林婷，劉強(qiáng)欣*，聞佳鈺，俞婕，董葉箐，孫文閃

綠城農(nóng)科檢測(cè)技術(shù)有限公司（杭州 310051）

三氯蔗糖（sucralose），俗稱蔗糖素，是一種高倍甜味劑，具有無(wú)能量、高甜度、安全性好等特點(diǎn)，是最理想的甜味劑之一，被包括中國(guó)在內(nèi)的30多個(gè)國(guó)家批準(zhǔn)作為甜味劑使用[1]。風(fēng)味發(fā)酵乳除了具有豐富的蛋白質(zhì)、糖類、礦物質(zhì)及各種維生素外，還有抑制腸道中有害微生物生長(zhǎng)繁殖、增進(jìn)人體消化吸收的作用，因此備受消費(fèi)者喜愛(ài)。添加三氯蔗糖可以調(diào)節(jié)風(fēng)味發(fā)酵乳的口味，但近年來(lái)科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，三氯蔗糖會(huì)增加人們罹患白血病及其他各種癌癥的風(fēng)險(xiǎn)[3-4]。我國(guó)嚴(yán)格限制風(fēng)味發(fā)酵乳中三氯蔗糖使用量，因此風(fēng)味發(fā)酵乳中三氯蔗糖的檢測(cè)方法研究非常重要。

食品中三氯蔗糖的測(cè)定方法有很多[2]，主要有液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[5-11]、離子色譜法[12-13]、高效液相色譜法[14-16]、氣相色譜法[17]。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法雖然靈敏度高，但其設(shè)備昂貴，不利于實(shí)驗(yàn)室普遍推廣，還有基質(zhì)效應(yīng)影響等；離子色譜在檢測(cè)中具有對(duì)前處理要求高，易受陰離子干擾等缺點(diǎn)；氣相色譜法前處理需進(jìn)行衍生，較為繁瑣；液相色譜法儀器成本低、普及率高、準(zhǔn)確性好，因此作為首選方法。由于相關(guān)風(fēng)味發(fā)酵乳中三氯蔗糖的研究相對(duì)較少，試驗(yàn)通過(guò)前處理?xiàng)l件優(yōu)化，以期得到簡(jiǎn)單快速準(zhǔn)確的測(cè)定方法，便于三氯蔗糖液相色譜法的推廣使用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 材料與試劑

乙腈（色譜純，默克）；三氯蔗糖（純度99.9%，BePure）；固相萃取柱（HLB萃取柱）；Agela Innoval ODS-2（250 mm×4.6 mm，5.0 μm；博納艾杰爾）；試驗(yàn)用水（一級(jí)水，美國(guó)Millipore超純水儀制備）；混合微孔濾膜（0.22 μm）；風(fēng)味發(fā)酵乳（市售）。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀器（Shimadzu LC-20A，配有示差檢測(cè)器，日本島津公司）；電子天平（BSA224S型，德國(guó)賽多利斯）；高速冷凍離心機(jī)（ST16R，賽默飛世爾）；電熱板（EH20B，萊伯泰科）；超聲波清洗器（KQ5200E，昆山舒美）；渦旋振蕩器（Multi-TubeVortexer型）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)曲儲(chǔ)備液：精確稱取0.025 g（精確至0.000 1 g）三氯蔗糖至于25 mL容量瓶中，加入15 mL超純水，溶解后，定容到刻度，其中三氯蔗糖質(zhì)量濃度為1 mg/mL。置于4 ℃冰箱中保存，保存期為6個(gè)月。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別準(zhǔn)確吸0.015，0.050，0.100，0.200，0.500和1.000 mL三氯蔗糖儲(chǔ)備液于6個(gè)10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配制成三氯蔗糖的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.001 5，0.005 0，0.010 0，0.020 0，0.050 0和0.100 0 g/L），現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取5 g（精確至0.001 g）試樣置于50 mL離心管中，加入10 mL水，渦旋混合器上渦旋3 min后加入10 mL乙腈，繼續(xù)渦旋3 min，超聲波提取20 min，以8 000 r/min離心3 min，將上清液轉(zhuǎn)移至150 mL燒杯中。殘?jiān)屑尤?0 mL乙腈水溶液（50+50，V/V），渦旋3 min，以8 000 r/min離心3 min，重復(fù)提1次，合并上清液于同一燒杯中。將燒杯置于電熱板上，于210 ℃蒸發(fā)至液體在10 mL左右，用30 mL水分三次沖洗燒杯，合并沖洗液置于50 mL離心管中。

將全部提取濃縮液移入已活化的固相萃取柱（HLB萃取柱，用5 mL甲醇，5 mL水活化），用5 mL水淋洗萃取柱，待柱中液體完全排出后，用5 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，于50 ℃氮吹至近干，殘?jiān)? mL乙腈水溶液（20+80，V/V）溶解，過(guò)0.22 μm混合濾膜，上機(jī)測(cè)試。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Agela Innoval ODS-2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；流動(dòng)相：乙腈-水=20∶80（V/V）；檢測(cè)器采用示差檢測(cè)器；進(jìn)樣量20 μL；流速1 mL/min。圖1為三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液中三氯蔗糖的液相色譜圖

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 提取試劑的優(yōu)化

風(fēng)味發(fā)酵乳是指除了80%以上奶粉之外，還加入果蔬、谷物、食品添加劑等原料的發(fā)酵乳制品。三氯蔗糖具有極好的水溶性，故依據(jù)目標(biāo)物質(zhì)的溶解性質(zhì)，該方法研究比較超純水、甲醇水溶液和乙腈水溶液3種提取試劑，通過(guò)計(jì)算回收率比較各提取劑的提取效果。結(jié)果（圖2）表明乙腈水提取試劑時(shí)提取效果（回收率）最好。原因分析可能是采用超純水、甲醇水溶液進(jìn)行提取時(shí)，提取液中會(huì)含有水溶性的蛋白質(zhì)等大分子雜質(zhì)，會(huì)在后續(xù)過(guò)固相萃取柱時(shí)存在堵塞萃取小柱的風(fēng)險(xiǎn)，增加目標(biāo)物質(zhì)的損失，且含有蛋白質(zhì)的上機(jī)試樣會(huì)對(duì)整個(gè)色譜系統(tǒng)尤其是對(duì)于液相色譜柱產(chǎn)生極大的不良影響。采用先加水增加液固比，加之乙腈使蛋白質(zhì)變性，具有較好的沉淀效果。綜合考慮，采取乙腈水作為提取試劑。

圖2 不同提取溶劑對(duì)于三氯蔗糖提取效果的影響

2.1.2 提取時(shí)間的優(yōu)化

該方法研究比較不同超聲時(shí)間（5，10，20和30 min）對(duì)于三氯蔗糖提取效率的影響。結(jié)果（圖3）顯示超聲時(shí)間與提取效率基本呈正相關(guān)關(guān)系，在20 min時(shí)可以獲得較好的回收率，而繼續(xù)增加超聲時(shí)間提取效率并無(wú)明顯增加，故選擇提取時(shí)間為20 min。

圖3 不同提取時(shí)間對(duì)于三氯蔗糖提取效果的影響

2.1.3 提取液濃縮方式的優(yōu)化

由于提取液中有機(jī)相約占50%，比例較高，提取液直接過(guò)固相萃取柱不利于凈化柱對(duì)目標(biāo)物質(zhì)（三氯蔗糖）的吸附，則需要通過(guò)提取液濃縮的方式將有機(jī)相比例降低。試驗(yàn)方法比較50 ℃氮吹儀吹干、210 ℃電熱板烤干和沸水浴蒸發(fā)皿蒸干3種濃縮方法?，F(xiàn)有氮吹儀的單次使用最大限值為10 mL，樣品提取液需進(jìn)行多次氮吹，而且提取液中水分幾乎占到一半，提取液不易吹干，耗時(shí)較長(zhǎng)；沸水浴蒸發(fā)皿蒸干容易爆沸，不利于大批量樣品同時(shí)處理；用210 ℃電熱板烤干，10余個(gè)試液可以同時(shí)進(jìn)行，可以節(jié)約時(shí)間，提高工作效率，因此選擇210 ℃電熱板烤干進(jìn)行提取液的濃縮。

2.1.4 固相萃取柱的優(yōu)化

風(fēng)味發(fā)酵乳主要含有奶粉、果蔬、谷物、食品添加劑等原料物質(zhì)，這些雜質(zhì)的存在會(huì)干擾化合物的測(cè)定，影響方法的靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度。因此選擇合適的淋洗液來(lái)除去雜質(zhì)以降低雜質(zhì)對(duì)于結(jié)果的干擾作用尤為重要。研究超純水、5%甲醇水、10%甲醇水、20%甲醇水作為淋洗液處理試樣。結(jié)果（圖4）表明三氯蔗糖含量隨著淋洗液有機(jī)相比例的提高而降低，超純水凈化效果最佳，其他3種淋洗液回收率偏低，可能由于淋洗液中甲醇會(huì)將萃取柱中目標(biāo)物質(zhì)洗脫，甲醇含量越高造成目標(biāo)物質(zhì)損失越大，使得目標(biāo)物質(zhì)回收率偏低。故選擇超純水作為淋洗液。

圖4 不同淋洗液對(duì)于三氯蔗糖提取效果的影響

選擇合適的溶劑將吸附在固相萃取柱填料上的目標(biāo)物洗脫也是十分重要的一環(huán)，研究甲醇、80%甲醇水、50%甲醇水、20%甲醇水作為洗脫液處理試樣。結(jié)果（圖5）表明三氯蔗糖含量隨著洗脫液有機(jī)相比例的升高而提高，甲醇的洗脫效果最佳，其他3種洗脫液洗脫效果較差，故選擇甲醇作為洗脫液。

圖5 不同洗脫液對(duì)于三氯蔗糖提取效果的影響

2.2 方法的線性范圍及檢出限

方法的檢出限（LOD）的確定參考GB 22255—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的測(cè)定》[18]，通過(guò)空白樣品不斷降低三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的添加濃度，當(dāng)在儀器上色譜峰達(dá)到3倍信噪比（S/N）時(shí)對(duì)應(yīng)的加標(biāo)濃度即為檢出限，定量限（LOQ）的確定參考GB 22255—2014通過(guò)空白樣品不斷降低標(biāo)準(zhǔn)溶液的添加濃度，當(dāng)在儀器上色譜峰達(dá)到10倍信噪比（S/N）時(shí)對(duì)應(yīng)的添加濃度即為定量限。以濃度和峰面積建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到對(duì)應(yīng)的線性方程及相關(guān)系數(shù)，在一定濃度范圍內(nèi)，濃度與峰面積呈正比例關(guān)系，線性關(guān)系良好（見(jiàn)表1）。

表1 三氯蔗糖的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.3 回收率及精密度試驗(yàn)

對(duì)不含三氯蔗糖的風(fēng)味發(fā)酵乳在0.003，0.015和0.300 g/kg（定量限、5倍定量限和限量值）3個(gè)水平下進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，按照1.2.2方法處理后進(jìn)行測(cè)定6次，計(jì)算添加回收率（見(jiàn)表2）

從表2可以得出，該測(cè)定方法下三氯蔗糖的回收率滿足GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》[19]要求（90%～110%），且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于5%，由此可以看出測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定。

表2 回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

2.4 實(shí)際樣品測(cè)試

運(yùn)用試驗(yàn)方法對(duì)購(gòu)自超市的5份風(fēng)味發(fā)酵乳進(jìn)行測(cè)定分析，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定2次。結(jié)果表明5個(gè)樣本中1份樣品含有三氯蔗糖，檢出情況見(jiàn)表3（其中樣品色譜圖見(jiàn)圖6，空白樣品色譜圖見(jiàn)圖7）。根據(jù)GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品營(yíng)添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[20]中風(fēng)味發(fā)酵乳中三氯蔗糖使用限量，所檢出的陽(yáng)性樣品低于0.300 g/kg，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求。

表3 樣品中三氯蔗糖的測(cè)定

圖6 風(fēng)味發(fā)酵乳中三氯蔗糖的液相色譜圖

圖7 空白樣品中三氯蔗糖的液相色譜圖

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立固相萃取柱凈化-液相色譜示差檢測(cè)器測(cè)定風(fēng)味發(fā)酵乳中三氯蔗糖含量檢測(cè)方法，重點(diǎn)研究提取試劑、提取時(shí)間、提取液的濃縮方法、固相萃取柱溶劑4個(gè)方面，試驗(yàn)結(jié)果表明，前處理提取凈化效果對(duì)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性有很大的影響，固相萃取柱可有效消除風(fēng)味發(fā)酵乳中雜質(zhì)對(duì)目標(biāo)物的干擾。該方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠，三氯蔗糖在0.001 5～0.100 0 g/mL之間線性關(guān)系良好，平均回收率為90.3%～96.7%，方法定量限為0.003 g/kg，優(yōu)于GB 22255—2014[18]中規(guī)定的0.007 5 g/kg。該方法更加便于在日常工作中的推廣，為風(fēng)味發(fā)酵乳中三氯蔗糖的測(cè)定提供重要參考。方法不足之處在于使用測(cè)定的檢測(cè)器為液相示差檢測(cè)器，然而示差檢測(cè)器對(duì)環(huán)境溫度有著極高的要求，且無(wú)法進(jìn)行梯度洗脫。