李霆 李強(qiáng)強(qiáng) 姜艷軍 馬麗

摘要：有機(jī)磷農(nóng)藥在蔬菜、水果及土壤中的殘留嚴(yán)重影響了環(huán)境和人類的身體健康。有機(jī)磷水解酶（organophosphate pesticides，OPH）能高效降解有機(jī)磷類化合物殘留，利用具有開放孔道的二氧化硅納米花固定有機(jī)磷水解酶，可以優(yōu)化固定化條件，固定化OPH的最適溫度為45 ℃，最適pH值為8，與游離OPH相比，在溫度為35～55 ℃、pH值為7.5～9.0的范圍內(nèi)均能保持較高的催化活性。與游離有機(jī)磷水解酶相比，固定化有機(jī)磷水解酶具有更好的熱穩(wěn)定性、pH值穩(wěn)定性和重復(fù)使用性。研究結(jié)果表明，固定化酶在保證降解效率的同時，可有效降低有機(jī)磷水解酶的使用成本，是一種具有發(fā)展前景的固定化酶降解有機(jī)磷農(nóng)藥技術(shù)。

關(guān)鍵詞：有機(jī)磷降解酶;有機(jī)磷農(nóng)藥;二氧化硅納米花;固定化酶;降解

中圖分類號： S482.3+3;S188+.3? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）10-0104-06

有機(jī)磷農(nóng)藥（organophosphate pesticides，OPs）是我國乃至世界范圍內(nèi)使用最廣泛的一類用于農(nóng)作物和蔬果的殺蟲劑，由于其與生物體內(nèi)的乙酰膽堿具有相似的結(jié)構(gòu)，從而會影響生物體內(nèi)正常的神經(jīng)系統(tǒng)傳遞過程，達(dá)到消滅害蟲的目的[1-3]。但在自然界中，有機(jī)磷農(nóng)藥會持續(xù)存在很長時間，給環(huán)境和人類健康帶來嚴(yán)重威脅[3-7]。因此，開發(fā)可以在水體、農(nóng)作物、土壤中應(yīng)用的高效降解有機(jī)磷農(nóng)藥技術(shù)十分必要。

目前，針對有機(jī)磷農(nóng)藥的降解方法主要分為熱降解法、化學(xué)降解法和生物酶降解法，由于生物酶法具有反應(yīng)專一性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、綠色環(huán)保的優(yōu)勢而受到廣泛關(guān)注[8-13]。有機(jī)磷水解酶（organophosphate pesticides，OPH）是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的酯酶，能夠高效催化有機(jī)磷農(nóng)藥的降解。2020年，白俊巖等利用OPH降解甲基對硫磷，在優(yōu)化的試驗條件下，OPH對有機(jī)磷類化合物的降解率達(dá)到98%以上[14]。用OPH降解有機(jī)磷類毒劑時，通常需要將OPH固定在載體上，與直接使用游離酶相比，在保證酶催化性能的同時，解決了游離酶難分離、重復(fù)使用的缺陷。固定化酶的方法和載體的選擇是影響固定化酶效果的關(guān)鍵因素。因此，開發(fā)適合OPH固定的良好載體，并通過合適的固定化方法維持酶的活性與穩(wěn)定性是目前亟待解決的問題。

本研究制備了具有開放孔道結(jié)構(gòu)的二氧化硅納米花作為載體固定化OPH。二氧化硅納米花具有獨特的孔道結(jié)構(gòu)，可以提高OPH的負(fù)載量，同時可為OPH提供適宜的微環(huán)境，有利于保持酶分子的活性構(gòu)象，使固定化酶表現(xiàn)出良好的催化活性。通過單因素和正交試驗對固定化酶的條件進(jìn)行優(yōu)化，考察固定化酶的酶學(xué)性能，并對固定化OPH在真實樣品中的降解能力和重復(fù)使用性進(jìn)行了測定。褶皺二氧化硅納米花不僅為固定化酶提供了一種良好載體，同時該技術(shù)也為在蔬果中實現(xiàn)有機(jī)磷農(nóng)藥的降解提供了新方法。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑

OPH，購于西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司;十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）、正丁醇、環(huán)己烷、乙醇、尿素、碳酸鈉（Na2CO3）和正硅酸乙酯（tetraethyl orthosilicate，TEOS），購于天津市大茂化學(xué)試劑廠;甲基對硫磷、對硝基苯酚（p-nitrophenol，PNP）、三氯乙酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S），購自河南予華儀器有限公司;管式爐（KRG-9-12），購自洛陽科熱爐業(yè)有限公司;紫外可見分光光度計（UV-1100），購自上海儀電分析儀器有限公司;掃描電子顯微鏡（NanoSEM450）和透射電子顯微鏡（TalosF200s），購自美國FEI公司;漩渦振蕩器（XW-80A），購自上海青浦瀘西儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 褶皺二氧化硅納米花的制備方法 將CTAB（1.0 g）、正丁醇（1.0 g）和尿素（30 g，0.4 mol/L）置于單口燒瓶中，攪拌至完全溶解，向上述溶液中加入12 g環(huán)己烷，待完全溶解后緩慢滴加2 g 正硅酸乙酯，攪拌30 min，于70 ℃、恒溫條件下磁力攪拌反應(yīng)20 h，用蒸餾水、95%乙醇洗滌，在煅燒爐中于550 ℃空氣煅燒5 h，除去未反應(yīng)的CTAB，得到褶皺二氧化硅納米花顆粒（SiO2NF）。

1.3.2 固定化酶的制備方法 取一定量褶皺二氧化硅，在水浴振蕩下使其均勻分散在1 mL Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L，pH值為8.0）中，加入OPH，在一定溫度下孵育一定時間，離心分離后收集沉淀，用去離子水清洗3次，真空干燥后得到固定化酶（OPH@SiO2NF）。

1.3.3 載體及固定化酶的表征方法 通過掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 和透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）對OPH@SiO2NF的形貌和結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。

1.3.4 游離OPH和OPH@SiO2NF活性的測定 通過比色法測定游離OPH和OPH@SiO2NF的活性。OPH可將甲基對硫磷降解為對硝基苯酚（PNP），與Na2CO3會發(fā)生顏色變化，反應(yīng)方程見圖1。根據(jù)顏色變化來衡量游離OPH和OPH@SiO2NF的活性。

具體測定條件：取適量游離OPH或固定化OPH@SiO2NF，加入至含有甲基對硫磷（5 μL 10 mg/mL）的Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L，pH值為8.0）中，于37 ℃反應(yīng)5 min，立即加入1 mL終止劑三氯乙酸（10%）終止反應(yīng)，再加入1 mL碳酸鈉（10%）顯色，測定其在410 nm處的吸光度。根據(jù)PNP標(biāo)準(zhǔn)曲線得到PNP產(chǎn)量并計算酶活性。1個酶活性單位（U）定義：37 ℃反應(yīng)1 min產(chǎn)生1 μmol PNP所需的酶量。54C17866-9329-4820-953F-6EF8ACE3D55B

1.3.5 OPH@SiO2NF和OPH的酶學(xué)性質(zhì)分析

1.3.5.1 固定化酶的最適溫度 取一定量OPH@SiO2NF和OPH，在不同溫度的Tris-HCl緩沖液中孵育10 min后，測定其活性。

1.3.5.2 固定化酶的最適pH值 取一定量OPH@SiO2NF和OPH，在不同pH值的緩沖液中孵育 10 min 后，在37 ℃測定其活性。

1.3.5.3 有機(jī)溶劑耐受性的分析 取一定量OPH@SiO2NF和OPH，在不同濃度的甲醇和DMSO溶液中孵育10 min后，在37 ℃、最適pH值下測定其活性。

1.3.5.4 熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性的分析 分別將一定量的OPH和OPH@SiO2NF置于Tris-HCl緩沖液（pH值為8.0）中，于50、60 ℃水浴條件下孵化，每隔一定時間測其剩余活性。分別將一定量的OPH和OPH@SiO2NF置于不同pH值的緩沖液（pH值為8.0）中，在50、60 ℃水浴條件下孵化，每隔一定時間測其剩余活性。

1.3.5.5 儲藏穩(wěn)定性分析 分別將一定量的OPH和OPH@SiO2NF置于Tris-HCl緩沖液（pH值為8.0）中，在37 ℃水浴條件下孵化，每隔一定時間測其剩余活性。

1.3.6 OPH@SiO2NF和OPH在實際蔬果中對甲基對硫磷的降解能力測定 在天津市本地蔬菜市場購買蘋果和卷心菜，摘除腐敗葉片后，用清水清洗泥污后晾干。取2 g蘋果與卷心菜，噴灑上2 mL 1×10-5 mol/L甲基對硫磷，靜置1 h后，將蘋果與卷心菜置于5 mL含有5%丙酮的緩沖溶液中，于 25 ℃ 反應(yīng)1 h，再于8 000 r/min離心5 min，取上清于410 nm處測定吸光度，計算酶降解活性。

1.4 正交試驗優(yōu)化固定化條件

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以蛋白負(fù)載量和降解活性為評價標(biāo)準(zhǔn)，利用正交試驗對固定化過程進(jìn)行優(yōu)化，試驗因素和水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 SiO2NF的表征

利用SEM考察SiO2NF的外部形貌 由圖2-a可以看出，SiO2NF為高度分散、尺寸均一（粒徑為 80～120 nm）的花狀納米顆粒，表面分布著開放的孔道。SiO2NF的TEM（圖2-b）與SEM表征的納米顆粒尺寸一致。由TEM結(jié)果可以看出，SiO2NF表面的枝狀孔道深嵌入納米顆粒的中心位置。因此可見，SiO2NF的放射狀孔道結(jié)構(gòu)可為后面固定化酶修飾提供較大的比表面積，并且在反應(yīng)體系中有利于傳質(zhì)。

2.2 SiO2NF固定化OPH條件的篩選

為篩選出最佳固定化OPH條件，通過單因素試驗研究不同初始酶濃度和吸附時間2個關(guān)鍵因素對固定化OPH酶活性的影響。由圖3可見，隨著初始酶濃度的增大，蛋白負(fù)載量也呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢，但當(dāng)初始酶濃度超過55 mg/mL時，蛋白負(fù)載量增大不明顯，而且在吸附16 h時，所有酶濃度固定化OPH均可達(dá)到吸附平衡。

由圖4可見，當(dāng)初始酶濃度達(dá)到55 mg/mL后，降解活性不再上升，反而表現(xiàn)出降低趨勢。這是由于當(dāng)初始酶活性過高時，酶分子在載體內(nèi)部的聚集程度增大，造成酶分子之間活性位點相互遮蓋，減少了底物、產(chǎn)物與活性位點接觸的機(jī)會，導(dǎo)致降解活性降低[15-17]。

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取不同初始酶濃度、吸附時間、搖床轉(zhuǎn)速和固定化溫度4個因素，通過正交試驗對固定化條件進(jìn)行優(yōu)化，取4因素4水平，設(shè)計L16正交試驗，試驗結(jié)果如表2所示。根據(jù)正交試驗法對固定化條件的優(yōu)化結(jié)果及極差分析可知，上述4個因素對固定化酶蛋白負(fù)載量的影響順序依次為初始酶濃度>吸附時間>固定化溫度>搖床轉(zhuǎn)速，獲得蛋白負(fù)載量最優(yōu)的試驗設(shè)計方案是A4B3C2D2，上述4個因素對降解活性的影響順序依次為初始酶濃度>吸附時間>固定化溫度>搖床轉(zhuǎn)速，獲得降解活性最優(yōu)的試驗設(shè)計方案是A3B4C2D4，綜合考慮蛋白負(fù)載量和降解活性，后續(xù)固定化酶試驗選擇初始酶濃度為55 mg/mL，吸附時間為16 h，搖床轉(zhuǎn)速為100 r/min，固定化酶的溫度為35 ℃，此時的降解活性為 320 U/g，蛋白負(fù)載量為51 mg/g。

2.3 游離OPH和OPH@SiO2NF酶學(xué)性能的分析

2.3.1 游離OPH和OPH@SiO2NF的最適溫度 分別對游離OPH和OPH@SiO2NF的最適溫度進(jìn)行研究，由圖5可見，游離OPH在40 ℃時表現(xiàn)出最高的相對活性，而固定化后的OPH@SiO2NF在45 ℃時的酶活性最高。OPH@SiO2NF的最適溫度要高于游離OPH，因為OPH被固定于SiO2NF上后，限域作用的影響使其展現(xiàn)活性所需的活化能比游離OPH高。而當(dāng)溫度繼續(xù)升高時，游離的OPH和固定化OPH的相對活性都有不同程度的降低，這是由于酶分子在過高的溫度下會產(chǎn)生不可逆的構(gòu)象變化[18-20]，使酶喪失活性。

2.3.2 游離OPH和OPH@SiO2NF的最適pH值 對游離OPH和OPH@SiO2NF的最適pH值進(jìn)行研究，由圖6可見，游離酶在pH值為8.5時的相對活性最高，達(dá)到95%，相比較而言，OPH@SiO2NF在pH值為7.5～9.0之間均表現(xiàn)出較高的相對活性，OPH@SiO2NF的最適pH值為8。從圖6還可以看出，通過固定化后的OPH在較寬的pH值范圍內(nèi)均能保持較高的酶活性，這是由于將OPH固定于SiO2NF的孔道中，為酶分子提供了良好的微環(huán)境，其酶活性中心得到保護(hù)[21]，從而表現(xiàn)出穩(wěn)定的酶活性。

2.4 游離OPH和OPH@SiO2NF穩(wěn)定性能的分析

2.4.1 有機(jī)溶劑耐受性 OPH降解的有機(jī)磷農(nóng)藥及神經(jīng)毒劑等，通常需要丙酮、乙腈等有機(jī)溶劑對其進(jìn)行溶解，但此類極性較強(qiáng)的有機(jī)溶劑會引起OPH失活，因此選擇乙腈和丙酮溶劑對游離OPH和OPH@SiO2NF的有機(jī)溶劑耐受性進(jìn)行研究。由圖7可以看出，在25%乙腈溶液中，OPH@SiO2NF仍然可以保留80%的剩余活性，而游離OPH僅有50%的剩余活性。同樣的，在不同濃度的丙酮溶液中 OPH@SiO2NF的穩(wěn)定性也優(yōu)于游離OPH 這是因為當(dāng)游離OPH直接接觸有機(jī)溶劑時，其內(nèi)部蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)中的非極性基團(tuán)與極性溶劑作用，導(dǎo)致酶高級結(jié)構(gòu)構(gòu)象發(fā)生變化，使酶失活，而固定化的OPH、SiO2NF有效保護(hù)了酶分子，可以防止其構(gòu)象發(fā)生變化，從而有效保持酶活性[22]。54C17866-9329-4820-953F-6EF8ACE3D55B

2.4.2 熱穩(wěn)定性 為了研究游離OPH和OPH@SiO2NF的熱穩(wěn)定性，將游離和固定化酶分別在50、60 ℃下孵育一段時間，再研究其剩余酶活性。由圖8可見，在50、60 ℃下孵育4 h后，OPH@SiO2NF分別可以保持60.08%、52.91%的初始酶活性，而游離OPH在相同條件下分別僅能保持初始酶活性的32.83%、21.65%。試驗結(jié)果表明，在高溫操作條件下，固定化酶的穩(wěn)定性比游離酶強(qiáng)，OPH@SiO2NF可以抵抗高溫引發(fā)的酶分子構(gòu)象變化，這可能是由于OPH酶分子與二氧化硅納米花載體之間的靜電作用[22]，使酶分子長時間在高溫條件下仍能保持其原有構(gòu)象，從而維持較高的酶活性。

2.4.3 儲藏穩(wěn)定性 對游離OPH和OPH@SiO2NF的儲藏穩(wěn)定性進(jìn)行研究，由圖9可見，游離酶儲藏至12 d時，僅剩余初始酶活性的50%左右;而OPH@SiO2NF儲藏至20 d時，仍可保持80%以上的初始酶活性。說明固定化后的OPH穩(wěn)定性得到了明顯提升，這可能是由于固定在合適的載體上后，為OPH酶分子提供了適宜的微環(huán)境，并且可以抵御外界環(huán)境引發(fā)的酶構(gòu)象變化，從而使OPH在較長時間內(nèi)仍能維持較高的催化活性。

2.5 OPH@SiO2NF用于蔬果有機(jī)磷農(nóng)藥的降解性能

由于固定化酶方便回收分離再重復(fù)使用，可以有效降低酶的使用成本，因而受到廣泛關(guān)注，筆者對OPH@SiO2NF在實際蔬果中的應(yīng)用及重復(fù)使用性進(jìn)行了研究。由圖10、圖11可見，OPH@SiO2NF用于蘋果、卷心菜中有機(jī)磷農(nóng)藥的降解，在重復(fù)使用10次后，剩余酶活性都保持在65%以上，降解率保持在60%以上。說明OPH@SiO2NF具有良好的降解能力，而且重復(fù)使用性良好，多次重復(fù)使用后酶活性下降，可能由于在多次使用過程中對固定化酶回收的損失造成的。

3 結(jié)論

本研究成功制備了粒徑均一、高度分散的二氧化硅納米花，其表面分布著明顯的孔道結(jié)構(gòu)。利用吸附法固定化OPH，對固定化條件及固定化酶的酶學(xué)性能進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，初始酶濃度為55 mg/mL，吸附時間為16 h，酶活性為320 U/g，蛋白負(fù)載量為 51 mg/g。固定化OPH的最適溫度為45 ℃，最適pH值為8，與游離OPH相比，在溫度為35～55 ℃、pH值為7.5～9.0的范圍內(nèi)均能保持較高的催化活性，同時表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性、pH值穩(wěn)定性和儲藏穩(wěn)定性，在真實樣品中重復(fù)使用10次后，仍能保持初始活性的65%以上。由此可見，OPH@SiO2NF具有在有機(jī)磷農(nóng)藥降解方面的應(yīng)用潛力，同時這種表面分布開放的孔道結(jié)構(gòu)的二氧化硅納米花是一種良好的固定化酶載體，為保護(hù)酶分子的高級結(jié)構(gòu)提供了良好的保護(hù)，是一種十分具有發(fā)展?jié)摿Φ墓潭ɑd體，可以應(yīng)用于工業(yè)催化、藥物遞送、氣體吸附等更多的領(lǐng)域。

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