(diào)研，高效液相色譜中比較常用的流動(dòng)相一般為甲醇-乙酸鈉、甲醇-乙酸銨或甲醇-磷酸鹽緩沖溶液，但由于甲醇-磷酸鹽緩沖液體系中磷酸鹽容易造成色譜柱堵塞，所以為了保護(hù)色譜柱，選擇甲醇-乙酸鈉和甲醇-乙酸銨緩沖溶液進(jìn)一步優(yōu)化。試驗(yàn)采用處理后的雞蛋樣品上機(jī)溶液，考察了在pH 4.0條件下10 mmol/L乙酸銨和10 mmol/L乙酸鈉對(duì)VB1分離效果的影響。結(jié)果顯示（見圖4A）：流動(dòng)相為乙酸銨時(shí)，峰型展寬，拖尾因子是0.86，峰輕度前伸；流動(dòng)相為乙酸鈉時(shí)，峰寬變窄，峰形變好，呈現(xiàn)高斯對(duì)稱，所以試驗(yàn)選擇乙酸鈉作為后續(xù)流動(dòng)相的優(yōu)化。

2.3.2.2 流動(dòng)相濃度的選擇

雞蛋樣品按照2.4小節(jié)進(jìn)行樣品處理，將流動(dòng)相分別配成5，10，30和50 mmol/L乙酸鈉（pH 4.0），比較VB1分離效果和峰型差異。結(jié)果可見（見圖4B）：濃度為5 mmol/L時(shí)，VB1峰型展寬，峰前伸；濃度為10，30和50 mmol/L時(shí)，VB1的峰型差異不大，峰型較好；考慮到高濃度的鹽會(huì)對(duì)色譜儀的輸液泵和色譜柱的壽命產(chǎn)生影響，所以試驗(yàn)選擇乙酸鈉的最佳濃度為10 mmol/L。

2.3.2.3 流動(dòng)相pH選擇

相關(guān)文獻(xiàn)[22]調(diào)研，可通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH來影響其在色譜柱上的保留時(shí)間。試驗(yàn)探討了在相同的流動(dòng)相組成、比例以及流速條件下，改變流動(dòng)相pH：采用pH分別為2.0，4.0，6.0，8.0的10 mmol/L乙酸鈉溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫，考察流動(dòng)相pH對(duì)VB1分離的影響。結(jié)果顯示（見圖4C），隨著流動(dòng)相pH變大，VB1出峰時(shí)間延后，反之出峰時(shí)間提前；當(dāng)pH為2.0時(shí)，VB1的峰變寬，峰型很差且響應(yīng)低；當(dāng)pH為4.0，6.0和8.0時(shí)，VB1峰寬變窄，峰型對(duì)稱。由于樣品前處理中有VB1衍生過程，其色譜峰圖譜基本無雜峰，考慮到分離效率，試驗(yàn)最終選擇流動(dòng)相的pH為4.0。

圖4 流動(dòng)相的優(yōu)化

2.4 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.4.1 線性范圍、檢出限和定量限

將2.3小節(jié)中1.0，10.0，50.0，100.0和500.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按照1.4.2小節(jié)衍生后，按照1.2小節(jié)的液相色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以VB1峰面積（Y）對(duì)其質(zhì)量濃度（X）做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程為Y=46.632 9X-0.221 5，相關(guān)系數(shù)（R2）大于0.999，線性關(guān)系良好。樣品按照1.4小節(jié)處理后，逐級(jí)稀釋成不同濃度VB1溶液后，經(jīng)液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，測(cè)試其信噪比，分別確定檢出限和定量限。以信噪比S/N=3得到目標(biāo)物的檢出限（SLOD）為0.015 mg/kg，以信噪比S/N=10得到目標(biāo)物的定量限（SLOQ）為0.050 mg/kg。標(biāo)樣譜圖（圖5 A）和樣品譜圖（圖5 B）見圖5。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 ng/mL）色譜圖（A）和樣品色譜圖（B）

2.4.2 回收率

將同一份雞蛋樣品分成2份，其中一份作本底，另一份添加適量濃度的VB1標(biāo)準(zhǔn)溶液后按照文章建立的方法進(jìn)行處理和測(cè)定，每份樣品進(jìn)行6次平行測(cè)定，考察方法的回收率和精密度，結(jié)果見表1。樣品加標(biāo)回收率為95.5%～102.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）為1.10%～3.21%，可見方法的數(shù)據(jù)穩(wěn)定，重現(xiàn)性良好。

表1 方法的回收率與精密度（n=6）

2.4.3 精密度

不同種類雞蛋樣品（山雞蛋、草雞蛋、洋雞蛋、烏雞蛋、土雞蛋）隨機(jī)選取一個(gè)進(jìn)行精密度測(cè)定，每個(gè)樣品分別平行取樣6組，按照1.4小節(jié)進(jìn)行樣品處理，上機(jī)測(cè)定。樣品中的VB1含量及精密度見表2。結(jié)果顯示，精密度小于1.53%，試驗(yàn)數(shù)據(jù)穩(wěn)定。

表2 雞蛋中VB1的含量及精密度

2.5 實(shí)際樣品分析

應(yīng)用此方法對(duì)市售的60個(gè)不同名稱雞蛋樣品（包括12個(gè)山雞蛋、12個(gè)草雞蛋、12個(gè)洋雞蛋、12個(gè)烏雞蛋、12個(gè)土雞蛋）進(jìn)行檢測(cè)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其中VB1的含量，檢測(cè)結(jié)果如下：山雞蛋、草雞蛋、洋雞蛋、烏雞蛋、土雞蛋含量范圍分別為0.121～0.872，0.288～0.808，0.185～0.886，0.316～0.758和0.293～1.15 mg/kg。結(jié)果表明：雞蛋中均含有VB1，含量范圍較寬：0.121～1.15 mg/kg；從60批市售雞蛋樣品結(jié)果來看，不同種類雞蛋之間VB1含量無明顯差異。

2.6 此方法與國(guó)標(biāo)方法的比較

用此方法和國(guó)標(biāo)法（GB 5009.84—2016）中的第一法同時(shí)測(cè)定雞蛋樣品，進(jìn)行比對(duì)試驗(yàn)。樣品結(jié)果及加標(biāo)回收率見表3。結(jié)果顯示雞蛋樣品中的VB1含量和國(guó)標(biāo)法測(cè)得的結(jié)果基本一致，回收率比較滿意，最大相對(duì)偏差為3.56%，因此該方法可以用于雞蛋中VB1的檢測(cè)。

表3 國(guó)標(biāo)法與本方法的比對(duì)結(jié)果（n=6）

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立了雞蛋中維生素B1的含量檢測(cè)研究方法。樣品經(jīng)HCl高溫酸解提取無需酶解過夜，不僅節(jié)約了成本，提高了檢驗(yàn)效率，而且酸解還有沉淀蛋白的凈化作用。該方法不僅前處理簡(jiǎn)單，而且具有較高的靈敏度，檢出限為0.015 mg/kg，定量限為0.050 mg/kg；具有較寬的線性范圍：1～500 ng/mL；具有較好的加標(biāo)回收率：95.5%～107.8%，可適用于大批量樣品的處理檢測(cè)。研究對(duì)準(zhǔn)確測(cè)定雞蛋中維生素B1含量提供了技術(shù)支持；對(duì)研究不同種類雞蛋品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的差異，具有重要的理論價(jià)值；對(duì)消費(fèi)者進(jìn)行雞蛋消費(fèi)選擇具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。