任磊鵬，張新偉，王瑞潔，李 潛，孫黨澤，劉玉鋼

(1.西安市胸科醫(yī)院胸外科，陜西 西安 710100；2.陜西省腫瘤醫(yī)院胸外科，陜西 西安 710065；3.西安市東方醫(yī)院內(nèi)科，陜西 西安710043)

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 80只SPF級(jí)健康雄性裸鼠，體重18～22 g，購(gòu)自陜西省中醫(yī)藥研究院食品化妝品檢驗(yàn)檢定中心，許可證號(hào)：SYXK(陜)2018-009。于溫度20～24 ℃、相對(duì)濕度40%～60%條件下進(jìn)行飼養(yǎng)，光照每日12 h，自由攝食和飲水，喂養(yǎng)1周。

1.2 主要試劑 TPT(批號(hào)：AZ21090101)購(gòu)自成都艾博克生物科技有限公司；人NSCLC細(xì)胞H1993(批號(hào)：YS1790C)購(gòu)自上海晶風(fēng)生物科技有限公司；兔抗人Ki-67(批號(hào)：ab15580)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；DMEM培養(yǎng)基(批號(hào)：51435C)、胰蛋白酶(批號(hào)：T2600000)購(gòu)自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：C0002)購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3，批號(hào)：ab32042)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C(VEGFC，批號(hào)：ab9546)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2，批號(hào)：ab181286)抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；小鼠胱抑素C(Cys-C)ELISA檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：PC215)購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將人NSCLC細(xì)胞H1993接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化后制成1×107/ml細(xì)胞懸濁液。

1.4 動(dòng)物模型的建立與分組 每只裸鼠注射0.2 ml細(xì)胞懸濁液，注射部位為左側(cè)腋部皮下。造模后，每間隔5 d，測(cè)量腫瘤直徑，當(dāng)腫瘤體積≥100 mm3時(shí)開始給藥。將造模成功的裸鼠隨機(jī)分成對(duì)照組(CG組)、TPT低劑量組(LG組)、TPT中劑量組(MG組)和TPT高劑量組(HG組)，每組20只。TPT給藥組以TPT灌胃，劑量依次為0.5、1.0、1.5 mg/(kg·d)。對(duì)照組裸鼠灌胃等量0.9%氯化鈉溶液。每日給藥1次，連續(xù)30 d。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 一般情況：治療過(guò)程中觀察各組裸鼠的飲食、飲水、體重及死亡等情況。

1.5.2 腫瘤體積及腫瘤抑制率：每隔5 d采用游標(biāo)卡尺對(duì)腫瘤的長(zhǎng)徑(a)和短徑(b)進(jìn)行測(cè)量，腫瘤體積(V)=(a×b)3/2×0.35。治療30 d后將裸鼠斷頸處死，剝離皮下腫瘤后稱重，計(jì)算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率(%)=(對(duì)照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/對(duì)照組平均瘤重×100%。

1.5.3 細(xì)胞凋亡率：對(duì)腫瘤組織稱重后，用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟切片，進(jìn)行一系列處理，包括梯度脫水、清洗、顯色、透明和封片等，采用光學(xué)顯微鏡觀察并拍照，并用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行分析。細(xì)胞凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5.4 相關(guān)蛋白表達(dá)水平：取部分腫瘤組織于液氮中速凍、研磨，加入1000 μl RIPA裂解液于冰上裂解30 min后，1500 r/min離心10 min，采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。然后，采用蛋白免疫印跡法(Western blot)對(duì)腫瘤組織中相關(guān)蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。獲得的圖片采用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析。內(nèi)參為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。

由表1可知，在超稀植模式下，對(duì)油菜進(jìn)行覆膜栽培及普通不覆膜栽培，油菜莖粗有較明顯的差異，與覆膜對(duì)油菜植株高度的影響類似，覆膜稀植油菜較不覆膜種植油菜莖粗在直徑上大約2.6 mm。

1.5.5 胱抑素C濃度：采用ELISA法對(duì)胱抑素C的濃度進(jìn)行檢測(cè)，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 四組裸鼠一般情況觀察 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，MG組和HG組裸鼠一般狀態(tài)良好，反應(yīng)靈敏，食欲旺盛。對(duì)照組裸鼠一般狀態(tài)較差，反應(yīng)遲鈍，飲食、飲水差。LG組裸鼠一般狀態(tài)一般，反應(yīng)相對(duì)遲鈍，飲食、飲水一般。與對(duì)照組相比，給藥30 d時(shí)LG組、MG組和HG組裸鼠體重明顯升高(均P<0.05)，見表1。LG組裸鼠于第11天開始出現(xiàn)死亡，給藥30 d時(shí)LG組、MG組和HG組裸鼠的死亡率明顯低于CG組(均P<0.05)，見表1。

2.2 四組裸鼠不同時(shí)間點(diǎn)腫瘤體積比較 見表2。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，四組裸鼠腫瘤體積均逐漸增加。與CG組比較，給藥5 d后，LG組、MG組和HG組裸鼠腫瘤體積顯著降低(均P<0.05)。

2.3 四組裸鼠腫瘤抑制率比較 LG組、MG組和HG組裸鼠腫瘤抑制率分別為30.65%、43.54%和65.93%。LG組、MG組和HG組平均瘤重顯著低于對(duì)照組(均P<0.05)。

表1 四組裸鼠體重和死亡情況比較

表2 四組裸鼠不同時(shí)間點(diǎn)腫瘤體積比較(mm3)

2.4 四組裸鼠細(xì)胞凋亡率比較 給藥30 d后，隨著給藥濃度增大，腫瘤組織中細(xì)胞凋亡率呈逐漸增加趨勢(shì)。LG組、MG組和HG組裸鼠腫瘤組織中細(xì)胞凋亡率分別為(12.62±2.53)%、(32.06±4.16)%和(53.32±4.61)%，CG組細(xì)胞凋亡率為(5.17±1.99)%，因此LG組、MG組和HG組裸鼠腫瘤組織中細(xì)胞凋亡率低于CG組(均P<0.05)。

2.5 四組裸鼠細(xì)胞相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 見表3。給藥30 d后，裸鼠腫瘤組織中Caspase-3表達(dá)水平升高，Ki-67、VEGFC和MMP-2表達(dá)水平降低，升高和降低幅度與TPT給藥濃度呈正相關(guān)關(guān)系。LG組、MG組和HG組裸鼠腫瘤組織中Caspase-3相對(duì)表達(dá)水平高于CG組，Ki-67、VEGFC和MMP-2相對(duì)表達(dá)水平低于CG組(均P<0.05)。

表3 四組裸鼠細(xì)胞相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

2.6 四組裸鼠胱抑素C表達(dá)水平比較 給藥30 d后，裸鼠腫瘤組織中胱抑素C表達(dá)水平降低，降低幅度與TPT給藥濃度呈正相關(guān)關(guān)系。LG組裸鼠腫瘤組織中胱抑素C表達(dá)量為(468.74±10.74)μg/ml，MG組為(403.13±13.71)μg/ml，HG組為(331.17±12.31)μg/ml，CG組為(574.03±13.19)μg/ml，因此，LG組、MG組和HG組裸鼠腫瘤組織中胱抑素C表達(dá)量低于CG組(均P<0.05)。

3 討 論

國(guó)家癌癥中心2019年公布的數(shù)據(jù)[9]顯示，肺癌位居我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病和死亡首位，2015年我國(guó)新發(fā)肺癌病例約78.7萬(wàn)例，發(fā)病率為57.26/10萬(wàn)，中標(biāo)率為35.96/10萬(wàn)；死亡數(shù)約63.1萬(wàn)例，病死率為45.87/10萬(wàn)，中標(biāo)率為28.16/10萬(wàn)。如不及時(shí)采取有效控制措施，預(yù)計(jì)到2025年，我國(guó)肺癌患病人數(shù)將達(dá)到100萬(wàn)，成為世界第一肺癌大國(guó)。其中，NSCLC占到所有肺癌80%以上，約30%～40%的患者確診時(shí)已進(jìn)展為局部晚期，40%的患者為已進(jìn)展轉(zhuǎn)移性肺癌。NSCLC有三種亞型，即腺癌、鱗狀細(xì)胞癌和大細(xì)胞癌，其中肺腺癌和肺鱗癌是常見的亞型。目前，手術(shù)、放療、化療仍是NSCLC的有效治療手段。對(duì)于早期及部分Ⅲa期NSCLC患者來(lái)說(shuō)，手術(shù)治療仍是首選的治療方法[10]。晚期NSCLC患者因無(wú)法手術(shù)或手術(shù)治療效果不明確，臨床上多采用放療、化療等治療方法?；煄缀踹m用于各種病理類型的肺癌，且可單獨(dú)或與其他治療方式聯(lián)合使用，是晚期肺癌主要治療方法。但化療藥物易出現(xiàn)不敏感或耐藥等問(wèn)題，嚴(yán)重影響了臨床療效。TPT屬于新興喜樹堿衍生物的半合成藥物，其在體內(nèi)分布速度快、吸收好，具有較強(qiáng)抗癌作用，被廣泛應(yīng)用于婦科腫瘤、腦轉(zhuǎn)移瘤、SCLC、胃腸癌等的化療[11]。研究[8]表明，TPT是拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的抑制劑，一方面可通過(guò)干擾DNA復(fù)制控制DNA鏈斷裂位點(diǎn)，引起細(xì)胞不可逆損傷；另一方面，TPT可以通過(guò)作用于腫瘤細(xì)胞，影響其增殖和遷移等，從而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。

細(xì)胞凋亡于20世紀(jì)被首次提出。機(jī)體每天通過(guò)凋亡清除異常細(xì)胞，維持體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，防止疾病的發(fā)生。腫瘤的發(fā)生是由細(xì)胞增殖與死亡的速度平衡失調(diào)造成的。細(xì)胞凋亡受到多條信號(hào)通路的調(diào)控，其中細(xì)胞膜死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑和線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑研究較多。半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族作為兩條途徑的共同通路，是程序性死亡或凋亡的關(guān)鍵介質(zhì)[12]。Caspase-3作為凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵酶，其活性受到抑制可引起細(xì)胞凋亡障礙，進(jìn)而引起多種腫瘤細(xì)胞的增殖[13]。研究[14-15]表明凋亡蛋白Bax、Casepes-3在NSCLC中高表達(dá)，Bax、Caspase-3蛋白免疫組化陽(yáng)性結(jié)果評(píng)分與腫瘤細(xì)胞的凋亡指數(shù)呈顯著正相關(guān)。而TPT對(duì)肺癌、宮頸癌、食管癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷和誘導(dǎo)凋亡作用，其作用機(jī)制可能與Caspase-8、Caspase-3等的有序性活化有關(guān)。除凋亡過(guò)程受阻外，異常細(xì)胞無(wú)限增殖是惡性腫瘤發(fā)展的另一本質(zhì)。Ki-67是一種重要的細(xì)胞增殖標(biāo)志物，主要在細(xì)胞核表達(dá)。Ki-67被發(fā)現(xiàn)在NSCLC、結(jié)直腸癌、乳腺癌、甲狀腺癌等多種腫瘤組織中高表達(dá)，其表達(dá)水平與NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度和臨床分期呈正相關(guān)[16]。Previs等[17]研究表明，納布-紫杉醇與TPT聯(lián)合使用可顯著降低腫瘤重量，其機(jī)制可能與Caspase-3表達(dá)刺激血管生成及Ki-67表達(dá)抑制相關(guān)。

腫瘤的侵襲、遷移指腫瘤細(xì)胞脫離原位置，侵入并穿過(guò)周圍基質(zhì)，經(jīng)血液或淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至其他部位的過(guò)程，該過(guò)程也同樣受到多因素、多基因的相互協(xié)調(diào)作用。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解有關(guān)，而ECM的降解主要依賴各種蛋白水解酶，其中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)為ECM降解的主要酶類。MMP-2是MMP家族的重要成員[18]。研究[19]表明通過(guò)負(fù)調(diào)控MMP-2的表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞遷移和腫瘤生長(zhǎng)，從而影響腫瘤的發(fā)展，達(dá)到抑制或治療腫瘤的目的。VEGFC是新近發(fā)現(xiàn)的VEGF家族新成員，可由腫瘤細(xì)胞分泌，與受體VEGFR-3結(jié)合后刺激淋巴管增生。研究[20]發(fā)現(xiàn)，VEGFC在胃癌、宮頸癌、乳腺癌、肺癌等多種腫瘤中高表達(dá)，其表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、患者生存率、預(yù)后等密切相關(guān)。

TPT屬于廣譜抗腫瘤藥物，近年來(lái)被作為二線藥物被應(yīng)用于SCLC、婦科腫瘤、胃癌等的治療，但其單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用于NSCLC的治療較少。因此，本研究將不同濃度TPT作用于非小細(xì)胞癌裸鼠30 d后，通過(guò)裸鼠體重、死亡率、腫瘤體積、瘤細(xì)胞凋亡率以及相關(guān)蛋白表達(dá)情況等的觀察和檢測(cè)，結(jié)果與文獻(xiàn)[21]基本一致，說(shuō)明TPT對(duì)裸鼠NSCLC具有較好的治療效果。

綜上所述，TPT可降低NSCLC移植瘤裸鼠的病死率，對(duì)NSCLC移植瘤具有較好的抑制作用，其機(jī)制可能與TPT增加H1993細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)，降低胱抑素C、Ki-67及MMP-2蛋白表達(dá)水平有關(guān)。