陳璟州，丁一格，宋梓虢，孫珂欣，王小龍

（西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西楊凌 712100）

自20 世紀80 年代以來，基因編輯技術(shù)迅速發(fā)展，它能在短時間內(nèi)實現(xiàn)基因的定向突變，是現(xiàn)代生物史上的一次重大進步。早期的基因編輯主要利用DNA 同源重組原理，通過設計DNA 同源片段替代靶基因片段，從而達到在基因組中實現(xiàn)單堿基編輯的目的。應用這一原理的基因編輯技術(shù)主要有ZFN（Zinc-Finger Nucleases）系統(tǒng)、TALEN（Transcription Activator-Like Effector Nuclease）系統(tǒng)及CRISPR/Cas9 系統(tǒng)。

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是應用最廣泛的基因編輯系統(tǒng)，它來源于細菌和古生菌免疫防御機制，能夠通過 RNA指導的Cas 核酸酶對靶向基因進行修飾。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)會引入DNA 的雙鏈斷裂，在外源供體存在的情況下利用同源重組（Homologous Recombination，HDR）機制實現(xiàn)單堿基替換；與此同時，細胞啟用非同源末端修復（Non-homologous End-Joining，NHEJ）機制會與HDR 進行競爭性修復，產(chǎn)生非預期的插入或缺失（Insertions/Deletions，Indels）。故 而CRISPR/Cas9 系統(tǒng)進行單堿基的替換往往十分低效。

在此背景下，單堿基編輯技術(shù)應運而生。單堿基編輯技術(shù)對CRISPR/Cas9 系統(tǒng)中的Cas 蛋白進行改造，使其失去核酸酶切割活性或僅能切割單鏈產(chǎn)生缺口，堿基編輯技術(shù)基于堿基脫氨原理（A→I、G→U），將改造后Cas9 蛋白和脫氨酶進行融合，依靠sgRNA（Small Guide RNA）將堿基編輯酶錨定到靶位點，通過DNA的復制和修復，實現(xiàn)了不需要引入DNA 雙鏈斷裂就可進行單堿基轉(zhuǎn)換的精確編輯，提高了堿基編輯的精確度和效率。經(jīng)過多年的優(yōu)化改造，目前已衍生出了多種系統(tǒng)以應對不同的堿基編輯要求，可分為實現(xiàn)C→T 的胞嘧啶堿基編輯系統(tǒng)（Cytosine Base Editor，CBE）與實現(xiàn)A→G 的腺嘌呤堿基編輯系統(tǒng)（Adenine Base Editor，ABE）以及最新的能實現(xiàn)12 種堿基的任意變化的引導編輯系統(tǒng)（Prime Editing，PE），本文主要介紹以上3 種堿基編輯系統(tǒng)的建立過程、原理、優(yōu)缺點及其在動物育種中的應用，并對單堿基編輯技術(shù)發(fā)展進行展望。

1 單堿基編輯技術(shù)的創(chuàng)建與優(yōu)化

1.1 單堿基編輯技術(shù)的創(chuàng)建 單核苷酸變異（Single Nucleotide Variants，SNVs）是動植物產(chǎn)生性狀變異的遺傳基礎，也是人類疾病發(fā)生的主要原因之一，其對動植物育種、基因治療、藥物開發(fā)等方面具有重要意義。因此，開發(fā)一種精確且高效實現(xiàn)堿基替換的技術(shù)顯得尤為重要，在此背景下，研究人員開發(fā)了單堿基編輯系統(tǒng)。

1.1.1 CBE 的建立與原理 2016 年，Komor 在Nature雜志上首次報道了基于CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，且不需要引入DNA 雙鏈斷裂即可進行單堿基轉(zhuǎn)換的基因編輯技術(shù)——CBE。與CRISPR/Cas9 系統(tǒng)相比，CBE 在原系統(tǒng)基礎上改造了Cas9 蛋白（dead Cas9、dCas9），并添加了胞嘧啶脫氨酶。Komor對野生型Cas9 蛋白上引入2 個氨基酸突變Asp10Ala 和His840Ala，在去除Cas9 蛋白剪切DNA 雙鏈的能力的同時，保留其結(jié)合DNA 靶位點的活性；而胞嘧啶脫氨酶有將胞嘧啶（C）脫去氨基變?yōu)槟蜞奏ぃ║）的能力。該系統(tǒng)工作時，guide RNA 將dCas9 引導至靶位點，dCas9 與DNA 雙鏈結(jié)合但不發(fā)生切割，胞嘧啶脫氨酶使靶位點上的胞嘧啶（C）脫去氨基變?yōu)槟蜞奏ぃ║），當DNA 發(fā)生復制時，該靶位點上的尿嘧啶（U）會變成胸腺嘧啶（T），而DNA 雙鏈中互補鏈中靶位點互補的堿基也會由鳥嘌呤（G）變?yōu)橄汆堰剩ˋ），從而實現(xiàn)G:C 與A:T 堿基對的替換（圖1）。

圖1 胞嘧啶堿基編輯系統(tǒng)的工作示意圖[5]

為進一步提高編輯效率，Komor還挑選了4種胞嘧啶脫氨酶進行測試，分別是人類源AID 酶和APOBEC3G 酶、鼠源APOBEC1 酶和來自七鰓鰻的CAD1 酶，體外實驗證明，鼠源APOBEC1 酶的脫氨基活性最高，當其與dCas9 蛋白的氨基端融合時，它們之間以一段XTEN 連接器連接（一段非結(jié)構(gòu)重組多肽，目的在于提高融合蛋白的穩(wěn)定性），XTEN 連接器的長度影響脫氨基窗口的大小，越長則窗口越大，且其長度的合理增加也會使脫氨基效率得到提升。研究證明，當XTEN 連接器長度為16AA 時，脫氨基精度與脫氨基效率之間能夠取得最佳平衡，脫氨基窗口大小為5 nt，在前間隔序列鄰近基序（PAM）位點前的4～8 個核苷酸。APOBEC1-XTEN-dCas9 結(jié)構(gòu)為第一代CBE 系統(tǒng)，稱為BE1。

2016 年，日本科學家基于AID（Activation-Induced Cytidine Deaminase，AID）同源PmCDA1 和dCas9 或Cas9n 以及鳥嘌呤糖苷化酶抑制子UGI 的融合，開發(fā)了有別于BE1 的一種堿基編輯系統(tǒng)；同年，Ma 等也發(fā)現(xiàn)DNA 堿基編輯的新方法，開發(fā)了基于哺乳動物的靶向AID 介導的核苷酸突變（TAM），通過把誘導抗體高頻突變的胞嘧啶脫氨酶AID 與核酸酶缺陷的Cas9蛋白（dCas9）融合，在sgRNA 的引導下靶向結(jié)合目標DNA 序列，使胞嘧啶和鳥嘌呤可以隨機地向其他3 個堿基轉(zhuǎn)變。

1.1.2 ABE 的建立與原理 2017 年，Gaudelli 等于Nature 雜志上發(fā)表文章，闡述了ABE 的研發(fā)過程及原理（圖2）。相較于CBE，ABE 將胞嘧啶脫氨酶替換成了腺嘌呤脫氨酶。在ABE 堿基編輯系統(tǒng)的工作過程中，腺苷被水解去氨酸產(chǎn)生肌苷，肌苷在聚合酶活性位點的限制下能與胞嘧啶（C）配對，并被讀取或者復制為鳥嘌呤（G）。腺嘌呤脫氨酶對DNA 鏈上的腺嘌呤產(chǎn)生脫氨基作用是創(chuàng)建ABE 系統(tǒng)的理論基石，但是在此前的研究中，腺嘌呤脫氨酶都只能作用于游離腺苷，無法作用于DNA 鏈上的腺嘌呤，故而尋找能對于DNA 鏈上腺嘌呤產(chǎn)生作用的腺嘌呤脫氨酶成為解決問題的關(guān)鍵。Gaudelli 等對于一些可能具有相關(guān)腺苷脫氨能力的酶進行了改造與篩選，在此過程中，一種存在于大腸桿菌中名叫TadA 的脫氨酶進入其視線。Gaudelli 等研究發(fā)現(xiàn)，A106V 和D108N 突變的TadA 酶具有DNA 鏈上的腺嘌呤脫氨基能力，將改造的TadA 酶（TadA*）與Cas9 D10A 刻痕酶（取代了dCas9，便于定位信號的添加）結(jié)合，并在C 端加上定位信號（NLS），結(jié)構(gòu)為TadA*-XTEN-nCas9-NLS，構(gòu)成了第一代腺嘌呤堿基編輯系統(tǒng)（ABE），被稱為ABE1.2。

圖2 腺嘌呤堿基編輯系統(tǒng)的工作示意圖[10]

1.1.3 PE 的建立與原理 2019 年，Anzalone 等在Nature 雜志上介紹了PE 的建立過程和原理（圖3），它能夠?qū)崿F(xiàn)目標序列堿基的插入刪除和12 種類型的堿基自由轉(zhuǎn)換。PE 系統(tǒng)的主要元件包括Cas9n（Cas9 H840A位點突變）蛋白、逆轉(zhuǎn)錄酶（Reverse Transcriptase，RT）、編輯引導RNA（peg RNA，既能指示目標位點，又包含取代目標DNA 核苷酸的新遺傳信息）。其主要工作原理為在peg RNA 的引導下，Cas9n 蛋白結(jié)合到目標位點并切斷靶DNA，斷裂的靶DNA 鏈與peg RNA 上的PBS 序列互補結(jié)合，RT 酶使peg RNA 發(fā)生逆轉(zhuǎn)錄反應，待逆轉(zhuǎn)錄反應完成后，DNA 切口處出現(xiàn)3'flap 結(jié)構(gòu)和5'flap 結(jié)構(gòu)的動態(tài)平衡（3'flap 結(jié)構(gòu)上有目標突變，而5'flap 結(jié)構(gòu)上沒有），但5'flap 結(jié)構(gòu)更易被結(jié)構(gòu)特異性內(nèi)切酶切除，3'flap 結(jié)構(gòu)和5'flap 結(jié)構(gòu)的動態(tài)平衡會向5'flap 結(jié)構(gòu)這邊傾斜，之后經(jīng)過DNA 鏈的連接和修復便實現(xiàn)了目標序列的替換。Li 等經(jīng)過大量實驗分析證明，PE 系統(tǒng)編輯效率與同源修復相當且副產(chǎn)物少，脫靶效應也比傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9 技術(shù)低。

圖3 引導編輯系統(tǒng)的工作示意圖[13]

由于PE 于2019 年被報道，只在少量類型的細胞中被測定過效率，活體驗證結(jié)果寥寥無幾。Liu 等首先構(gòu)建了單核苷酸突變的小鼠，用PE3 系統(tǒng)誘導小鼠N2a 細胞中的X 連接雄激素受體（Ar）基因和同位素蛋白Hox-D13（Hoxd13）基因中的點突變，設計了獨特的sgRNA，并在隨后的實驗結(jié)果觀察中證明了體外篩選pegRNAs 的必要性，揭示了現(xiàn)階段PE 系統(tǒng)體內(nèi)效率低下的缺陷，作為介紹了使用 PE 在動物中生成有針對性的堿基突變的第1 份報告，這份報告證明了人類細胞中的主要編輯系統(tǒng)在動物中的可行性，為其后PE 系統(tǒng)的研究和發(fā)展以及使用提供理論基礎。

1.2 單堿基編輯技術(shù)的優(yōu)化

1.2.1 堿基編輯效率的優(yōu)化 Komor 等將尿嘧啶羰基化酶抑制蛋白（UGI）融合到BE1 系統(tǒng)中，研發(fā)了第2代系統(tǒng)BE2，將編輯效率提高至20%。為進一步提高編輯效率，研究團隊對dCas9 進行了改造，恢復第840位氨基酸突變，保留Asp10Ala 變異，使dCas9（A840H）蛋白具有DNA 單鏈的切口酶活性，這樣可以只切割靶位點的非編輯鏈，使細胞啟動錯配修復機制（MMR）后只能以含U 的單鏈為模板進行修復，大大提高了編輯效率，該系統(tǒng)被稱為BE3，編輯效率達37%。此外，Koblan 等通過增加個數(shù)不同的核定位信號（Nuclear Localization Signal，NLS）以及使用不同科研人員優(yōu)化的密碼子序列等方法構(gòu)建了BE4max 和AncBE4max 這2種可在各種哺乳動物細胞進行高效編輯的堿基編輯器。

第1 代腺嘌呤堿基編輯系統(tǒng)ABE1.2 效率為3.2%±0.88%，無法滿足在研究工作中進行基因編輯的需要，為此Gaudelli 等構(gòu)建了 ABE1.2 變種庫，并提高抗生素篩選濃度，將ABE1.2 發(fā)展至ABE2.1，提高至14%±2.4% 編輯效率；又將TadA 序列與dead Cas9 融合構(gòu)建成隨機突變文庫，通過結(jié)合卡那霉素、ABE 恢復霉素等抗性基因與相應的抗生素進行篩選，經(jīng)過先后7 輪改造后，將ABE 系統(tǒng)升級至ABE7.10，編輯效率達53.0%，編輯窗口為4～6 個核苷酸。2021 年，為對現(xiàn)有植物腺嘌呤堿基編輯器進行優(yōu)化，中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所作物有害生物功能基因組研究創(chuàng)新團隊對TadA7.10 衍生版本TadA8e、TadA8.17、TadA8.20 進行評估，并在此基礎之上開發(fā)出全新版本TadA9，將多個測試靶位點處的堿基編輯效率逐步提高至90% 以上，并證實了TadA9 和TadA8e 能與眾多Cas9 衍生蛋白和同源蛋白廣泛兼容，包括SpCas9n、SpCas9n-NG、SpRYn 和ScCas9n。

1.2.2 堿基編輯窗口的優(yōu)化 不同類型的堿基編輯系統(tǒng)的編輯窗口不同，在實際研究應用中，也需要對編輯活性窗口做出相應的改動。當堿基編輯器被用于精準改變某個特定的堿基時，過大的脫氨化窗口會導致窗口內(nèi)非靶標堿基的編輯。由于CBE 只能對胞嘧啶脫氨酶活性位點附近的C 脫氨基，而胞嘧啶脫氨酶rAPOBEC1 的活性窗口通常有5 個核苷酸，會使活性窗口中非靶向的堿基也發(fā)生替換作用從而發(fā)生脫靶，Kim 等對胞嘧啶脫氨酶進行突變，在降低酶的活性的同時，通過改變底物的結(jié)合和構(gòu)象直接降低底物進入胞嘧啶脫氨酶活性區(qū)域的能力，將單堿基編輯系統(tǒng)的活性窗口5 個核苷酸縮小至1～2 個核苷酸。

然而，當堿基編輯系統(tǒng)被用于篩選功能基因、進行可變剪接、編輯調(diào)控元件等時，較大的編輯活性窗口更有利于研究。Zhang 等將10 個非序列特異性的ssDNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（ssDBD）與CBE 進行融合，篩選發(fā)現(xiàn)將Rad51 蛋白的ssDBD 融合到APOBEC1 與Cas9n 之間能夠顯著提高堿基編輯活性，同時大幅擴大編輯窗口。此外，CP1012-ABEmax、CP1028-ABEmax、CP1041-ABEmax 和CP1249-ABEmax 堿基編輯器在保證效率與ABEmax 相當?shù)那闆r下，可將 4～8 位的堿基編輯窗口拓展為 4～12 位。

1.2.3 堿基編輯范圍的優(yōu)化 常用的堿基編輯器大部分都與化膿性鏈球菌的Cas9（SpCas9）蛋白進行融合使用，只能靶向含有NGG 或NGA 序列的PAM 位點，限制了其在基因組中的靶向范圍。因此，研究人員將SpCas9替換為其他Cas 蛋白，通過不同Cas 蛋白識別不同PAM，進而擴大堿基編輯系統(tǒng)在基因組中的編輯覆蓋度。Kim 等使用金黃色葡萄球菌的Cas9（SaCas9）、SaCas9 突變體（Sacas9-KKH）、SpCas9 突變體（SpCas9-VQR、SpCas9-EQR、SpCas9-VRER）替代SpCas9,識別含有NGG、NGA、NGAN、NGAG、NGGG、NNGRRT和NNNRRT 的PAM 序列，顯著擴大了單堿基基因編輯的靶向范圍；此外，通過dCpf1 和Sp-macCas9 的融合，科研人員突破CBE 之前只能識別富含GC 序列的PAM位點的限制，使識別范圍拓寬至富含AT 序列的PAM位點。

1.2.4 堿基編輯脫靶問題的優(yōu)化 堿基編輯在應用中的脫靶效應會造成無法預計的后果，為了更安全地利用堿基編輯技術(shù)，尋找一種科學快速的脫靶檢測手段勢在必行。2020 年，中國科學家建立了一種名為GOTI（Genome-wide Off-target analysis by Two-cell embryo Injection）的新型脫靶檢測技術(shù)，它提高了基因編輯技術(shù)脫靶檢測的敏感性，可以在不借助于任何脫靶位點預測技術(shù)的情況下發(fā)現(xiàn)之前的脫靶檢測手段無法發(fā)現(xiàn)的完全隨機的脫靶位點，為堿基編輯的脫靶研究提供了新的方法。其次，gRNA 特異性的改良對于脫靶問題的解決也具有重要意義，如在一定范圍內(nèi)適當調(diào)整gRNA長度也能降低脫靶效應；調(diào)整gRNA 上游5' 的發(fā)夾結(jié)構(gòu)可提高Cas9 和Cas12 的特異性，并將脫靶效應降低55 倍。此外，Cas9 蛋白的改造也是降低脫靶效應的手段。SpCas9-HF（經(jīng)過設計的高保真SpCas9 變種）在人體細胞基因編輯中表現(xiàn)出超常的準確性，同時，只表現(xiàn)出微量的脫靶效應；對于人類細胞基因組編輯，特異性增強的eSpCas9（K848A、K1003A、R1060A）可減少非目標鏈結(jié)合，從而增強基因編輯的特異性。

2 單堿基技術(shù)在動物育種中的應用

2017 年，Kim 等通過BE3 編輯小鼠胚胎基因和基因，建立了小鼠白化病和肌營養(yǎng)不良疾病模型；Zhang 等通過編輯斑馬魚胚胎的基因建立了模擬人類眼白化病的疾病模型；松陽洲實驗室利用HF2-BE2 高效編輯小鼠基因，建立了小鼠白化病模型，突出了利用基礎編輯器2 進行基因編輯的優(yōu)勢。

2018 年，Ryu 等將ABE7.10 包裹到雙反式剪接的AAV 病毒系統(tǒng)中，遞送到小鼠模型中進行無義突變的較正，成功治療了杜氏肌營養(yǎng)不良的小鼠疾病表型；Liu 等利用BE3 堿基編輯系統(tǒng)對兔MSTN 基因進行編輯，使其在外顯子的1 處發(fā)生胞嘧啶（C）到胸腺嘧啶（T）的突變，從而提前產(chǎn)生終止密碼子使基因無法轉(zhuǎn)錄而失活，最終攜帶該位點突變的突變型兔相較于野生型兔顯示出了雙肌表型；Li 等結(jié)合BE3和體細胞核移植方法，通過在豬胚胎成纖維細胞中編輯基因和基因建立了無臉巨口綜合征和皮膚白化病的疾病模型。

2019 年，賴良學課題組將胚胎注射和體細胞核移植等動物創(chuàng)制方法與單堿基編輯技術(shù)相結(jié)合，分別在豬的細胞、胚胎和個體3 個水平上對豬的多基因位點進行單堿基編輯，培育出了單基因突變的早衰豬模型和杜氏肌肉營養(yǎng)不良豬，同時也得到了與免疫機能相關(guān)的多基因突變的缺乏B 細胞、T 細胞和NK 細胞的免疫缺陷豬；Zhou 等把BE3 的編碼mRNA 和sgRNA注射到綿羊受精卵中，對細胞因子信號抑制2 基因（Suppressor Cytokine Signaling 2，Socs2）實現(xiàn)了目的性的精準突變，獲得了在體型、體重和產(chǎn)奶量等性狀上明顯優(yōu)于野性型羔羊且生長狀況良好的基因編輯羊，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)Socs2 Indels 也可以在炎癥腸炎狀況下有效保護骨骼健康；Li 等、Wang 等結(jié)合BE3 系統(tǒng)和顯微注射技術(shù)對單細胞胚胎中的成纖維細胞生長因子5（）編碼基因進行高效精確的堿基編輯，后續(xù)檢驗發(fā)現(xiàn)，基因編輯山羊毛纖維顯著長于野生型山羊，毛囊也顯著多于野生型山羊。

2020 年，Zhou 等根據(jù)骨形態(tài)生成蛋白受體1B（）基因p.Q249R 位點的序列信息設計了包含目標突變的sgRNA，將其與ABE（ABE7.10、ABEmax或 xCas9-ABE）質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入綿羊成纖維細胞中篩選了高效的ABE 版本，之后結(jié)合胚胎顯微注射技術(shù)成功創(chuàng)制了攜帶高效率編輯基因的后代羔羊，證明了利用ABE 系統(tǒng)在大型動物中進行單堿基編輯的可行性，并為改善動物生產(chǎn)提供了替代方法，有助于驗證農(nóng)業(yè)重要特征的關(guān)鍵SNP。

表1 堿基編輯系統(tǒng)在動物中的應用

總而言之，單堿基編輯技術(shù)在動物育種中相較于之前的前3 代基因編輯技術(shù)極大地提升了編輯效率和編輯精度，在前3 代技術(shù)覆蓋的大部分領(lǐng)域都能發(fā)揮重大的作用，能夠有效地推進遺傳改良的進度，提升改良育種效果。

3 單堿基編輯技術(shù)發(fā)展與展望

堿基編輯技術(shù)是在CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的基礎上發(fā)展建立起來的。相比于 CRISPR/Cas 介導的 HDR 編輯，其最大優(yōu)勢就是可以在不產(chǎn)生 DSB 的情況下實現(xiàn)高效精準的編輯，顯著提高基因編輯的精準度，在作物遺傳改良與家畜育種研究中，堿基編輯技術(shù)展現(xiàn)了很好的應用前景，但仍存在一些不足。一是效率問題，雖然相較于之前的基因編輯技術(shù)，單堿基編輯系統(tǒng)的打靶效率顯著提高，但大部分位點效率在20%～40%（植物中），僅在個別位點上能夠達到60%以上，PE 編輯系統(tǒng)的效率更為低下；二是應用范圍的限制，大多數(shù)單堿基編輯系統(tǒng)都是對于特定位置堿基進行編輯的，雖然現(xiàn)在許多研究人員都對Cas 蛋白進行了改造，產(chǎn)生了多種可以選擇的PAM 位點，但還是無法滿足基因編輯的實際應用需求；三是脫靶現(xiàn)象，相較于常規(guī)CRISPR/Cas9 技術(shù)，單堿基編輯系統(tǒng)不需要產(chǎn)生DSB，顯著降低了脫靶效率，但仍存在一定的脫靶現(xiàn)象。未來的單堿基編輯技術(shù)將以這3 個問題為主要發(fā)展的方向，即開發(fā)出應用范圍更廣、編輯位點更精確、更低脫靶概率的單堿基編輯系統(tǒng)。

綜上所述，單堿基編輯技術(shù)雖然已經(jīng)在人類遺傳疾病研究及相關(guān)動物模型制備、藥物開發(fā)、動植物育種等方面顯現(xiàn)出巨大潛力，但并未完全滿足實際的基因編輯需求，在編輯精度和編輯效率上面還存有很大進步空間，在應用中也存在著一些限制，尤其是編輯窗口的限制。因此，如何使堿基編輯系統(tǒng)擺脫編輯窗口的限制，實現(xiàn)sgRNA 覆蓋范圍內(nèi)所有位點的高效率精準編輯，將是未來研究中的重大課題。隨著單堿基編輯技術(shù)的不斷完善成熟，相信單堿基編輯技術(shù)會成為強有力的生物研究工具，極大地推動全世界生物科學相關(guān)領(lǐng)域的快速發(fā)展。