馬 飛，劉 琳

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院腎臟內(nèi)科，遼寧 錦州 121002；2.赤峰市醫(yī)院血液凈化中心，內(nèi)蒙古 赤峰 024099)

腎間質(zhì)纖維化(Renal interstitial fibrosis，RIF)作為各種腎臟疾病發(fā)展終末階段，最終導(dǎo)致終末期腎臟病(End stage renal disease，ESRD)，只能接受腎臟替代療法，因此已經(jīng)成為一個日益嚴(yán)重的問題。RIF是慢性腎衰竭(Chronic renal failure，CRF)呈進(jìn)行性發(fā)展的始動因素，表現(xiàn)出腎小管間質(zhì)纖維化(Tubulo interstitial fibrosis，TIF)及腎小球硬化的病理特征[1-2]。在此基礎(chǔ)上各種腎臟損傷后的腎小管是如何觸發(fā)成纖維細(xì)胞活化已成為該領(lǐng)域研究的熱點問題。Wnt信號功能缺陷可能導(dǎo)致各種人類疾病，如生長發(fā)育異常和腫瘤[3]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在RIF中起關(guān)鍵作用的Wnt信號傳導(dǎo)通路蛋白和相關(guān)基因[4]，這可能為抗RIF治療的設(shè)計提供新的突破口。腎衰寧片主要用于治療慢性腎臟病(Chronic kidney disease，CKD)，且療效已被證實[5]。然而，對其如何發(fā)揮延緩RIF的作用機(jī)制尚不清楚。鑒于此，本研究觀察腎衰寧片對單側(cè)輸尿管梗阻(Unilateral ureteral obstruction，UUO)大鼠腎臟功能指標(biāo)、蛋白尿水平、腎臟病理以及Wnt1、β-catenin的影響，為今后該類疾病的臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級Wistar雄性大鼠45只[許可證號：SCXK(京)2019-0010]，體重180～220 g，月齡為6～8周，購于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司。本研究經(jīng)倫理委員會審核和批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 腎衰寧片(國藥準(zhǔn)字Z20060030)購于山西德元堂藥業(yè)有限公司；兔抗大鼠Wnt1單克隆抗體(批號：AF5315)購于Santa Cruz公司；羊抗大鼠β-catenin單克隆抗體(批號：51067-2-AP)購于Proteintech公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組與模型制備：將45只健康大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組(S組)、模型組(U組)和治療組(T組)，每組15只。U組及T組大鼠選擇右側(cè)腎盂和輸尿管交界區(qū)下2 cm處進(jìn)行手術(shù)結(jié)扎，以造成右側(cè)腎臟積水模型。S組常規(guī)進(jìn)行手術(shù)，不結(jié)扎右側(cè)輸尿管。

1.3.2 給藥方法：T組從術(shù)后第1日起給予腎衰寧片0.19 g/(kg·d)進(jìn)行灌胃，S組和U組每日給予相同容量的0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行灌胃。

1.3.3 標(biāo)本收集：三組大鼠在術(shù)后7、14、21 d分別處死5只。各組大鼠處死前1 d通過反射排尿法收集尿液并保存待查。取血后立即處死大鼠，在無菌條件下快速解剖出大鼠的右腎，用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，用紗布吸干表面水分。經(jīng)冠狀縱切口保存大鼠約1/4的全腎組織。標(biāo)本腎組織采用10%福爾馬林溶液中固定，然后脫水、石蠟包埋、切片(厚度要求3～4 μm)，進(jìn)行腎病理形態(tài)學(xué)、血液檢測和免疫組化染色。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 血、尿指標(biāo)檢測：采用生化檢測儀檢測血清肌酐(CREA)和尿素氮(BUN)。應(yīng)用定量法檢測尿微量白蛋白(mAlb)。

1.4.2 腎臟病理形態(tài)：在400倍光鏡下選取10個腎實質(zhì)視野，分別計算各個視野的評分，取平均值。HE染色后進(jìn)行結(jié)果判定，根據(jù)分布情況進(jìn)行RIF病變嚴(yán)重程度評分[6]。

1.4.3 膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)：Masson染色后，RIF病變越重，腎間質(zhì)藍(lán)色膠原沉積越重，并且著色越鮮亮。于400倍光鏡下選擇10個腎實質(zhì)視野，計算膠原陽性的藍(lán)色面積與總面積的百分比，即CVF。

1.4.4 Wnt1和β-catenin表達(dá)情況：免疫組化染色后，陽性區(qū)域為棕黃色，顏色越重代表表達(dá)越明顯，核為淺藍(lán)色。在圖像分析系統(tǒng)的幫助下，利用光學(xué)顯微鏡采集切片圖像，隨機(jī)選取10個高倍鏡(400倍)視野，采用Image J軟件計算Wnt1和β-catenin的平均光密度(AOD)。

2 結(jié) 果

2.1 三組大鼠術(shù)后不同時間點血清CREA、BUN及尿mAlb水平比較 見圖1。術(shù)后7、14、21 d，U組血清CREA、BUN水平顯著高于S組和T組，且T組高于S組(均P<0.05)。術(shù)后7、14 d，三組大鼠尿mAlb水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。隨著梗阻時間延長，術(shù)后21 d三組尿mAlb水平出現(xiàn)顯著變化，S組尿mAlb水平最低，T組次之，U組最高，三組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

注：與S組比較，*P<0.05；與U組比較，#P<0.05

2.2 腎組織病理學(xué)改變

2.2.1 腎組織形態(tài)肉眼觀察：S組腎外形正常，大小正常，外觀呈暗紅色，各時間點均無明顯變化；術(shù)后7 d，U組和T組病側(cè)腎外形增大、腫脹，外觀顏色逐漸變淡，腎實質(zhì)厚度變??；術(shù)后14 d， U組和T組病側(cè)腎進(jìn)一步增大，外觀顏色變淡，腎積液，腎實質(zhì)厚度進(jìn)一步變??；術(shù)后21 d，U組和T組病側(cè)腎外形體積明顯增大，外觀顏色進(jìn)一步變淡，腫脹明顯，腎積液加重，腎實質(zhì)厚度更薄。

2.2.2 腎組織HE染色結(jié)果：見圖2。S組腎小管上皮細(xì)胞(RIEC)基本正常。術(shù)后7 d， U組和T組RIEC輕度萎縮及壞死，空泡變性，炎癥細(xì)胞在腎間質(zhì)局灶性浸潤，RIEC刷狀邊緣脫落，腎間質(zhì)出現(xiàn)輕度纖維化；術(shù)后14 d，U組和T組RIEC中度萎縮，空泡變性范圍增大，壞死，炎癥細(xì)胞在腎間質(zhì)仍呈彌漫性浸潤，腎間質(zhì)中度纖維化；術(shù)后21 d，U組和T組病變更為嚴(yán)重，RIEC嚴(yán)重萎縮，重度壞死，伴有大量炎癥細(xì)胞，腎間質(zhì)膠原纖維增生明顯，RIF顯著。統(tǒng)計學(xué)分析顯示，U組及T組大鼠RIF病變嚴(yán)重程度評分明顯高于S組(均P<0.01)；與U組比較，T組各時間點RIF病變嚴(yán)重程度評分降低，但仍高于S組(均P<0.05)。見表1。

圖2 三組大鼠術(shù)后不同時間點腎組織病理學(xué)變化(HE染色，×400)

表1 三組大鼠術(shù)后不同時間點RIF病變嚴(yán)重程度評分比較(分)

2.3 三組大鼠腎間質(zhì)CVF比較 見表2。Masson染色結(jié)果顯示，S組大鼠腎間質(zhì)基本正常，各時間點無明顯變化；U組和T組藍(lán)染纖維化主要出現(xiàn)在小管的間質(zhì)區(qū)。術(shù)后7、14、21 d，U組和T組腎間質(zhì)CVF高于S組，且隨梗阻時間推移CVF呈進(jìn)行性增高(均P<0.05)。T組術(shù)后各時間點CVF高于S組，但低于U組(均P<0.05)。

表2 三組大鼠腎間質(zhì)CVF比較(%)

2.4 三組大鼠腎組織Wnt1和β-catenin AOD比較 見表3。免疫組化染色結(jié)果顯示，S組Wnt1和β-catenin表達(dá)呈陰性，U組和T組表達(dá)呈陽性，為深黃色，并且在腎小管上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞上呈現(xiàn)強(qiáng)陽性表達(dá)，多為褐色。采用Image J軟件計算Wnt1和β-catenin的AOD后進(jìn)行比較，S組最低，且術(shù)后各時間點AOD比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。U組和T組AOD高于S組，且隨梗阻時間推移AOD呈進(jìn)行性增高(均P<0.05)。T組術(shù)后各時間點AOD高于S組，但低于U組(均P<0.05)。

表3 三組大鼠腎組織Wnt1和β-catenin AOD比較

3 討 論

RIF是許多不同原因引起CKD的共同病理學(xué)最終結(jié)果，其中Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路在RIF的進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用并逐漸被認(rèn)識[7-9]。由于目前的治療方法療效有限，研發(fā)針對參與RIF發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵分子途徑的新藥物來阻止其進(jìn)展仍是一項艱巨任務(wù)。抑制RIF是CKD的主要治療方向，雖然臨床治療取得了一定效果，但對Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)途徑的研究較少。

在本研究中過程中，我們系統(tǒng)收集了血清CREA和BUN、尿mAlb以及腎臟病理結(jié)果，發(fā)現(xiàn)三組大鼠尿mAlb水平在術(shù)后7、14 d無顯著變化，但隨著梗阻時間延長，術(shù)后21 d三組尿mAlb水平出現(xiàn)顯著變化，S組尿mAlb水平最低，T組次之，U組最高，可見腎衰寧片對終末期腎臟病的蛋白尿控制有一定作用，從而發(fā)揮保護(hù)腎臟功能的作用。腎臟功能方面檢查發(fā)現(xiàn)在各個時間點U組及T組大鼠血清CREA、BUN均顯著高于S組，血清CREA、BUN進(jìn)行性升高，提示腎功能進(jìn)一步惡化，但T組仍能反映出腎衰寧片具有明顯的腎臟保護(hù)作用，可以降低血清CREA、BUN。肉眼觀察腎臟大體標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，S組外觀無明顯異常，各個時間點也無明顯異常變化，但在U組及T組腎臟體積逐漸腫脹。HE染色發(fā)現(xiàn)，S組腎臟病理無明顯變化，但偶有炎癥細(xì)胞輕度浸潤，考慮這種輕度變化與手術(shù)應(yīng)激相關(guān)，U組及T組術(shù)后7 d開始逐漸出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤并伴有輕度纖維化，術(shù)后14 d大量炎癥細(xì)胞浸潤并出現(xiàn)中度纖維化，伴有小管壞死、萎縮，術(shù)后21 d病變進(jìn)一步加重；通過對RIF進(jìn)行病理評分發(fā)現(xiàn)，在各時間點T組病理損傷程度均比U組輕。Masson染色發(fā)現(xiàn)，藍(lán)染腎間質(zhì)膠原纖維在U組和T組術(shù)后7 d時開始出現(xiàn)，并隨著時間延長，藍(lán)染面積逐漸擴(kuò)大，統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)U組CVF最高，T組次之，S組最低，提示T組腎間質(zhì)纖維化程度相較于U組明顯改善，說明腎衰寧片能減輕RIF病理變化，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用，同時也能控制終末期腎臟病蛋白尿。

Wnt信號通路的功能主要體現(xiàn)在有節(jié)律地處于靜止及活化狀態(tài)，在這個過程中產(chǎn)生的糖脂蛋白物質(zhì)可誘導(dǎo)正常組織細(xì)胞進(jìn)行新陳代謝，參與組織代謝過程中的細(xì)胞增殖和凋亡[10-11]。正常情況下，腎臟中Wnt/β-catenin信號途徑處于靜態(tài)狀態(tài)，但當(dāng)β-catenin持續(xù)積累時，Wnt信號通路被活化，導(dǎo)致大量炎癥細(xì)胞浸潤、增殖和分化[12-13]。因此，下調(diào)Wnt/β-catenin信號通路活性可在一定程度上抑制RIF的進(jìn)展，達(dá)到保護(hù)腎功能的作用。Wnt1和β-catenin的表達(dá)在術(shù)后7、14、21 d逐漸增多，輸尿管梗阻引起Wnt/β-catenin明顯表達(dá)，主要表現(xiàn)在腎小管上皮。免疫組化染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Wnt1和β-catenin表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)，腎衰寧片可能是通過獨立于體內(nèi)的這種信號通路的激活和中斷而干預(yù)這一機(jī)制來發(fā)揮其抗纖維化作用的。當(dāng)然，RIF除了Wnt/β-catenin的激活，還受到其他信號通路的調(diào)控，最近的研究提出了幾種不同程度干擾Wnt信號的方法。Wnt拮抗劑Dapper3的缺失可導(dǎo)致UUO模型中β-catenin的聚集、Wnt靶向的促纖維化基因的激活和纖維化表型的惡化[14-15]。除了基因調(diào)控外，干擾Wnt信號的小分子也可以調(diào)節(jié)纖維化的發(fā)展，因此可能成為治療纖維化的新途徑[16]。例如，維生素D對腎間質(zhì)纖維化有保護(hù)作用，其主要是通過對降鈣素與T細(xì)胞因子4(TCF-4)競爭β-catenin來抑制Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)[17]；ICG-001可抑制Wnt/β-catenin活性，同樣也能減緩RIF的發(fā)生及發(fā)展過程[18]。研究[19]發(fā)現(xiàn)，黃芪可以通過影響Wnt信號通路延緩RIF進(jìn)程，從而減輕腎臟病變，保護(hù)腎臟機(jī)能。此外，有研究[20]報道黃精皂苷可以抑制Wnt/β-catenin信號通路的活化，從而抑制TIF的進(jìn)展，最終達(dá)到保護(hù)腎臟的效果。

綜上所述，腎衰寧片可改善UUO大鼠RIF程度，保護(hù)腎功能，降低尿mAlb水平，其機(jī)制可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)，選擇性抑制Wnt/β-catenin信號通路可能為纖維化腎病的治療提供新的策略。但本研究僅僅是針對動物模型的有效性研究，藥物用于臨床是否有效還需要在未來做大量的研究加以驗證。