楚宗麗 李亮杰 姬虹 程琴 孫君艷

摘要：為研究小麥Hsp70蛋白的相互作用，利用生物信息學(xué)方法，在全基因組范圍內(nèi)對(duì)小麥Hsp70基因家族進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行蛋白互作及可視化分析。結(jié)果表明，在全基因組范圍內(nèi)共鑒定到21個(gè)結(jié)構(gòu)域高度保守的Hsp70基因家族成員，亞細(xì)胞定位顯示主要分布于細(xì)胞質(zhì)，蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋與無(wú)規(guī)卷曲類型在每個(gè)蛋白中所占比重較大，二者之和大于70%，延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角所占比重較小，二者之和小于30%?；プ鞣治鼋Y(jié)果表明，TaHsp70-14、TaHsp70-6、TaHsp70-12、TaHsp70-16、TaHsp70-3，TaHsp70-8、TaHsp70-21、TaHsp70-20，TaHsp70-17和TaHsp70-11之間有相互作用，GO分析顯示所鑒定基因主要在分子功能、生物過(guò)程及細(xì)胞成分方面起作用。

關(guān)鍵詞：小麥;Hsp70;熱激蛋白;基因鑒定;蛋白互作

中圖分類號(hào)：S512.101 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）10-0037-07

小麥（Triticum aestivum L.）屬禾本科（Gramineae）麥屬（Tritium），是我國(guó)重要的糧食作物之一，高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)對(duì)保證國(guó)家糧食安全和社會(huì)穩(wěn)定具有重要意義。在小麥栽培中，常遭受低溫、高溫、水澇和干旱等非生物脅迫[1]，這些脅迫會(huì)導(dǎo)致生物膜破壞和蛋白質(zhì)的破壞，植株生理代謝發(fā)生紊亂，限制植株生長(zhǎng)，嚴(yán)重影響小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)[2-3]。

植物在進(jìn)化過(guò)程中形成了一系列應(yīng)對(duì)機(jī)制來(lái)響應(yīng)逆境脅迫[4]，熱激蛋白（heat shock proteins，Hsps）是植物由不同逆境脅迫（如高溫、干旱、寒冷、重金屬、過(guò)氧化和各種病原體攻擊等）誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類分子伴侶類型的應(yīng)激蛋白[5]，在逆境下大量表達(dá)，在植物適應(yīng)環(huán)境及抵御逆境中發(fā)揮重要作用[4，6]。Hsps廣泛存在于原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中，具有高度的保守性[7]。在正常的生長(zhǎng)發(fā)育中，它們負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)的折疊、組裝、易位和降解，具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)和膜的功能，并可在應(yīng)激條件下協(xié)助蛋白質(zhì)折疊[6]，維持細(xì)胞穩(wěn)定，在調(diào)控動(dòng)物、植物代謝和信號(hào)傳導(dǎo)等方面發(fā)揮作用[8-9]。

Hsps既是植物的應(yīng)激蛋白，又是必需蛋白，通常存在于植物的細(xì)胞質(zhì)、線粒體、葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等部位[10]，根據(jù)分子量的不同，可分為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和sHSP 5個(gè)家族[5]，這些不同家族的Hsps在不同作物中已經(jīng)被鑒定和研究[11-14]。Hsp70是真核細(xì)胞里最豐富的熱激蛋白之一，其表達(dá)水平受外界環(huán)境條件影響，擬南芥幼苗在生長(zhǎng)溫度發(fā)生急劇變化條件下HSP70家族基因的表達(dá)水平迅速增加[9-10]，在40 ℃高溫脅迫下水稻Hsp70基因在極短時(shí)間內(nèi)顯著表達(dá)[15]，40 ℃熱激小麥幼苗后，TaHSP70在黃化幼苗葉片中的表達(dá)增加，但在綠色幼苗中保持穩(wěn)定，并且在與小麥條銹病的不親和和親和互作過(guò)程中差異表達(dá)[16]，TaHSP70表達(dá)能被高溫處理、條銹菌和白粉菌侵染所誘導(dǎo)[17-18]，說(shuō)明在植物抗逆、抗病方面發(fā)揮著各種脅迫保護(hù)作用。HSP70基因家族在水稻[19]、玉米[20]、甘蔗[21]、辣椒[22]、鐵皮石斛[23]等作物中進(jìn)行了鑒定與分析，Hsp70家族在小麥的逆境等植物中已有研究[23]，但小麥基因組龐大，品種多，抗逆育種是一個(gè)復(fù)雜的工作，Hsp70基因家族分析研究仍需不斷深入。因此，本研究利用小麥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)資源，對(duì)小麥Hsp70基因家族進(jìn)行全基因組鑒定，并分析其理化性質(zhì)、蛋白互作關(guān)系，以期為小麥Hsp70基因的功能研究提供信息參考，為小麥抗性育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 注釋基因組序列獲取與Hsp70基因家族鑒定

從Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//plants.ensembl.org/）中獲取小麥基因組數(shù)據(jù)，下載小麥Hsp70的cds序列、DNA序列、蛋白質(zhì)序列、基因組注釋信息gff3文件。從Pfam（http：//pfam.xfam.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載Hsp70的隱馬爾科夫模型（Hidden Markov Model，簡(jiǎn)稱HMM）文件，Pfam編號(hào)為PF00012。使用擬南芥和水稻Hsp70蛋白質(zhì)序列進(jìn)行BLASTPP搜索。使用Hummer Search 3.0軟件，在小麥基因組序列中通過(guò)隱馬爾科夫模型比對(duì)，篩選小麥中含有Hsp70結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)序列搜索。將上述方法篩選到的候選基因蛋白質(zhì)序列合并，利用SMART、NCBI-CDD數(shù)據(jù)庫(kù)和Pfam對(duì)候選蛋白序列進(jìn)行檢測(cè)，去掉不含有Hsp70保守結(jié)構(gòu)域或保守結(jié)構(gòu)域不完整序列和冗余序列，得到小麥Hsp70結(jié)構(gòu)域高度保守的蛋白成員。

1.2 小麥Hsp70的亞細(xì)胞定位和染色體定位

利用生物信息學(xué)在線分析軟件PSORT （https：//www.genscript.com/wolf-psort.html）預(yù)測(cè)小麥Hsp70蛋白的亞細(xì)胞定位，TBtools （http：//www.tbtools.org/）進(jìn)行Hsp70基因的染色體定位與基因結(jié)構(gòu)分析。

1.3 小麥Hsp70蛋白的保守基序motif分析和蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用在線工具M(jìn)EME（http：//meme-suite.org/）進(jìn)行小麥Hsp70蛋白序列中保守基序分析（motif），SOPMA（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/htm;/）進(jìn)行蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。

1.4 小麥Hsp70蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析及可視化

將上述得到的小麥Hsp70蛋白序列利用string數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/）以擬南芥Hsp70蛋白模型構(gòu)建小麥Hsp70的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

1.5 小麥Hsp70基因成員的基因本體GO分析

基因本體（gene ontology）論分析即GO分析，是基因按功能進(jìn)行富集分析的重要平臺(tái)，其包括生物學(xué)過(guò)程（biological process），細(xì)胞成分（cellular component），分子功能（molecular function）三大類。首先將小麥Hsp70編碼的蛋白氨基酸殘基序列與擬南芥參考蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)，獲得對(duì)應(yīng)的參考序列，然后把參考序列對(duì)應(yīng)的基因IDmapping到AmiGO數(shù)據(jù)庫(kù)中（（http：//amigo.geneontology.org），從而獲得小麥Hsp70基因成員對(duì)應(yīng)的GO條目，設(shè)置e-value<10-5。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥Hsp70基因成員的篩選鑒定及亞細(xì)胞定位

HMM模型和本地BLAST 2種搜索比對(duì)，從小麥全基因組中獲得109個(gè)Hsp70候選基因，Pfam和SMART、NCBI-CDD等在線網(wǎng)站對(duì)篩選，舍去不含有Hsp70蛋白結(jié)構(gòu)域或保守結(jié)構(gòu)域不完整的序列，鑒定到21個(gè)小麥Hsp70（TaHsp70）家族成員（表1）。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，小麥Hsp70蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)。

2.2 小麥Hsp70基因成員的染色體定位

為明確Hsp70基因在染色體上的位置情況，數(shù)據(jù)分析和利用TBtools（http：//www.tbtools.org/）進(jìn)行染色體定位結(jié)果顯示，小麥Hsp70在小麥12條染色體上呈不均等分布，1A、2B、4D染色體分別有3個(gè)Hsp70基因基，2D、3B、4B染色體上分別有2個(gè)Hsp70基因，2B、4A、5A、5B、5D、6A染色體都只有1個(gè)Hsp70基因（圖1）。

2.3 小麥Hsp70蛋白的保守基序分析

利用在線工具M(jìn)EME（http：//meme-suite.org/）對(duì)小麥Hsp70蛋白序列進(jìn)行Motif保守元件的預(yù)測(cè)分析，搜索10個(gè)不同的保守基序，命名為Motif1-Motif10 （圖2）。Hsp70一般含有5～10個(gè)保守基序，其中motif 2（18/21）、motif 4（17/21）、motif 9（17）、motif 8（16）、motif 10（16）、motif 7（15）、motif 5（15）、motif 1（15）和motif 3（15）出現(xiàn)的頻率較高，motif 6出現(xiàn)頻率最低，為9次。其中第1條和第4條，第6～9條，第11～13條，第17～18條都具有相同的基序數(shù)量和順序。

2.4 小麥Hsp70的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用在線軟件SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）對(duì)TaHsp70蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果表明，Hsp70蛋白α-螺旋與無(wú)規(guī)螺旋卷曲的占比較大，二者之和大于70%，延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角類型的氨基酸所占比重較小，二者之和小于30%（圖3、表2）。

2.5 小麥Hsp70蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析及可視化

利用string數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/），進(jìn)行小麥Hsp70蛋白的互作分析。結(jié)果顯示，TaHsp70-14、TaHsp70-6、TaHsp70-12、TaHsp70-16、TaHsp70-3，TaHsp70-8、TaHsp70-21、TaHsp70-20，TaHsp70-17、TaHsp70-11共10個(gè)蛋白參與互作，存在35條互作關(guān)系（圖4）。其中線條顏色越深，互作強(qiáng)度越強(qiáng)，線條顏色越淺，互作強(qiáng)度越弱。為了探究其相關(guān)功能，進(jìn)一步做基因本體論分析。

2.6 小麥Hsp70基因成員的基因本體分析

基因本體注釋可實(shí)現(xiàn)與基因有關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘、轉(zhuǎn)化和整合，利用Blast2GO對(duì)小麥Hsp70基因家族進(jìn)行分析，設(shè)置e-value<10-5，結(jié)果表明，在生物過(guò)程方面，主要集中于應(yīng)激反應(yīng)、脅迫反應(yīng)、熱反應(yīng)、無(wú)機(jī)反應(yīng)、多組織過(guò)程、蛋白質(zhì)折疊、對(duì)金屬離子的反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌的反應(yīng)、先天免疫反應(yīng)等。在細(xì)胞成分方面，主要集中于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)膜、細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生反應(yīng)。在分子功能中，主要集中于雜環(huán)化合物的結(jié)合、離子結(jié)合、ATP結(jié)合、藥物結(jié)合、蛋白結(jié)合等（圖5）。

3 討論與結(jié)論

蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，Hsps是生物體在受到脅迫時(shí)的一種應(yīng)激蛋白，廣泛存在于各種生物體內(nèi)，參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖、凋亡等過(guò)程[24]，其中Hsp70是提高植物高溫耐受力的重要因子之一，在植物生長(zhǎng)及抵御多種非生物脅迫中發(fā)揮作用[17，25-26]。隨著基因組學(xué)的快速發(fā)展隨著植物基因組測(cè)序的逐漸完成，Hsps及Hsp70家族在擬南芥[10]、玉米[20]、水稻[19]、大麥[12，27]、葡萄[28]、煙草[29]等多種植物中進(jìn)行了全基因組范圍內(nèi)鑒定和逆境條件下的表達(dá)分析研究，亞細(xì)胞定位主要位于細(xì)胞質(zhì)，結(jié)構(gòu)域高度保守[5]。

小麥Hsps家族基因進(jìn)行了鑒定、克隆和表達(dá)[5]，本研究在全基因組范圍內(nèi)對(duì)小麥Hsp70基因家族進(jìn)行鑒定，共內(nèi)鑒定到21個(gè)結(jié)構(gòu)域高度保守的Hsp70基因家族成員，不均等分布在12條染色體上，對(duì)蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果顯示主要分布于細(xì)胞質(zhì)，結(jié)構(gòu)域高度保守，與前人研究結(jié)果[5]一致。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示，α-螺旋與無(wú)規(guī)卷曲類型在每個(gè)蛋白中所占比重較大，二者之和大于70%，延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角類型的氨基酸所占比重較小，二者之和小于30%。

研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)通過(guò)互相作用發(fā)揮生物功能[30]，蛋白互作分析及可視化分析結(jié)果表明，TaHsp70-14、TaHsp70-6、TaHsp70-12、TaHsp70-16、TaHsp70-3、TaHsp70-8、TaHsp70-21、TaHsp70-20、TaHsp70-17、TaHsp70-11共10個(gè)蛋白參與互作，存在35條互作關(guān)系。GO分析結(jié)果表明，所鑒定基因主要在分子功能、生物過(guò)程及細(xì)胞成分方面起作用。在生物過(guò)程方面，主要集中于熱反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)、抗壓反應(yīng)、有機(jī)反應(yīng)、無(wú)機(jī)反應(yīng)、蛋白質(zhì)折疊、對(duì)金屬離子的反應(yīng)、先天免疫反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌的反應(yīng)等。在細(xì)胞成分方面，主要集中于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)膜、發(fā)生反應(yīng)。在分子功能中，主要集中于雜環(huán)化合物的結(jié)合、離子束縛、蛋白結(jié)合、結(jié)合ATP、藥物結(jié)合等。

Hsps參與植物的多種代謝過(guò)程，在植物的逆境響應(yīng)起主要作用，抗性育種是小麥育種中重要課題之一。隨著小麥基因組測(cè)序的完成和不斷完善，為深入研究這些基因的功能以及上游和下游的調(diào)控蛋白提供了基礎(chǔ)，對(duì)TaHsps家族的分析，為通過(guò)分子手段改良小麥的耐熱性提供理論依據(jù)，TaHsp家族的功能及通過(guò)何種途徑提高小麥的抗性仍需進(jìn)一步研究闡明。

參考文獻(xiàn)：

[1]Mishra D，Shekhar S，Agrawal L，et al. Cultivar-specific high temperature stress responses in bread wheat （Triticum aestivum L.） associated with physicochemical traits and defense pathways[J]. Food Chemistry，2017，221：1077-1087.

[2]Nakajima Y，Suzuki S. Environmental stresses induce misfolded protein aggregation in plant cells in a microtubule-dependent manner[J]. International Journal of Molecular Sciences，2013，14（4）：7771-7783.

[3]Wang W X，Vinocur B，Altman A. Plant responses to drought，salinity and extreme temperatures：towards genetic engineering for stress tolerance[J]. Planta，2003，218（1）：1-14.

[4]Xue G P，Drenth J，McIntyre C L. TaHsfA6f is a transcriptional activator that regulates a suite of heat stress protection genes in wheat （Triticum aestivum L.） including previously unknown Hsf targets[J]. Journal of Experimental Botany，2014，66（3）：1025-1039.

[5]Wang W X，Vinocur B，Shoseyov O，et al. Role of plant heat-shock proteins and molecular chaperones in the abiotic stress response[J]. Trends in Plant Science，2004，9（5）：244-252.

[6]Morimoto R I. Regulation of the heat shock transcriptional response：cross talk between a family of heat shock factors，molecular chaperones，and negative regulators[J]. Genes & Development，1998，12（24）：3788-3796.

[7]Feder M E. Organismal，ecological，and evolutionary aspects of heat-shock proteins and the stress response：established conclusions and unresolved issues[J]. Integrative and Comparative Biology，2015，39（6）：857-864.

[8]王明強(qiáng)，張道遠(yuǎn). 植物熱激蛋白70基因家族及其生物學(xué)功能研究進(jìn)展[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2015，34（2）：421-428.

[9]Park C J，Seo Y S. Heat shock proteins：a review of the molecular chaperones for plant immunity[J]. The Plant Pathology Journal，2015，31（4）：323-333.

[10]Lin B L，Wang J S，Liu H C，et al. Genomic analysis of the Hsp70 superfamily in Arabidopsis thaliana[J]. Cell Stress & Chaperones，2001，6（3）：201-208.

[11]Mishra R C，Grover A. ClpB/Hsp100 proteins and heat stress tolerance in plants[J]. Critical Reviews in Biotechnology，2016，36（5）：862-874.

[12]Li J，Liu X H. Genome-wide identification and expression profile analysis of the Hsp20 gene family in barley （Hordeum vulgare L.）[J]. PeerJ，2019，7：e6832.

[13]Siddique M，Gernhard S，von Koskull-D ring P，et al. The plant sHSP superfamily：five new members in Arabidopsis thaliana with unexpected properties[J]. Cell Stress & Chaperones，2008，13（2）：183-197.

[14]Corigliano M G，Maglioco A，Laguía Becher M，et al. Plant Hsp90 proteins interact with B-cells and stimulate their proliferation[J]. PLoS One，2011，6（6）：e21231.

[15]杜巧麗，蔣君梅，陳美晴，等. 水稻熱休克蛋白Hsp70基因克隆、表達(dá)分析及原核表達(dá)[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2021，48（3）：620-629.

[16]Duan Y H，Guo J，Ding K，et al. Characterization of a wheat HSP70 gene and its expression in response to stripe rust infection and abiotic stresses[J]. Molecular Biology Reports，2011，38（1）：301-307.

[17]劉 陽(yáng). 普通小麥熱激蛋白70基因家族分析及TaHsp70-47的克隆[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2020.

[18]安艷秋，藺瑞明，馮 晶，等. 小麥熱激蛋白基因TaHSP70克隆及其在植物防衛(wèi)和抗逆反應(yīng)中的表達(dá)分析[J]. 分子植物育種，2011，9（4）：402-409.

[19]Jung K H，Gho H J，Nguyen M X，et al. Genome-wide expression analysis of HSP70 family genes in rice and identification of a cytosolic HSP70 gene highly induced under heat stress[J]. Functional & Integrative Genomics，2013，13（3）：391-402.

[20]宋晉輝，馬海蓮，甕巧云，等. 玉米Hsp70基因家族的全基因組鑒定與分析[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，2017，31（7）：1245-1254.

[21]Augustine S M，Cherian A V，Syamaladevi D P，et al. Erianthus arundinaceus HSP70 （EaHSP70） acts as a key regulator in the formation of anisotropic interdigitation in sugarcane （Saccharum spp. hybrid） in response to drought stress[J]. Plant and Cell Physiology，2015，56（12）：2368-2380.

[22]郭 猛. 辣椒熱脅迫相關(guān)基因表達(dá)分析及功能研究[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2016.

[23]趙 溪，張婷婷，邢文婷，等. 鐵皮石斛熱激蛋白HSP70家族基因鑒定及溫度脅迫下的表達(dá)分析[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2021，48（9）：1743-1754.

[24]Rowarth N M，Dauphinee A N，Denbigh G L，et al. Hsp70 plays a role in programmed cell death during the remodelling of leaves of the lace plant （Aponogeton madagascariensis）[J]. Journal of Experimental Botany，2020，71（3）：907-918.

[25]Latijnhouwers M，Xu X M，Mller S G. Arabidopsis stromal 70-kDa heat shock proteins are essential for chloroplast development[J]. Planta，2010，232（3）：567-578.

[26]Jiang C H，Bi Y K，Zhang R Y，et al. Expression of RcHSP70，heat shock protein 70 gene from Chinese rose，enhances host resistance to abiotic stresses[J]. Scientific Reports，2020，10：2445.

[27]Chaudhary R，Baranwal V K，Kumar R，et al. Genome-wide identification and expression analysis of Hsp70，Hsp90，and Hsp100 heat shock protein genes in barley under stress conditions and reproductive development[J]. Functional & Integrative Genomics，2019，19（6）：1007-1022.

[28]王鵬飛，蘇 玲，蔣錫龍，等. 全基因組范圍葡萄熱休克轉(zhuǎn)錄因子的鑒定與分析[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（32）：144-151，227.

[29]Song Z P，Pan F L，Lou X P，et al. Genome-wide identification and characterization of Hsp70 gene family in Nicotiana tabacum[J]. Molecular Biology Reports，2019，46（2）：1941-1954.

[30]Jacob P，Hirt H，Bendahmane A.The heat-shock protein/chaperone network and multiple stress resistance[J]. Plant Biotechnology Journal，2017，15（4）：405-414.