李 玲，白春英，張俊毅，史鐵偉，馬迎平

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)赤峰學(xué)院研究生培養(yǎng)基地，內(nèi)蒙古 赤峰 024099；2.赤峰市醫(yī)院感染科，內(nèi)蒙古 赤峰 024099；3.內(nèi)蒙古人類遺傳病研究重點實驗室，內(nèi)蒙古 赤峰 024099；4.赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，內(nèi)蒙古 赤峰 024099；5.赤峰市醫(yī)院肝膽外科，內(nèi)蒙古 赤峰024099)

手術(shù)雖是食管鱗狀細(xì)胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)的首選治療手段，但僅可清除ESCC患者已生成的腫瘤組織，術(shù)后仍有較高的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)風(fēng)險，不僅影響整體的手術(shù)治療效果，部分患者甚至面臨二次手術(shù)風(fēng)險，治療難度加大，可增加患者病死風(fēng)險[1-2]。研究[3]證實，多數(shù)ESCC患者預(yù)后欠佳，生存率低下，且患者的預(yù)后和生存情況與其TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。因而，早期預(yù)估復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險并指導(dǎo)治療對減少復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、改善預(yù)后意義重大。有研究[4]指出，花生四烯酸與白三烯等脂類物質(zhì)代謝異常在ESCC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，脂代謝通路上的酶及其代謝產(chǎn)物可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖等因素均可能參與了ESCC發(fā)生的病理過程。5-脂氧合酶激活蛋白(Five lipoxygenase activating protein，F(xiàn)LAP)是花生四烯酸與白三烯等脂類物質(zhì)代謝通路中關(guān)鍵的酶[5]。有研究[6]指出，F(xiàn)LAP的基因位點突變與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，同樣，F(xiàn)LAP的表達(dá)抑制也可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。結(jié)合上述信息，推測FLAP在ESCC患者中也有一定的表達(dá)，且可能與疾病臨床病理特征有一定關(guān)系。因此，本研究主要觀察ESCC患者癌組織內(nèi)FLAP表達(dá)情況，分析FLAP表達(dá)與ESCC及其臨床病理特征的關(guān)系及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2007年1月至2011年1月期間就診于赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院并經(jīng)胃鏡、手術(shù)病理等檢查確診為ESCC的297例患者癌組織標(biāo)本，并選取其中66例患者的癌旁相對正常的食管組織標(biāo)本。297例患者中，男性232例，女性65例；年齡57～61歲，中位數(shù)59(58，60)歲；腫瘤直徑2.4～11.25 cm，平均(6.87±1.03)cm；TNM分期[7]中，Ⅰ期28例，Ⅱ期136例，Ⅲ期133例，Ⅳ期0例；高分化45例，中分化227例，低分化25例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移147例。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《中國早期食管鱗狀細(xì)胞癌及癌前病變篩查與診治共識(2015年·北京)》[8]中ESCC相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，并均經(jīng)影像學(xué)、病理學(xué)檢查確診；②均接受手術(shù)治療；③預(yù)計生存時間>3個月。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他惡性腫瘤者；②術(shù)前接受放、化療者；③既往有胸部手術(shù)史，且有胸腔粘連者；④有精神障礙或心理疾病，無法配合研究內(nèi)相關(guān)檢查者；⑤合并全身感染性、自身免疫性疾病者；⑥伴有中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛性轉(zhuǎn)移者。所有患者對本研究知情且同意。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會審批。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本制備：全部患者均通過手術(shù)采取食管癌組織及癌旁組織標(biāo)本(即距腫瘤邊緣>5 cm的食管組織)。將選取的石蠟切片連續(xù)切片(4 μm)，每張石蠟塊切4張片，經(jīng)蘇木精染色，漂白后干燥。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色：使用FLAP抗體(批號：CA92124，美國abgent公司，稀釋滴度為1∶100)、超高分子檢測試劑盒和液體基質(zhì)試劑盒(美國Invitrogen公司)進(jìn)行免疫組化染色。石蠟切片脫蠟至水，使用3%過氧化氫-甲醇封閉30 min，并采用檸檬酸緩沖液進(jìn)行漂洗。漂洗10 min后進(jìn)行抗原修復(fù)。使用3%過氧化氫溶液處理10 min，去除內(nèi)源性過氧化物酶，在FLAP抗體濕盒中孵育過夜，二氨基聯(lián)苯胺顯色，再使用蘇木精復(fù)染，最后使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察及顯微圖像攝影。判定標(biāo)準(zhǔn)包括依據(jù)染色強(qiáng)度和依據(jù)癌組織中陽性細(xì)胞數(shù)兩種。依據(jù)染色強(qiáng)度：無染色，0分；弱染色，1分；中度染色，2分；強(qiáng)染色，3分。依據(jù)癌組織中陽性細(xì)胞數(shù)：<5%，0分； 5%～25%，1分； 26%～50%，2分； 51%～75%，3分；>75%，4分。將染色強(qiáng)度和癌組織中陽性細(xì)胞數(shù)的分?jǐn)?shù)相乘得出最終評分：0～2分表示FLAP低表達(dá)，即陰性；3～12 分表示FLAP高表達(dá)，即陽性。

2 結(jié) 果

2.1 ESCC患者癌旁組織和癌組織FLAP陽性率比較 297份ESCC組織標(biāo)本中，有223例FLAP呈陽性表達(dá)，陽性率為75.08%；66份癌旁組織標(biāo)本中，有13例FLAP呈陽性，陽性率為19.70%。ESCC組織標(biāo)本FLAP陽性率高于癌旁組織標(biāo)本(χ2=72.830，P<0.05)。ESCC患者癌旁組織和癌組織免疫組化染色結(jié)果見圖1。

2.2 不同臨床病理特征ESCC患者FLAP陽性率比較 見表1。腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移擴(kuò)散患者的FLAP陽性率高于腫瘤細(xì)胞未轉(zhuǎn)移擴(kuò)散患者，TNM Ⅲ期患者的FLAP陽性率高于Ⅰ-Ⅱ期患者，低分化患者的FLAP陽性率低于中、高分化患者(均P<0.05)。中、高分化患者間以及Ⅰ、Ⅱ期患者間的FLAP陽性率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

2.3 FLAP陽性表達(dá)與ESCC患者不同臨床病理特征的相關(guān)性分析 見表2。經(jīng)Kendall相關(guān)性檢驗， ESCC患者腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移擴(kuò)散、TNM分期與FLAP陽性表達(dá)呈正相關(guān)，分化程度與FLAP陽性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05)。

A：FLAP在癌旁組織中陽性表達(dá)；B：FLAP在ESCC組織中弱陽性表達(dá)；C：FLAP在ESCC組織中陽性表達(dá)；D：FLAP在ESCC組織中強(qiáng)陽性表達(dá)

表1 不同臨床病理特征ESCC患者FLAP陽性率比較[例(%)]

表2 FLAP陽性表達(dá)與ESCC患者不同臨床病理特征的相關(guān)性

3 討 論

文獻(xiàn)[9]指出，ESCC患者術(shù)后生存率較低，原因可能與術(shù)后腫瘤細(xì)胞復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散等有關(guān)。因此，尋找可反映ESCC預(yù)后的相關(guān)指標(biāo)對指導(dǎo)后期治療方案的擬定、改善預(yù)后、延長生存時間具有積極意義。

研究[10-11]發(fā)現(xiàn)，ESCC的發(fā)生、發(fā)展與炎癥反應(yīng)、酶代謝通路等相關(guān)?；ㄉ南┧岽x通路的代謝產(chǎn)物為白三烯。白三烯是一種炎癥刺激因子，不僅可促進(jìn)黏液分泌，還可促進(jìn)平滑肌收縮，增加血管通透性，同時可使白細(xì)胞聚集，促進(jìn)纖維細(xì)胞的增殖，在炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[12]。FLAP是花生四烯酸代謝通路中的一個關(guān)鍵酶，可借助激活5-脂氧合酶(5-LO)，同時給5-LO提供底物，將花生四烯酸呈遞給5-LO，繼而生成5-氫過氧化二十碳四烯酸，促進(jìn)白三烯A4的合成與分泌，同時可通過水解酶和合成酶作用產(chǎn)生白三烯B4、 白三烯C4、白三烯D4和白三烯E4[13-14]。并且FLAP可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)蛋白酪氨酸磷酸化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖病情進(jìn)展[15]。同時，MEK/MAPK信號途徑可抑制細(xì)胞凋亡，而FLAP可通過磷酸化MEK/MAPK促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，進(jìn)一步促進(jìn)病情進(jìn)展[16]。結(jié)合FLAP的特點，推測FLAP與ESCC的發(fā)生、發(fā)展存在某種關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示，ESCC組織標(biāo)本中的FLAP陽性率高于癌旁組織標(biāo)本，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移擴(kuò)散和TNMⅢ期患者的FLAP陽性率均高于腫瘤細(xì)胞未轉(zhuǎn)移擴(kuò)散和Ⅰ-Ⅱ期的患者，低分化患者的FLAP陽性率低于中高分化患者，初步提示FLAP陽性表達(dá)在ESCC患者不同組織間存在差異，且FLAP陽性表達(dá)與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移擴(kuò)散、TNM分期及分化程度相關(guān)。究其原因，F(xiàn)LAP可提高基質(zhì)金屬蛋白酶-2活性，促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)，從而刺激新生血管形成，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[17]。并且，F(xiàn)LAP可促進(jìn)白三烯A4、白三烯B4等代謝產(chǎn)物的合成與分泌，繼而增強(qiáng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[18-19]。但研究結(jié)果顯示，隨著分化程度的降低，F(xiàn)LAP的陽性表達(dá)升高，該結(jié)果與FLAP在高分期、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移擴(kuò)散中的強(qiáng)陽性表達(dá)有一定差異，可能與本研究納入患者的分化情況多集中于中、高分化有關(guān)，因此關(guān)于FLAP在不同分化程度ESCC患者中的表達(dá)情況仍需未來進(jìn)一步開展研究進(jìn)行分析[20-21]。最后，本研究分析了FLAP與ESCC不同臨床病理特征的關(guān)系，雙變量Kendall直線相關(guān)性檢驗結(jié)果顯示，ESCC患者的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移擴(kuò)散和TNM分期與FLAP陽性表達(dá)均呈正相關(guān)，分化程度與FLAP陽性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，從而證實了前述猜測。

綜上所述，與癌旁組織相比，F(xiàn)LAP在ESCC組織中的表達(dá)顯著增強(qiáng)，且ESCC患者癌組織中的FLAP陽性表達(dá)與TNM分期、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移擴(kuò)散及分化程度有關(guān)。因此，建議臨床可通過穿刺活檢測定ESCC患者癌組織中FLAP表達(dá)，以輔助評估患者分期、轉(zhuǎn)移及分化等情況。