韓 媛，曾新春

(1.西安市第一醫(yī)院心內(nèi)科，陜西 西安 710002；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院東院心血管內(nèi)科，陜西 西安 710089)

心力衰竭是各種心臟功能、結(jié)構(gòu)疾病導(dǎo)致收縮和(或)舒張功能障礙，以致肺循環(huán)和(或)體循環(huán)淤血，組織、器官血流灌注不足的一種病理狀態(tài)[1]。心力衰竭是多數(shù)心血管疾病的最終歸屬，也是一個(gè)涉及心血管、骨骼肌、呼吸、內(nèi)分泌等多個(gè)系統(tǒng)器官的臨床綜合征，具有比較高的致殘率與病死率[2]。雖然近年來(lái)隨著藥物技術(shù)與介入技術(shù)的發(fā)展，心力衰竭的治療取得了重要的進(jìn)展，但是很多患者的長(zhǎng)期預(yù)后仍不佳。深入揭示心力衰竭的病理生理機(jī)制，尋找新的治療方法具有重要價(jià)值[3-4]?，F(xiàn)代研究表明心肌纖維化在心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，心肌纖維化可增加心肌僵硬度，限制心肌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，影響心肌的收縮和舒張功能，降低室壁順應(yīng)性。心肌纖維化在病理上主要表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化、細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積，還包括心肌細(xì)胞的肥大、壞死、凋亡等[5]。N端B型利鈉肽原(N-terminal pro-B-type natriuretic peptide，NT-proBNP)由32個(gè)氨基酸組成，有擴(kuò)血管、利鈉、利尿作用，可預(yù)測(cè)房顫伴輕度心力衰竭患者電復(fù)律后房顫的復(fù)發(fā)，也可預(yù)測(cè)心臟外科手術(shù)術(shù)后房顫的發(fā)生，是由慢性炎癥引發(fā)心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[6]。研究[7-8]表明，半乳糖凝集素-3是心血管疾病患者左心室功能不全和不良預(yù)后的循環(huán)生物標(biāo)志物，可與受體結(jié)合而激活細(xì)胞，從而作為細(xì)胞外細(xì)胞因子發(fā)揮作用。半乳糖凝集素-3可參與心肌炎和心室重構(gòu)的過(guò)程，也可促進(jìn)心肌纖維化。柑橘果膠為半乳糖凝集素-3的抑制劑，可能存在改善心血管病變狀況的作用[9]。本研究具體探討半乳糖凝集素-3抑制劑柑橘果膠對(duì)心力衰竭大鼠血漿NT-proBNP及心肌纖維化的影響，以明確半乳糖凝集素-3抑制劑的作用效果與機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性Wistar大鼠45只，8～10周齡，體重230～250 g，購(gòu)自凱學(xué)生物科技(上海)有限公司，飼養(yǎng)于本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)條件：12 h明/暗循環(huán)環(huán)境，自由攝食飲水。本研究得到了醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，對(duì)動(dòng)物處置符合動(dòng)物倫理學(xué)原則。

1.2 主要試劑 抗Ⅰ型膠原蛋白抗體(批號(hào)：JC-A09786，稀釋度1∶1000)、抗Ⅲ型膠原蛋白抗體(批號(hào)：bs-0549R，稀釋度1∶1000)購(gòu)自上海機(jī)純實(shí)業(yè)有限公司；柑橘果膠(批號(hào)：pc168)購(gòu)自山東恒源康生物科技有限公司；酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：48T/96T)購(gòu)自上海語(yǔ)純生物科技有限公司。

1.3 心力衰竭大鼠模型制備與分組 將大鼠連接到小動(dòng)物呼吸機(jī)上，連續(xù)監(jiān)測(cè)生命體征。在胸骨頂部的第4個(gè)肋間隙處做一個(gè)切口，除去心包囊，并用體視顯微鏡觀察左前降支并進(jìn)行結(jié)扎，不損壞動(dòng)脈。關(guān)閉動(dòng)物呼吸機(jī)，觀察大鼠自發(fā)呼吸情況。建模成功標(biāo)準(zhǔn)：大鼠精神萎靡，被毛無(wú)光澤，一般情況差，食欲低下，靜息狀態(tài)下呼吸急促。將建模成功的心力衰竭模型大鼠共42只隨機(jī)平分為模型組、柑橘果膠A組、柑橘果膠B組。模型組給予10 mg/(kg·d)的0.9%氯化鈉溶液灌胃。柑橘果膠A組、B組分別給予0.10、0.20 mg/(kg·d)的柑橘果膠加入0.9%氯化鈉溶液灌胃，連續(xù)治療并觀察4周。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 心臟形態(tài)結(jié)構(gòu)指標(biāo)測(cè)定：所有大鼠在治療第2周與第4周進(jìn)行心臟形態(tài)結(jié)構(gòu)指標(biāo)測(cè)定。大鼠麻醉后，將注滿肝素化0.9%氯化鈉溶液導(dǎo)管一端連接超聲血流動(dòng)力學(xué)系統(tǒng)，另一端經(jīng)右頸總動(dòng)脈插入左心室，探頭頻率1.0～4.0 MHz，減小扇掃角度，觀察與記錄室間隔厚度(IVS)和左心室舒張末期內(nèi)徑(LVDD)。

1.4.2 心臟指數(shù)與心肌膠原容積分?jǐn)?shù)測(cè)定：在治療第4周與第8周，各組分別處死7只大鼠，開(kāi)胸后從主動(dòng)脈根部切取心臟，測(cè)定與記錄心臟指數(shù)。同時(shí)，進(jìn)行Masson染色，測(cè)定與記錄心肌膠原容積分?jǐn)?shù)。

1.4.3 血漿NT-ProBNP含量測(cè)定：在治療第4周與第8周，取處死大鼠腔靜脈血2 ml，抗凝后3000 r/min離心10 min，取上清血漿，立即置入-20 ℃冰箱密封保存。采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清NT-proBNP含量，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4.4 Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白相對(duì)表達(dá)水平測(cè)定：取所有處死大鼠的心臟組織制成勻漿，低溫離心后分離制備20 μg總蛋白的等分試樣，然后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用半干法轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，與抗Ⅰ型膠原蛋白抗體和抗Ⅲ型膠原蛋白抗體4 ℃孵育過(guò)夜，洗滌后與過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗37 ℃孵育1 h，洗滌后使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯影，檢測(cè)目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)心臟形態(tài)結(jié)構(gòu)指標(biāo)比較 見(jiàn)表1。在治療第2、4周，柑橘果膠A組、B組IVS高于模型組，LVDD低于模型組，且柑橘果膠B組與柑橘果膠A組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

2.2 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)心臟指數(shù)與心肌膠原容積分?jǐn)?shù)比較 見(jiàn)表2。在治療第4、8周，柑橘果膠A組、B組的心臟指數(shù)與心肌膠原容積分?jǐn)?shù)低于模型組，且柑橘果膠B組低于柑橘果膠A組(均P<0.05)。

表2 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)心臟指數(shù)與心肌膠原容積分?jǐn)?shù)比較

2.3 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血漿NT-proBNP含量比較 見(jiàn)表3。在治療第4、8周，柑橘果膠A組、B組血漿NT-proBNP含量低于模型組，且柑橘果膠B組低于柑橘果膠A組(均P<0.05)。

2.4 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 見(jiàn)表4。在治療第4、8周，柑橘果膠A組、B組心臟組織Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白相對(duì)表達(dá)水平低于模型組，且柑橘果膠B組低于柑橘果膠A組(均P<0.05)。

表3 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血漿NT-proBNP含量比較(ng/L)

表4 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

3 討 論

心力衰竭當(dāng)前在臨床上比較常見(jiàn)，心肌重構(gòu)與心室重塑是心力衰竭發(fā)生、發(fā)展的基本機(jī)制，主要表現(xiàn)為心肌成纖維細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化，心肌細(xì)胞肥大、壞死、凋亡，細(xì)胞外基質(zhì)膠原纖維沉積等[10]。隨著我國(guó)進(jìn)入老齡化階段，心力衰竭的患病率呈上升趨勢(shì)，已經(jīng)成為一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，并且當(dāng)前心力衰竭的治療方法也沒(méi)有取得重大進(jìn)展。已有研究[11]表明，半乳糖凝集素-3抑制劑可通過(guò)改善心肌組織異常基因表達(dá)及調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白的表達(dá)發(fā)揮增強(qiáng)心肌收縮力的作用，從而改善機(jī)體的運(yùn)動(dòng)耐量、生活質(zhì)量與心功能。本研究顯示，在治療第2、4周時(shí)，柑橘果膠A組、B組IVS高于模型組，LVDD低于模型組，且柑橘果膠B組與A組比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明半乳糖凝集素-3抑制劑在心力衰竭大鼠的應(yīng)用能改善心臟結(jié)構(gòu)形態(tài)。研究[12]顯示，半乳糖凝集素-3抑制劑參與心臟纖維化的調(diào)節(jié)，如心肌細(xì)胞的擴(kuò)展及繼發(fā)于心肌結(jié)構(gòu)的改變，可能對(duì)心肌損傷發(fā)揮保護(hù)作用。半乳糖凝集素-3抑制劑還可逆轉(zhuǎn)異戊二烯相關(guān)的心室功能障礙，減少心肌炎和纖維化的發(fā)生，從而改善機(jī)體的心室重構(gòu)狀況[13]。

心力衰竭患者可表現(xiàn)為瘢痕形成、心肌細(xì)胞壞死、纖維組織增生，從而使心臟出現(xiàn)肥大和心室重塑[14]。現(xiàn)代研究[15]表明，心力衰竭期間的心臟重塑涉及不同階段的心臟對(duì)前負(fù)荷和后負(fù)荷的致病性改變的適應(yīng)性反應(yīng)，也關(guān)系到表觀遺傳學(xué)的改變，從而導(dǎo)致機(jī)械性心肌特性的改變。本研究顯示，在治療第4、8周時(shí)，柑橘果膠A組、B組心臟指數(shù)與心肌膠原容積分?jǐn)?shù)低于模型組，且柑橘果膠B組低于A組，表明半乳糖凝集素-3抑制劑在心力衰竭大鼠的應(yīng)用能改善心臟指數(shù)與心肌膠原容積分?jǐn)?shù)。從機(jī)制上分析，半乳糖凝集素-3抑制劑可阻止心臟過(guò)度牽拉，抑制活性氧的表達(dá)，從而抑制心臟細(xì)胞的凋亡。研究[16-17]顯示半乳糖凝集素-3抑制劑可通過(guò)保護(hù)心肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞死亡的方式來(lái)減弱心肌細(xì)胞的損害，從而發(fā)揮心功能保護(hù)作用。

心力衰竭治療模式歷經(jīng)了強(qiáng)心、擴(kuò)張血管、利尿、糾正血流動(dòng)力學(xué)異常等過(guò)程，但目前心力衰竭的病死率仍然較高，為此延緩疾病進(jìn)展、逆轉(zhuǎn)衰竭心臟結(jié)構(gòu)和功能是當(dāng)前研究的重點(diǎn)[18]。NT-proBNP是利鈉肽類的一種肽類激素，部分房顫患者常伴有基礎(chǔ)心血管疾病，可直接引起NT-proBNP水平增加，也是腦鈉肽釋放增加的重要原因，心房?jī)?nèi)NT-proBNP mRNA水平與NT-proBNP生成量隨著心房壓力緊張性的增加而上升[19]。本研究顯示，在治療第4、8周時(shí)，柑橘果膠A組、B組的血漿NT-proBNP含量低于模型組，且柑橘果膠B組低于A組，表明半乳糖凝集素-3抑制劑在心力衰竭大鼠的應(yīng)用能抑制NT-proBNP的表達(dá)。從機(jī)制上分析，半乳糖凝集素-3抑制劑可促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌纖維母細(xì)胞，促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞合成膠原纖維的形成，促進(jìn)心室重構(gòu)，從而改善心力衰竭的病情[20]。

在心力衰竭機(jī)體中，心室重塑不僅涉及心肌細(xì)胞肥大，還與心肌纖維化存在相關(guān)性，后者可增加左室心功能失代償和心律失常的風(fēng)險(xiǎn)[21]。膠原纖維是細(xì)胞外基質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)蛋白，Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白是構(gòu)成心肌膠原纖維網(wǎng)的主要成分，可分泌基質(zhì)金屬蛋白酶，促使成纖維細(xì)胞增殖并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致機(jī)體病情惡化。本研究顯示，在治療第4、8周時(shí)，柑橘果膠A組、B組的心臟組織Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白相對(duì)表達(dá)水平低于模型組，且柑橘果膠B組低于A組，表明半乳糖凝集素-3抑制劑在心力衰竭大鼠的應(yīng)用能抑制心臟組織Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)水平。從機(jī)制上分析，半乳糖凝集素-3抑制劑對(duì)缺血-再灌注損傷具有很好的治療作用，可促進(jìn)纖維增生減少，抑制心肌纖維化和延遲心室重構(gòu)。研究[22]顯示半乳糖凝集素-3抑制劑可顯著改善缺血性心力衰竭大鼠左心室血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，還可抑制心臟炎癥指標(biāo)的釋放，從而改善心肌纖維化。

綜上所述，半乳糖凝集素-3抑制劑柑橘果膠能抑制心力衰竭大鼠血漿NT-proBNP的表達(dá)，改善心肌纖維化，進(jìn)而改善心臟指數(shù)、心肌膠原容積分?jǐn)?shù)以及心臟結(jié)構(gòu)形態(tài)。本研究由于經(jīng)費(fèi)原因，觀察的指標(biāo)比較少，且沒(méi)有納入其他藥物進(jìn)行對(duì)比分析，將在后續(xù)研究中探討。