侯萬超，劉春明*，劉震，李賽男*，張語遲，金永日

長春師范大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室（長春 130032）

黑靈芝（Ganodermaatrum）為多孔菌科靈芝屬植物，是藥食兩用真菌，味甘性溫[1]，在《本草綱目》和《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載具有補(bǔ)腎和利尿功能，有“仙草”之美譽(yù)[2]，具有極高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用保健價(jià)值，作為廣受關(guān)注的傳統(tǒng)藥材和保健食品使用已有千年的歷史[3]。其中，多糖和三萜是其主要的成分[4]。多糖類成分被廣泛研究[5]，但對黑靈芝中三萜類成分的研究報(bào)道較少。

藥用植物提取新工藝對提高藥用植物研究和加快藥用植物開發(fā)起著至關(guān)重要的作用。新工藝、新技術(shù)在應(yīng)用過程中無疑要涉及優(yōu)化問題，現(xiàn)主要有響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)、正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)、均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)和因子設(shè)計(jì)試驗(yàn)[6-8]。其中，最常用的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用回歸方程將試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性或非線性擬合，生成具體函數(shù)表達(dá)式[9]，并進(jìn)一步分析函數(shù)以獲取最佳提取工藝條件，試驗(yàn)點(diǎn)的選擇直接影響優(yōu)化結(jié)果，傳統(tǒng)的多元回歸擬合方法存在其自身屬性的缺陷，難以使用數(shù)學(xué)方法進(jìn)行精準(zhǔn)建模[10-11]。與響應(yīng)面等傳統(tǒng)方法相比，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)利用現(xiàn)有的數(shù)據(jù)，通過構(gòu)建仿真優(yōu)化模型，仿真優(yōu)化提取工藝與結(jié)果之間的非線性關(guān)系[12]，預(yù)測最優(yōu)工藝條件，對響應(yīng)面法優(yōu)選的提取工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證及修正[13]。其通過調(diào)整神經(jīng)元與神經(jīng)元之間的權(quán)值和閾值進(jìn)行擬合[14]，不存在具體的函數(shù)表達(dá)式，因此不能通過傳統(tǒng)的優(yōu)化方式來求解極值[15]。遺傳算法是一種隨機(jī)搜索算法，非常適用于處理傳統(tǒng)搜索算法難以解決的和非線性優(yōu)化的問題。它以生物界自然選擇和遺傳基因組學(xué)原理為基礎(chǔ)。首先將問題的可行解編碼表示成染色體，其中每個(gè)染色體代表一個(gè)個(gè)體；其次通過一定的選擇、交叉、變異操作生成一定數(shù)量的種群[16]，根據(jù)適應(yīng)度的好壞從中篩選出一定數(shù)量的優(yōu)秀個(gè)體，進(jìn)行選擇、交叉、變異操作逐步更新種群；最后種群經(jīng)過若干代進(jìn)化后，達(dá)到最大進(jìn)化代數(shù)。此時(shí)種群中適應(yīng)度最高的個(gè)體，即為通常尋找的最優(yōu)解，解碼個(gè)體即得到所需最優(yōu)工藝參數(shù)條件[17]。

為優(yōu)化黑靈芝中三萜類成分的提取工藝，利用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)獲得的數(shù)據(jù)優(yōu)化BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型各參數(shù)，建立相應(yīng)網(wǎng)絡(luò)模型；結(jié)合遺傳算法通過網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行極值尋優(yōu)，得到提取工藝的最佳條件；通過分析BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的擬合度和黑靈芝三萜得率的預(yù)測結(jié)果，表明算法性能優(yōu)于多元非線性回歸算法性能。試驗(yàn)結(jié)果為黑靈芝中三萜類成分的提取研究提供科學(xué)有效的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Evolution 600 UV-vis（Thermo Fisher，美國）；Milli-Q超純水機(jī)（Millipore，美國）；冰乙酸、香草醛、高氯酸、無水乙醇（均為分析純）。

黑靈芝購自北京同仁堂藥店（長春），經(jīng)長春師范大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室劉春明教授鑒定確認(rèn)為多孔菌科靈芝屬植物干燥的子實(shí)體。

標(biāo)準(zhǔn)溶液制備：配制0.3 mg/mL齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，稱取3.0 mg齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，于10.0 mL容量瓶用色譜甲醇定容至刻度，得到所需的質(zhì)量濃度。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的顯色

三萜顯色方法采用冰乙酸-香草醛法[18]。精密量取標(biāo)準(zhǔn)品和黑靈芝提取溶液各1.0 mL置于5.0 mL容量瓶中，蒸干溶劑，放冷，加入0.2 mL新配制的香草醛冰乙酸溶液（精密量取2.5 g香草醛，加入250 mL冰乙酸溶解，即得）和0.8 mL高氯酸，搖勻，在70 ℃水浴中加熱15 min，取出，立即冰水浴冷卻5.0 min后，加入冰乙酸至刻度處，搖勻，以相應(yīng)的試劑為空白試驗(yàn)，在波長546 nm處進(jìn)行檢測。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

量取0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別置于5.0 mL容量瓶中，按照1.2.1中方法進(jìn)行顯色反應(yīng)，測定吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線方程y=6.636 4x+0.015 2，R2=0.999 1，線性關(guān)系良好（圖1）。

圖1 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

1.2.3 黑靈芝中三萜的提取及測定

將1.0 g黑靈芝粉末加入70%乙醇浸泡后調(diào)節(jié)pH，加入纖維素酶進(jìn)行酶解，酶解一定時(shí)間后90 ℃水浴滅活，超聲提取后離心并抽取上清液定容，最后進(jìn)行黑靈芝中三萜含量測定。

準(zhǔn)確移取0.1 mL提取液，用紫外分光光度計(jì)按照1.2.1在546 nm處測定吸光度，計(jì)算黑靈芝中三萜提取率。

1.2.4 黑靈芝中三萜的提取率計(jì)算

使用紫外吸收光譜測定黑靈芝酶解提取液的吸光度，平行操作3次，取吸光度的平均值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線算出待測液中三萜的質(zhì)量，由式（1）計(jì)算出黑靈芝三萜提取率。

式中：C為質(zhì)量濃度，mg/mL；m為樣品質(zhì)量，g；V為提取液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

以加酶量（按每克藥材用量計(jì)）、pH、酶解時(shí)間、提取時(shí)間、料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)為主要影響因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察加酶量（1.0%，2.0%，3.0%，4.0%和5.0%）、pH（2.0，3.0，4.0，5.0和6.0）、酶解時(shí)間（30，40，50，60和70 min）、提取時(shí)間（20，30，40，50和60 min）、料液比（1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30）和乙醇體積分?jǐn)?shù)（50%，60%，70%，80%和90%）對黑靈芝三萜提取率的影響趨勢。選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、酶解時(shí)間（B）、加酶量（C）和料液比（D）為影響因素，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，平行稱取29份，每份1.0 g，以黑靈芝三萜提取率（Y）為評價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面分析，以-1，0和1編碼分別代表自變量低、中、高水平，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1，進(jìn)行響應(yīng)面分析。

表1 黑靈芝三萜提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表

1.2.6 BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和訓(xùn)練

在超聲輔助酶法提取黑靈芝中三萜類成分提取率的響應(yīng)面分析基礎(chǔ)上，進(jìn)行神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練及仿真。采用24組試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行訓(xùn)練，其中輸入層為4，分別是乙醇體積分?jǐn)?shù)、酶解時(shí)間、加酶量和料液比，并歸一化處理在0～1之間，歸一化法由式（2）計(jì)算可得。

式中：Yi為訓(xùn)練樣本數(shù)據(jù)的第i個(gè)輸入；Yi’為Ti歸一化后的數(shù)據(jù)，Yi’∈[a, b]；Yimax為訓(xùn)練樣本數(shù)據(jù)的第i個(gè)輸入的最大值；Yimin為訓(xùn)練樣本數(shù)據(jù)的第i個(gè)輸入的最小值。三萜提取率Y作為輸出層節(jié)點(diǎn)，建立輔超聲助酶法提取黑靈芝三萜類成分工藝的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型。

1.2.7 遺傳算法優(yōu)化

網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練結(jié)束后，對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行全面模擬仿真，并結(jié)合遺傳算法對黑靈芝三萜提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)適應(yīng)度函數(shù)對數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)值評價(jià)并搜索到全局符合目標(biāo)函數(shù)的最優(yōu)值，即最優(yōu)解。為進(jìn)一步保證試驗(yàn)準(zhǔn)確性，試驗(yàn)均采用3次平行試驗(yàn)的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，分析所選因素對三萜提取率的綜合影響，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)和BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化數(shù)據(jù)表

采用Design-Expert 7.1.4軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到目標(biāo)函數(shù)三萜提取率對乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、酶解時(shí)間（B）、加酶量（C）和料液比（D）的二次多項(xiàng)回歸方程：三萜提取率Y=20.72+1.19A+0.46B+0.96C+1.60D-0.44AB-1.18 AC-0.43AD-2.01BC+0.072BD+0.58CD-1.60A2-3.25B2-2.27C2-4.25D2。

回歸二次方程的方差顯著性檢驗(yàn)分析結(jié)果見表3。

由表3可以看出該二次方程模型極顯著，回歸系數(shù)Adj R-Squared=0.94，Pred R-Squared=0.88，R-Squared=0.96，失擬項(xiàng)p=0.904 1＞0.05不顯著，表明試驗(yàn)結(jié)果和數(shù)學(xué)模型擬合良好，可用此模型分析響應(yīng)值的變化，推測試驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)，通過Design-Expert 7.1.4分析得出，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，超聲輔助酶法提取黑靈芝三萜有效成分的最優(yōu)工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)81.19%、酶解時(shí)間50.46 min、加酶量4.96%、料液比1∶26.60 g/mL。在此工藝條件下預(yù)測三萜提取率理論值為20.72 mg/g。結(jié)合現(xiàn)實(shí)條件，提取工藝的最佳條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)81.0%、酶解時(shí)間50 min、加酶量5.0%和料液比1∶27.0 g/mL。3次提取后Y達(dá)到20.81 mg/g。

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析表

為更加直觀地表達(dá)各因素交互作用對黑靈芝三萜提取率的影響，可以固定其中2個(gè)因素的值為零水平對應(yīng)的值，考慮另2個(gè)因素對三萜提取率的影響，根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)曲面圖和等高線圖。由圖2可知：曲面越陡峭，表明該因素對黑靈芝三萜提取率的影響越顯著，響應(yīng)值也越大；從等高線可以得出三萜提取率的最佳條件應(yīng)該在圓心處。

圖2 響應(yīng)面提取黑靈芝三萜類成分交互影響圖

2.2 黑靈芝中三萜成分的最佳提取工藝的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化

由于各輸入樣本和輸出樣本的單位和數(shù)量級不同，為消除樣本數(shù)據(jù)其不一致的影響，在MATLAB R2014a軟件中采用函數(shù)mapminmax實(shí)現(xiàn)樣本數(shù)據(jù)的歸一化處理，將樣本數(shù)據(jù)映射到[-1，1]區(qū)間上，數(shù)據(jù)處理后能夠減少網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)時(shí)間，同時(shí)加速神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的收斂，提高擬合精度，網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練完成后，對結(jié)果進(jìn)行反歸一化操作，得到原始數(shù)據(jù)范圍內(nèi)的實(shí)際值。選取S型的正切函數(shù)tansig作為輸入層與隱含層之間的傳遞函數(shù)，線性函數(shù)purelin作為隱含層和輸出層之間的傳遞函數(shù)，用函數(shù)trainlm來訓(xùn)練網(wǎng)絡(luò)，通過有限次嘗試，選擇合適BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型。

利用響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)訓(xùn)練網(wǎng)絡(luò)時(shí)部分參數(shù)設(shè)置為net.trainParam.show=1 000，net.trainParam.lr=0.005，net.trainParam.mc=0.002，net.trainParam.epochs=200。

訓(xùn)練函數(shù)采用net=train（net，P，T），其中P、T分別是歸一化后的輸入、輸出樣本，將29組試驗(yàn)數(shù)據(jù)作為輸入樣本，以黑靈芝三萜提取率作為待建立模型輸出層的響應(yīng)信號，通過改變隱含層的神經(jīng)元數(shù)，比較不同網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練模型的范化能力，確定隱含層的最佳神經(jīng)元個(gè)數(shù)，隱含層神經(jīng)元數(shù)范圍根據(jù)經(jīng)驗(yàn)式（3）確定，通過試錯(cuò)法多次改變隱含層神經(jīng)元個(gè)數(shù)。訓(xùn)練樣本的均方誤差函數(shù)（MSE）、決定系數(shù)（R2）作為神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的性能指標(biāo)，衡量網(wǎng)絡(luò)對訓(xùn)練樣本的學(xué)習(xí)程度，使用平均絕對誤差函數(shù)（MAPE）作為指標(biāo)評價(jià)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測能力。MSE、R2和MAPE分別用式（4）～（6）計(jì)算。

式中：n為輸入層神經(jīng)元的數(shù)目；m為輸出層神經(jīng)元的數(shù)目；a為1到10之間的常數(shù)。

式中：Siexp、Si分別為試驗(yàn)值和樣本的預(yù)測值；n為樣本數(shù)量。

根據(jù)經(jīng)驗(yàn)式（3）可知人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型隱含層中神經(jīng)元的數(shù)量為3～12，以最小的MSE和最大的R2作為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，選擇隱含層神經(jīng)元的最佳數(shù)目。在經(jīng)過多次神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練之后，最小的MSE和最大的R2分別為0.83和0.90。將試驗(yàn)真實(shí)值與訓(xùn)練和測試網(wǎng)絡(luò)每一步得到的預(yù)測數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，其擬合效果見圖3。訓(xùn)練、驗(yàn)證、測試及所有數(shù)據(jù)的相關(guān)系數(shù)（R2）分別為0.90和0.92?？梢钥闯鏊⒌腂P模型對于訓(xùn)練樣本和測試樣本都有很好的逼近能力，相關(guān)系數(shù)都在0.90以上，可見該網(wǎng)絡(luò)模型對所有的試驗(yàn)數(shù)據(jù)具有較好的預(yù)測能力，可用此神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型對超聲輔助酶法提取黑靈芝三萜類成分進(jìn)行預(yù)測。由表2可以看出BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測值與試驗(yàn)值能夠較好擬合。

圖3 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練和測試模型適配圖

2.3 遺傳算法對BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)提取黑靈芝三萜成分最佳工藝的優(yōu)化

利用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)所建立的模型作為遺傳算法的適應(yīng)度函數(shù)，進(jìn)一步對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化。采用遺傳算法對輸入變量進(jìn)行實(shí)數(shù)編碼，編碼長度為4，編碼的下限為[-1 -1 -1 -1]，上限為[1 1 1 1]。確定好適應(yīng)度函數(shù)、編碼長度、編碼上下限之后，設(shè)置遺傳算法的運(yùn)行參數(shù)。

參數(shù)設(shè)置：最大進(jìn)化代數(shù)2 000，種群大小100，交叉概率0.6，變異概率0.01。

利用遺傳算法對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型進(jìn)行尋優(yōu)，算法在第118代停止訓(xùn)練，此時(shí)適應(yīng)度值的改變幅度小于預(yù)設(shè)值，同時(shí)得到最佳工藝參數(shù)結(jié)果：乙醇體積分?jǐn)?shù)83.16%、酶解時(shí)間49.89 min、加酶量4.02%、料液比25.85 g/mL。在此工藝條件下預(yù)測三萜提取量理論值為21.11 mg/g。為方便試驗(yàn)操作，將工藝參數(shù)調(diào)整為乙醇體積分?jǐn)?shù)83.0%、酶解時(shí)間50.0 min、加酶量4.0%、料液比1∶26.0 g/mL。在此條件下對優(yōu)化工藝進(jìn)行驗(yàn)證，三萜提取率為21.07 mg/g，并與響應(yīng)面優(yōu)化的預(yù)測值、驗(yàn)證試驗(yàn)的實(shí)際值進(jìn)行比較，結(jié)果如表4所示。采用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合遺傳算法優(yōu)化得到的模型預(yù)測值與試驗(yàn)值的相對誤差小于響應(yīng)面優(yōu)化的相對誤差，且神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化的工藝條件所得到的三萜提取率更高，說明該神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型可以更好地預(yù)測不同工藝參數(shù)下超聲輔助酶法提取黑靈芝中三萜成分的提取效果。

圖4 遺傳算法尋優(yōu)迭代次數(shù)圖

表4 黑靈芝提取優(yōu)化結(jié)果對比表

3 結(jié)論

考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、酶解時(shí)間、加酶量和料液比對黑靈芝中三萜類成分提取率的影響。設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，并在其數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，建立BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型結(jié)合遺傳算法對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)測優(yōu)化，得到超聲輔助酶法提取黑靈芝三萜類成分的最佳工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)83.16%、酶解時(shí)間49.89 min、加酶量4.02%、料液比1∶25.85 g/mL。在此工藝條件下預(yù)測的三萜提取率理論值為21.11 mg/g?？梢夿P神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合遺傳算法尋優(yōu)的方法具有較強(qiáng)的可靠性，能較好地實(shí)現(xiàn)超聲輔助酶法提取黑靈芝三萜類成分的工藝參數(shù)的優(yōu)化。