王今今，曹德云，王璐璐，常昕昱

鐵嶺市中心醫(yī)院，遼寧 鐵嶺112000

糖尿病已成為一種全球性的重大健康問題。心血管疾病是2型糖尿病最常見的并發(fā)癥，其發(fā)病率和死亡率常常高于其他并發(fā)癥[1]。血管內(nèi)皮細(xì)胞是維持心血管穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵細(xì)胞，在高糖刺激下，線粒體電子傳遞鏈中活性氧的產(chǎn)生增加，引起氧化應(yīng)激。由于機(jī)體抗氧化防御機(jī)能減弱，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮功能損傷和功能障礙[2-3]，在糖尿病心血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要作用。但目前臨床仍缺乏有效的治療對(duì)策。

竹節(jié)參為五加科人參屬多年生草本植物，是我國民間常用中藥，竹節(jié)參總皂苷(total saponins of panax japonicus，SPJ)是其主要活性成分。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，SPJ是一種具有較強(qiáng)自由基清除能力的抗氧化劑，具有減輕炎癥、降血糖、抑制細(xì)胞凋亡的作用[4-5]。有文獻(xiàn)報(bào)道，SPJ IVa具有明顯的胰島素增敏活性，對(duì)2型糖尿病及其并發(fā)癥具有潛在治療作用[6]。因此，本研究通過觀察SPJ對(duì)高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞EVC-304損傷的影響，探討其潛在分子機(jī)制，以期為防治糖尿病心血管病變提供參考。

1 材料

1.1 細(xì)胞EVC-304細(xì)胞(上?；鄯f生物科技有限公司，貨號(hào)：11668019)。

1.2 藥物與試劑竹節(jié)參(亳州億弘堂藥業(yè)有限公司，貨號(hào)：18226912020)。DMEM高糖培養(yǎng)基、優(yōu)質(zhì)北美胎牛血清(美國Gibco公司，貨號(hào)：11965092、12483020)；瞬時(shí)受體電位陽離子通道蛋白6(transient receptor potential cation channel 6，TRPC6)小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)及其陰性對(duì)照(si-NC)(廣州銳博生物公司，貨號(hào)stB0005258A-1-5、siN0000001-1-10)；TRPC6過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-TRPC6)、質(zhì)?？蛰d體(pcDNA)(上海澤葉生物科技有限公司，貨號(hào)：ZY1001、ZY1002)；丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPX)活性檢測試劑盒(北京索萊寶生物科技公司，貨號(hào)：BC0020、BC0175、BC1195)；Annexin V 凋亡檢測試劑盒(FITC/PI雙染法)、放射免疫沉淀測定(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)裂解液、Trizol試劑[生工生物工程(上海)股份有限公司，貨號(hào)：E606336、C500005、B511311]；PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SuperReal熒光定量預(yù)混試劑(大連takara生物公司，貨號(hào)：RR037A、FP216)；兔源TRPC6抗體、兔源磷酸甘油醛脫氫酶(phosphoglyceraldehyde dehydrogenase，GAPDH)抗體、兔源B細(xì)胞淋巴瘤(B cell lymphoma 2，Bcl-2)抗體、兔源Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)抗體、山羊抗兔IgG[上海艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司，貨號(hào)：ab62461、ab245355、ab59348、ab53154、ab205718]；Lipofectamine 2000(北京沃比森科技有限公司，貨號(hào)：11668019)；二喹啉甲酸(bicinchorninic acid，BCA)法蛋白定量試劑盒(上海聯(lián)邁生物工程有限公司，貨號(hào)：LM80815-500)。

1.3 儀器FACSCanto II型流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；DYY-12C電泳儀電源、DYCZ-20H垂直電泳槽、DYCZ-40A電轉(zhuǎn)儀(北京六一儀器廠)；mμlISKANMK3型酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

2 方法

2.1 SPJ制備參照覃玉娥等[7]方法制備SPJ，具體如下：將竹節(jié)參粉碎，按照質(zhì)量體積比110加入60%乙醇提取后，用正丁醇萃取、濃縮，將獲得的正丁醇浸膏溶于水，過D101大孔樹脂，依次用水、30%乙醇、60%乙醇、90%乙醇沖洗，取60%乙醇洗脫部位，經(jīng)硅膠柱層析分離、三氯甲烷-甲醇梯度洗脫后，烘干洗脫液，即獲得竹節(jié)參總皂苷。實(shí)驗(yàn)時(shí)用無菌水配置所需濃度，過濾除菌后備用。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)分組EVC-304細(xì)胞采用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基于5%CO2、37 ℃ 恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)按照13比例進(jìn)行傳代，每周換液2～3次，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用葡萄糖濃度為 5.5 mmol·L-1的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞48 h記為對(duì)照組；采用葡萄糖濃度為30 mmol·L-1的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞48 h記為高糖組；竹節(jié)參總皂苷低、中、高劑量組為分別給予含50 mg·L-1、100 mg·L-1、200 mg·L-1的SPJ與30 mmol·L-1葡萄糖的培養(yǎng)基共同處理細(xì)胞48 h；EVC-304細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染si-NC、si-TRPC6，轉(zhuǎn)染成功后收集細(xì)胞，采用葡萄糖濃度為30 mmol·L-1的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞48 h記為 si-NC 組、si-TRPC6組；EVC-304細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染si-NC、si-TRPC6，轉(zhuǎn)染成功后收集細(xì)胞，用含 200 mg·L-1的SPJ與30 mmol·L-1葡萄糖的培養(yǎng)基共同處理48 h后記為竹節(jié)參總皂苷+pcDNA組、竹節(jié)參總皂苷+pcDNA-TRPC6組。細(xì)胞轉(zhuǎn)染參照Lipofectamine 2000使用標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行。

2.3 MDA含量及SOD、GPX活性的檢測分別收集上述各組EVC-304細(xì)胞至離心管中，加入提取液，超聲波破碎細(xì)胞，離心收集上清液。參照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)流程測定MDA含量及SOD和GPX活性。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡收集按照上述分組進(jìn)行處理的各組EVC-304細(xì)胞，并懸浮在適量的結(jié)合緩沖液中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106mL-1。將 5 μL 的Annexin FITC、PI分別加到100 μL的細(xì)胞懸液中，避光條件下孵育15 min，隨后補(bǔ)加400 μL結(jié)合緩沖液，混勻后采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。

2.5 RT-qPCR檢測TRPC6mRNA的表達(dá)水平用Trizol試劑提取各組EVC-304細(xì)胞的總RNA。用PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將適量總RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，以cDNA為擴(kuò)增模板，按照SYBR Premix Ex Taq使用說明進(jìn)行qPCR反應(yīng)，反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，MgSO42.5 μL，dNTPs 2.5 μL，正反向引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，RNase-Free ddH2O補(bǔ)足體系至25 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性60 s，95 ℃變性60 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共36次循環(huán)。采用2-ΔΔCt法分析TRPC6mRNA 的表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.6 Western Blot檢測TRPC6、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平用RIPA裂解液提取各組EVC-304細(xì)胞的總蛋白，收集上清液，BCA法測定蛋白濃度。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上。將膜在5%脫脂牛奶中封閉 1 h，孵育一抗(TRPC6、Bcl-2和Bax的稀釋比例為1800、11 000、11 000)，4 ℃過夜。二抗(稀釋比例為13 000)孵育1 h，用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色反應(yīng)。以GAPDH為內(nèi)參，凝膠成像系統(tǒng)分析目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

3 結(jié)果

3.1 SPJ對(duì)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的影響與對(duì)照組比較，高糖組EVC-304細(xì)胞上清液中MDA含量顯著升高(P<0.05)，SOD和GPX活性顯著降低(P<0.05)；與高糖組比較，竹節(jié)參總皂苷低、中、高劑量組EVC-304細(xì)胞上清液中MDA含量顯著降低(P<0.05)，SOD和GPX活性顯著升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性。見表2。

表2 SPJ對(duì)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的影響

3.2 SPJ對(duì)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響與對(duì)照組比較，高糖組EVC-304細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與高糖組比較，竹節(jié)參總皂苷低、中、高劑量組EVC-304細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性。見表3，圖1。

表3 SPJ對(duì)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響

注：a：凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)圖；b：細(xì)胞凋亡流式圖；A：對(duì)照組；B：高糖組；C：竹節(jié)參總皂苷低劑量組；D：竹節(jié)參總皂苷中劑量組；E：竹節(jié)參總皂苷高劑量組圖1 SPJ對(duì)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響

3.3 SPJ對(duì)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞中TRPC6表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，高糖組EVC-304細(xì)胞TRPC6mRNA、TRPC6蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與高糖組比較，竹節(jié)參總皂苷低、中、高劑量組EVC-304細(xì)胞TRPC6mRNA、TRPC6蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性。見表4，圖2。

注：A：對(duì)照組；B：高糖組；C：竹節(jié)參總皂苷低劑量組；D：竹節(jié)參總皂苷中劑量組；E：竹節(jié)參總皂苷高劑量組圖2 TRPC6蛋白表達(dá)圖

表4 SPJ對(duì)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞中TRPC6表達(dá)的影響

3.4 抑制TRPC6表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響與si-NC組比較，si-TRPC6組EVC-304細(xì)胞中TRPC6蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，MDA含量、凋亡率、Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，SOD和GPX活性、Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見表5，圖3。

3.5 過表達(dá)TRPC6逆轉(zhuǎn)SPJ對(duì)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用與高糖組比較，竹節(jié)參總皂苷組MDA含量、凋亡率、Bax及TRPC6蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，SOD和GPX活性、Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與竹節(jié)參總皂苷+pcDNA組比較，竹節(jié)參總皂苷+pcDNA-TRPC6組MDA含量、凋亡率、Bax及TRPC6蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，SOD和GPX活性、Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見表6，圖4。

表5 抑制TRPC6表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響

注：A：TRPC6和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)圖；B：細(xì)胞凋亡流式圖圖3 抑制TRPC6表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響

表6 TRPC6過表達(dá)逆轉(zhuǎn)SPJ對(duì)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用

注：a：TRPC6和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)圖；b：細(xì)胞凋亡流式圖；A：高糖組；B：竹節(jié)參總皂苷組；C：竹節(jié)參總皂苷+pcDNA組；E：竹節(jié)參總皂苷+pcDNA-TRPC6組圖4 TRPC6過表達(dá)逆轉(zhuǎn)SPJ對(duì)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用

4 討論

研究表明，葛根素、淫羊藿苷等中藥活性成分具有免疫增強(qiáng)、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、改善心腦血管等多種生物學(xué)功能，被認(rèn)為對(duì)糖尿病心血管病變具有潛在治療作用[8-11]。SPJ是近年國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)中藥活性成分，研究指出，SPJ可降低D-半乳糖誘導(dǎo)的大鼠大腦衰老，減輕自然衰老大鼠大腦的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)自然衰老大鼠結(jié)腸內(nèi)緊密連接蛋白表達(dá)的減少[12-13]。SPJ還能改善肝功能，降低血清脂質(zhì)水平，在預(yù)防肝纖維化方面具有巨大潛力[14]。此外，SPJ在心腦血管疾病防治方面療效顯著，其通過清除氧化應(yīng)激引起活性氧的過度生成和積累，減輕心肌缺血損傷和心肌細(xì)胞凋亡，改善心臟組織形態(tài)和功能，對(duì)心肌缺血損傷大鼠具有明顯的心臟保護(hù)作用[15-16]。本研究顯示，SPJ呈劑量依賴效應(yīng)地升高抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，降低促凋亡蛋白Bax表達(dá)，減弱高糖誘導(dǎo)的EVC-304細(xì)胞凋亡。糖尿病心血管疾病與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，在高糖刺激下過量活性氧生成和積累會(huì)改變細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞和脂質(zhì)過氧化，最終導(dǎo)致關(guān)鍵酶的丟失，從而引起細(xì)胞損傷[17]。MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，其含量高低是反應(yīng)細(xì)胞損傷程度的指標(biāo)[18]。SOD和GPX是細(xì)胞內(nèi)對(duì)抗氧化損傷的第一道防線，其活性降低可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧的過度累積，進(jìn)而激活Caspase途徑，促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生[19-21]。本研究顯示，SPJ能夠降低高糖誘導(dǎo)的EVC-304細(xì)胞中MDA含量，升高SOD和GPX活性，并呈明顯的量效關(guān)系。表明SPJ能夠拮抗高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷。

TRPC包括TRPC1～TRPC17，是細(xì)胞膜上Ca2+的非特異性陽離子通道，其通過與G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平，參與調(diào)節(jié)平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞功能[22-25]。Chen等[26]研究顯示，TRPC6的激活可能是導(dǎo)致輕度腦損傷內(nèi)皮功能障礙的關(guān)鍵因素，使用TRPC6抑制劑對(duì)腦損傷致內(nèi)皮功能障礙具有顯著的保護(hù)作用。Lang等[27]發(fā)現(xiàn)在高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中TRPC6表達(dá)增加，抑制TRPC6能夠阻止高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和管腔形成，是糖尿病視網(wǎng)膜病變潛在治療靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖誘導(dǎo)后，EVC-304細(xì)胞中TRPC6表達(dá)顯著升高，而SPJ呈劑量依賴效應(yīng)地降低高糖對(duì)TRPC6表達(dá)的促進(jìn)作用，提示SPJ對(duì)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用與調(diào)控TRPC6表達(dá)有關(guān)。進(jìn)一步研究顯示，抑制TRPC6表達(dá)可降低細(xì)胞凋亡率，減輕高糖誘導(dǎo)的EVC-304細(xì)胞損傷和凋亡。此外，過表達(dá)TRPC6還能夠減輕竹節(jié)參總皂苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的EVC-304細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。以上研究結(jié)果表明，SPJ對(duì)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用可能與調(diào)控TRPC6表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，SPJ通過下調(diào)TRPC6的表達(dá)提高血管內(nèi)皮細(xì)胞的抗氧化能力，減輕高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和損傷，為SPJ用于防治糖尿病心血管病變提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。