呼念念 ，陳冬東，黎燁昕，呼秀智，彭濤*，江利華*

1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院（邯鄲 056038）；2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院（北京 100176）

硝基呋喃類獸藥是一類合成廣譜抗菌劑，該類藥物能夠抑制大多數(shù)革蘭陽性菌和革蘭陰性菌、真菌及原生動(dòng)物某些原蟲的活性，因而被廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療疾病[1-2]。研究表明，若長(zhǎng)期或者大劑量對(duì)動(dòng)物使用硝基呋喃類獸藥會(huì)產(chǎn)生毒性和副作用，能夠致癌、致畸和誘導(dǎo)基因突變[3-5]。我國(guó)2002年也頒發(fā)了禁止使用硝基呋喃抗生素的禁令[6-7]。因此為了對(duì)硝基呋喃類獸藥的監(jiān)測(cè)、為保障食品的安全性，開展硝基呋喃類獸藥殘留量檢測(cè)能力驗(yàn)證計(jì)劃，考察實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)硝基呋喃類獸藥殘留量的能力十分必要。

能力驗(yàn)證（proficiency testing，PT）是利用實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)確定實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力的活動(dòng)，也可有效補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制[8-10]。為客觀反映實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)雞肉中獸藥殘留的技術(shù)能力和水平，促進(jìn)該類測(cè)試項(xiàng)目檢測(cè)能力的提高，組織、實(shí)施雞肉中硝基呋喃類獸藥殘留定量分析能力驗(yàn)證計(jì)劃。通過能力驗(yàn)證計(jì)劃對(duì)參加單位實(shí)驗(yàn)室結(jié)果進(jìn)行技術(shù)分析，以期為相關(guān)管理部門進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室資源提供相應(yīng)參考，促進(jìn)相關(guān)實(shí)驗(yàn)室提高其技術(shù)水平和質(zhì)量管理能力[11-12]。

1 能力驗(yàn)證實(shí)施與研究

1.1 能力驗(yàn)證樣品制備

能力驗(yàn)證計(jì)劃所用樣品為白羽肉雞，根據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)的不同給藥量對(duì)所購(gòu)白羽肉雞進(jìn)行飼喂給藥試驗(yàn)，連續(xù)給藥7 d。間隔適當(dāng)時(shí)間后進(jìn)行宰殺，獲取含有硝基呋喃類代謝物殘留的雞肉組織的陽性樣品。采取雞胸肉作為能力驗(yàn)證樣品原料，將其剔除筋膜、肥肉等組織，在攪拌機(jī)中進(jìn)行充分?jǐn)嚢?，攪拌成肉糜，將充分混勻的肉糜進(jìn)行凍干，凍干后的樣品進(jìn)行粉碎、過篩并進(jìn)行2次混勻。共制備兩批不同濃度樣品，樣品采用鋁箔袋進(jìn)行分裝，規(guī)格為每袋10 g，在-15 ℃以下冷凍保存。

1.2 檢測(cè)方法

能力驗(yàn)證計(jì)劃要求實(shí)驗(yàn)室按照日常檢測(cè)程序進(jìn)行檢測(cè)，不限定檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行結(jié)果提交時(shí)需要提交硝基呋喃類代謝物結(jié)合態(tài)和游離態(tài)的總量。推薦選用GB/T 21311—2007《動(dòng)物源性食品中硝基呋喃類藥物代謝物殘留量檢測(cè)方法 高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法》[13]進(jìn)行測(cè)定。

1.3 樣品均勻性和穩(wěn)定性考察

按照CNAS-GL003《能力驗(yàn)證樣品均勻性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)指南》[14]的規(guī)定，從分裝好的樣品中，每組各隨機(jī)抽取10個(gè)樣品（n=10），每個(gè)樣品至少平行測(cè)定2次，并采用單因素方差分析方法對(duì)其進(jìn)行均勻性考察。

短期穩(wěn)定性通過模擬樣品運(yùn)輸條件，并采用t檢驗(yàn)法評(píng)定考察樣品的短期穩(wěn)定性。長(zhǎng)期穩(wěn)定性測(cè)定間隔按先密后疏的原則設(shè)計(jì)，分別在第7，第15，第30和第60天各隨機(jī)抽取3份樣品進(jìn)行測(cè)定，采用t檢驗(yàn)法進(jìn)行考察。

1.4 樣品發(fā)放

能力驗(yàn)證計(jì)劃共設(shè)計(jì)發(fā)放2份不同濃度的樣品。按照隨機(jī)數(shù)表，給每個(gè)實(shí)驗(yàn)室隨機(jī)分配不同濃度的樣品各1份。樣品編號(hào)為Axxx、Bxxx，其中字母A、B用于區(qū)分2個(gè)樣品，每個(gè)樣品的標(biāo)識(shí)均具有唯一性，以進(jìn)一步提高樣品的保密性和可溯源性。樣品發(fā)放前在-15 ℃以下冷凍保存。

1.5 結(jié)果統(tǒng)計(jì)方法與評(píng)價(jià)

能力驗(yàn)證計(jì)劃按照ISO 13528：2015《利用實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)進(jìn)行能力驗(yàn)證的統(tǒng)計(jì)方法》[15]的要求，采用穩(wěn)健統(tǒng)計(jì)技術(shù)的統(tǒng)計(jì)方式處理檢測(cè)結(jié)果和評(píng)價(jià)結(jié)果。對(duì)參加者的檢測(cè)結(jié)果，按式（1）計(jì)算z值。

式中：x為參加者檢測(cè)結(jié)果；X為指定值；σ為能力評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)差。實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的判定原則：|z|≤2.0為滿意結(jié)果；2.0＜|z|＜3.0為可疑結(jié)果；|z|≥3.0為不滿意結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品的均勻性和穩(wěn)定性考察

2.1.1 均勻性檢測(cè)

按照CNAS-GL003[14]的要求，采用單因素方差分析法對(duì)樣品進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果采用單因素方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，方差分析結(jié)果如表1所示，結(jié)果表明在0.05顯著水平時(shí)，能力驗(yàn)證樣品中的呋喃唑酮代謝物、呋喃它酮代謝物含量均勻。

表1 A樣品中呋喃唑酮代謝物均勻性測(cè)定方差分析結(jié)果

2.1.2 穩(wěn)定性檢測(cè)

短期穩(wěn)定性模擬樣品實(shí)際運(yùn)輸條件，分別郵寄樣品到溫度偏高或溫差大的異地后，進(jìn)行郵寄返給組織者測(cè)試的方式。在2021年5月將分裝好的樣品分別郵寄海南、哈爾濱、烏魯木齊、杭州四地，考察能力驗(yàn)證樣品短期穩(wěn)定性。采用t檢驗(yàn)法評(píng)定樣品的穩(wěn)定性，短期穩(wěn)定性的t值均小于95%置信區(qū)間查表值，其結(jié)果未見顯著差異，未觀測(cè)到不穩(wěn)定，說明能力驗(yàn)證樣品滿足實(shí)際運(yùn)輸要求。

依據(jù)CNAS-GL003[14]要求，采用t檢驗(yàn)法對(duì)樣品的穩(wěn)定性進(jìn)行考察。結(jié)果表明，計(jì)算的t值均小于95%置信區(qū)間臨界值，各測(cè)定時(shí)間測(cè)定結(jié)果無顯著性差異，樣品穩(wěn)定性良好，達(dá)到能力驗(yàn)證樣品要求。長(zhǎng)期穩(wěn)定性結(jié)果見表2和表3。

表2 呋喃唑酮代謝物長(zhǎng)期穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

表3 呋喃它酮代謝物長(zhǎng)期穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

2.2 實(shí)驗(yàn)室參加情況

報(bào)名能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室共42家，其中41家參加呋喃唑酮代謝物項(xiàng)目測(cè)試，39家參加呋喃它酮代謝物項(xiàng)目測(cè)試。42家實(shí)驗(yàn)室分布于全國(guó)17個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市），其中參加本次能力驗(yàn)證計(jì)劃的實(shí)驗(yàn)室較多的?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）為山東省，共9家，其具體分布情況見圖1。

圖1 參加實(shí)驗(yàn)室分布情況

2.3 能力驗(yàn)證統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.3.1 測(cè)定結(jié)果的總體分布

圖3 呋喃唑酮代謝物B樣品含量測(cè)定結(jié)果數(shù)據(jù)分布圖

圖4 呋喃它酮代謝物A樣品含量測(cè)定結(jié)果數(shù)據(jù)分布圖

能力驗(yàn)證共收回實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果160個(gè)，對(duì)測(cè)定結(jié)果數(shù)據(jù)的頻數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，根據(jù)頻數(shù)繪制分布直方圖并進(jìn)行正態(tài)擬合，見圖2～圖5數(shù)據(jù)分布圖。能力驗(yàn)證回收的檢驗(yàn)結(jié)果近似服從正態(tài)分布，采用穩(wěn)健統(tǒng)計(jì)技術(shù)算法A對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

圖2 呋喃唑酮代謝物A樣品含量測(cè)定結(jié)果數(shù)據(jù)分布圖

圖5 呋喃它酮代謝物B樣品含量測(cè)定結(jié)果數(shù)據(jù)分布圖

2.3.2 測(cè)定結(jié)果統(tǒng)計(jì)量

能力驗(yàn)證共回收42家實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果，將42家實(shí)驗(yàn)室反饋的測(cè)定結(jié)果采取算法A進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)，能力驗(yàn)證項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)量見表4。由表4可知，能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室內(nèi)穩(wěn)健C.V.值近28%，表明各實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果離散性較大，檢測(cè)水平有較大差異。

表4 檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)量匯總表

2.4 試驗(yàn)結(jié)果分析

2.4.1 離群值分析

經(jīng)統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)室編碼為9的實(shí)驗(yàn)室反饋的檢測(cè)結(jié)果與樣品本身含量相差較大，查閱該實(shí)驗(yàn)室上傳的原始記錄發(fā)現(xiàn)其標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液濃度應(yīng)為1 000 ng/mL，但是檢測(cè)人員在配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的過程中將儲(chǔ)備液濃度記錄的為100 ng/mL，致使標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度較低，導(dǎo)致樣品濃度超出標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度，最終測(cè)得結(jié)果比樣品原本含量較低，與樣品原本含量相差10倍多。因此該實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果被判定為離群值。

2.4.2 不同檢測(cè)方法結(jié)果滿意情況分析

能力驗(yàn)證計(jì)劃推薦的方法為GB/T 21311—2007。但實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)自身實(shí)際情況，采用日常使用的方法進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)所用方法的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表5。由表5可以看出，能力驗(yàn)證項(xiàng)目結(jié)果滿意率與檢測(cè)方法的選擇無較大影響。

表5 不同檢測(cè)方法統(tǒng)計(jì)

2.4.3 非滿意結(jié)果分析

在對(duì)能力驗(yàn)證項(xiàng)目非滿意結(jié)果進(jìn)行分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)非滿意實(shí)驗(yàn)室提交的呋喃唑酮代謝物或呋喃它酮代謝物各項(xiàng)目的兩份樣品結(jié)果存在較為一致的負(fù)偏差。通過查閱相關(guān)實(shí)驗(yàn)室提供的原始記錄等材料對(duì)結(jié)果偏離的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行技術(shù)分析。

1) 硝基呋喃類代謝物殘留量的測(cè)定大多將水解后的樣品進(jìn)行衍生化處理，在37 ℃恒溫箱中過夜16 h反應(yīng)。在能力驗(yàn)證項(xiàng)目中實(shí)驗(yàn)室編碼為31的實(shí)驗(yàn)室原始記錄顯示其進(jìn)行37 ℃水浴鍋中恒溫1 h反應(yīng)。該實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證項(xiàng)目結(jié)果均為不滿意。因此需考慮衍生反應(yīng)的時(shí)間、溫度，樣品是否完全衍生，以免對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性造成影響。

2) 對(duì)于硝基呋喃類代謝物的提取大多數(shù)方法都使用乙酸乙酯提取，在提取時(shí)要盡可能充分提取，容易出現(xiàn)提取不充分引起結(jié)果偏低的現(xiàn)象；在樣品前處理過程進(jìn)行殘?jiān)鼜?fù)溶時(shí)，需考慮溶劑的種類和體積后是否能充分溶解，這兩方面會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性有一定影響。能力驗(yàn)證項(xiàng)目中大部分實(shí)驗(yàn)室使用1 mL 0.1%甲酸水溶液對(duì)殘?jiān)M(jìn)行復(fù)溶。實(shí)驗(yàn)室編碼為6的實(shí)驗(yàn)室使用GB/T 21311—2007的檢測(cè)方法，其使用2 mmol/L醋酸銨溶液對(duì)殘?jiān)M(jìn)行復(fù)溶，其能力驗(yàn)證結(jié)果為可疑。因此其可疑結(jié)果可能會(huì)與復(fù)溶溶劑的選擇有關(guān)，對(duì)最終檢測(cè)結(jié)果造成一定影響。

3) 能力驗(yàn)證項(xiàng)目中實(shí)驗(yàn)室編碼為5的實(shí)驗(yàn)室計(jì)算所得樣品濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍之外，低于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)濃度。實(shí)驗(yàn)室編碼為6和21的實(shí)驗(yàn)室計(jì)算所得樣品濃度較為靠近標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)，可能帶入較大誤差，導(dǎo)致計(jì)算結(jié)果偏離，從而影響最終結(jié)果。由此可以看出，在設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍時(shí)要合理，線性范圍應(yīng)包含被檢測(cè)樣品的濃度。

4) 查閱原始記錄可知實(shí)驗(yàn)室編碼為23和33的實(shí)驗(yàn)室使用內(nèi)標(biāo)方法定量時(shí)，選取內(nèi)標(biāo)溶液濃度過高，其內(nèi)標(biāo)響應(yīng)值與樣品目標(biāo)物響應(yīng)值相差10倍，從而會(huì)影響最終結(jié)果的準(zhǔn)確性，有可能會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果為可疑或不滿意結(jié)果。因此實(shí)驗(yàn)室在檢測(cè)過程中應(yīng)保證內(nèi)標(biāo)溶液和樣品溶液響應(yīng)值的大小。

由于部分參加實(shí)驗(yàn)室的原始記錄未對(duì)樣品的前處理過程進(jìn)行記錄描述，原始記錄過于簡(jiǎn)單，缺少標(biāo)準(zhǔn)品純度、配制過程、計(jì)算過程或圖譜數(shù)據(jù)等信息，無法進(jìn)一步分析判斷。對(duì)于結(jié)果出現(xiàn)一致性較大偏倚的實(shí)驗(yàn)室，建議應(yīng)從方法、儀器、試劑、人員操作等可能存在的系統(tǒng)誤差對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，及時(shí)找出可能存在的問題。

2.5 連續(xù)能力驗(yàn)證計(jì)劃結(jié)果分析

2016—2021 年間，實(shí)驗(yàn)室連續(xù)開展5年雞肉中硝基呋喃類獸藥的檢測(cè)能力驗(yàn)證項(xiàng)目。本次能力驗(yàn)證項(xiàng)目中有連續(xù)參加的實(shí)驗(yàn)室。2016—2021年連續(xù)參加實(shí)驗(yàn)室的Z值分布圖，見圖6。由圖6可知實(shí)驗(yàn)室編碼為2，14，32，35和42為近5年連續(xù)參加的實(shí)驗(yàn)室。由圖7分析可知，實(shí)驗(yàn)室編碼為2和42的兩家實(shí)驗(yàn)室，通過連續(xù)參加此項(xiàng)能力驗(yàn)證項(xiàng)目，其Z值結(jié)果由可疑值逐步上升為滿意結(jié)果，且檢測(cè)結(jié)果與指定值越來越接近。實(shí)驗(yàn)室編碼為14的實(shí)驗(yàn)室，根據(jù)其2016—2021年實(shí)驗(yàn)室Z值分布圖可看出該實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果雖然其Z值都為滿意結(jié)果，但都為正偏差結(jié)果，說明該實(shí)驗(yàn)室部分檢測(cè)系統(tǒng)存在一定系統(tǒng)偏差。因此，建議實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部進(jìn)行系統(tǒng)偏差分析糾正。實(shí)驗(yàn)室編碼為32和35的2家實(shí)驗(yàn)室從Z值分布圖可看出其五年Z值均為滿意結(jié)果，且與指定值越為接近。由此可見，通過連續(xù)參加雞肉中硝基呋喃類藥物的測(cè)定能力驗(yàn)證活動(dòng)，實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果滿意率逐年上升，檢測(cè)水平逐年提高。檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室通過連續(xù)參加能力驗(yàn)證活動(dòng)，可以有效提高檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性和有效性，發(fā)現(xiàn)與其他實(shí)驗(yàn)室之間的差距及問題所在，有利于實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力進(jìn)一步提高。

圖6 連續(xù)參加實(shí)驗(yàn)室Z值分布圖

3 結(jié)論

對(duì)全國(guó)42家實(shí)驗(yàn)室開展雞肉中硝基呋喃類獸藥殘留量測(cè)定的能力驗(yàn)證工作，結(jié)果滿意率較高，說明參加能力驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)室具備較好的檢測(cè)該項(xiàng)目的能力。在能力驗(yàn)證中，通過查閱原始記錄等材料發(fā)現(xiàn)部分實(shí)驗(yàn)室因標(biāo)準(zhǔn)品配制過程記錄出現(xiàn)錯(cuò)誤、對(duì)能力驗(yàn)證要求查看不細(xì)致，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍設(shè)置不合理等問題，從而造成實(shí)驗(yàn)室提交結(jié)果為非滿意結(jié)果。分析近5年連續(xù)參加雞肉中硝基呋喃類藥物的測(cè)定的實(shí)驗(yàn)室，通過連續(xù)參加此項(xiàng)能力驗(yàn)證活動(dòng)，實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果滿意率呈上升趨勢(shì)，檢測(cè)水平逐步提升。因此建議實(shí)驗(yàn)室不僅要提升檢測(cè)技術(shù)水平，也需要加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量體系的建設(shè)，并通過持續(xù)參加能力驗(yàn)證活動(dòng)，不斷發(fā)現(xiàn)檢驗(yàn)中存在的問題，從而提升檢驗(yàn)?zāi)芰Α?/p>