趙 寧，付麗娜，李偉澤，王小寧，楊 霞

（西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021）

引 言

熊果苷是從多種不同植物中提取得到的天然活性物質(zhì)，是葡萄糖基化的氫醌衍生物，廣泛存在于動(dòng)物、植物及微生物細(xì)胞中。由于熊果苷結(jié)構(gòu)中的葡萄糖殘基具有親水性，酚羥基具有抑制黑色素合成酶的作用，故其常作為美白添加劑，用于化妝品行業(yè)，起保濕美白功效。目前常用的有兩種類型：α-熊果苷和β-熊果苷。研究表明，α-熊果苷不僅在美白功效方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于β-熊果苷，而且也更加安全[1]。因此隨著研究的逐步深入，α-熊果苷作為美白劑的產(chǎn)品越來(lái)越多，在日化產(chǎn)業(yè)方面有著廣闊的市場(chǎng)前景。

當(dāng)歸油是從傘形科植物當(dāng)歸（Angelica sinensis（Oliv.）Diels）的根中提取的一種具有特色香氣的淺紅棕色油狀液體。其主要成分為藁本內(nèi)酯，不僅能夠抗炎、擴(kuò)張毛細(xì)血管，增強(qiáng)血液循環(huán)，調(diào)節(jié)免疫功能，而且還有對(duì)皮膚滋養(yǎng)保護(hù)、促使干裂皮膚愈合的作用，因此作為添加劑廣泛應(yīng)用于護(hù)膚產(chǎn)品。同時(shí)，當(dāng)歸油也是一種良好的天然透皮吸收促進(jìn)劑[2,3]，將其用于經(jīng)皮制劑，可同時(shí)發(fā)揮治療與促滲的協(xié)同作用。白及多糖（bletilla polysaccharide，BSP）是從蘭科植物白及[Bletilla striata（Thund.）Reichb.f.]的干燥塊莖中提出的一種水溶性高分子多糖，相對(duì)分子質(zhì)量大，溶于水可形成生物黏附性良好的空間三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠。BSP 具有良好的止血、抗炎、促進(jìn)傷口及潰瘍愈合、促進(jìn)黏膜新生等多種藥理作用，是一種性能優(yōu)越的可生物降解的新型高分子材料[4]。因此本文以白及多糖為基質(zhì)，以當(dāng)歸油為透皮吸收促進(jìn)劑，制備白及多糖α-熊果苷微凝膠貼片，研究當(dāng)歸油對(duì)微凝膠貼片中α-熊果苷透皮吸收的促進(jìn)作用及影響規(guī)律，為揮發(fā)油作為透皮吸收促進(jìn)劑的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

電子天平（SE602F 奧豪斯儀器有限公司）；電子分析天平（QUINTIX224-ICN 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；電熱水浴箱（HH-S4 背景科偉永興儀器有限公司）；鼓風(fēng)干燥箱（DHG9140B 上海安亭科學(xué)儀器有限公司）；高效液相色譜儀（Agilent 1260 美國(guó)安捷倫公司）；紫外可見分光光度計(jì)（UV-1780 島津企業(yè)管理有限公司）；DSC 差式掃描量熱儀（Stare 系統(tǒng)瑞士梅特勒-托利多公司）；磁力攪拌器（B11-1 上海司樂(lè)儀器有限公司）；擴(kuò)散池（7mL，立式上海化科實(shí)驗(yàn)器材責(zé)任有限公司）。

白及藥材（咸陽(yáng)鴻玖藥業(yè)有限公司）；α-熊果苷（含量99%，西安小草植物科技有限責(zé)任公司）；當(dāng)歸油（含量96%，吉安博銳香料油有限公司）；甘油（廈門星鯊制藥有限公司）；甲醇（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

小鼠（雌性，22g，西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）。

2 方法與結(jié)果

2.1 白及多糖的提取工藝

稱取白及藥材20g，加入10 倍量水，浸泡90min后于恒溫水浴中提取90min，設(shè)定提取溫度90℃，提取2 次。合并提取液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至浸膏狀，使其含藥量為每毫升1g，自然冷卻后，用75%乙醇醇沉，靜置過(guò)夜，在真空條件下抽濾，所得濾餅經(jīng)干燥粉碎，即得。

2.2 白及多糖微凝膠貼片的制備

稱取白及多糖4.0g，加入45mL 純化水，于50℃水浴中攪拌溶解后，加入20g 甘油，攪拌均勻得白及多糖凝膠液；稱取α-熊果苷1.0g，加入35mL 純化水，于50℃水浴中攪拌溶解后，加入到白及多糖凝膠液中，沿同一方向攪拌均勻，分別稱取20g 于5個(gè)燒杯中，依次加入當(dāng)歸油0，0.02，0.1，0.2，0.3mL。攪拌使當(dāng)歸油分散均勻，脫泡后，將上述混合溶液以勻漿法涂布于潔凈玻璃板上制膜，氮?dú)夥諊?0℃干燥，即得空白對(duì)照及含當(dāng)歸油濃度為0.1%、0.5%、1.0%、1.5%的α-熊果苷白及多糖微凝膠貼片，將其切割成1.5cm×1.5cm 大小若干塊，密封保存，備用。

2.3 α-熊果苷含量測(cè)定方法的建立

色譜條件：色譜柱Zorbax Eclipse XDB-C18 柱（4.6mm×150mm，5.0μm），流動(dòng)相：甲醇- 水（20∶80，V/V）；流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)283nm，柱溫為25℃，進(jìn)樣量20μL，如圖3 所示，α-熊果苷的洗脫時(shí)間為2.77min 左右，峰形良好。

圖1 白及多糖濾餅Fig. 1 The bletilla polysaccharide filter cake

圖2 白及多糖凝膠液及微凝膠貼片F(xiàn)ig. 2 The bletilla polysaccharide gel and micro-gel patch

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密稱取α-熊果苷對(duì)照品0.1g于100mL 容量瓶中，用純化水稀釋至刻度，搖勻，即得1mg/mL 的對(duì)照品溶液。分別精密吸取α-熊果苷對(duì)照品溶液適量于25mL 容量瓶中，用純化水定容配置成濃度為5、10、20、40、80、160μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取20μL，經(jīng)HPLC 檢測(cè)，以α-熊果苷的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸（如圖4 所示），得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=12.436X+12.612，R2=0.9997。結(jié)果表明，α-熊果苷在濃度范圍5～160μg/mL 內(nèi)具良好的線性關(guān)系。

精密度考察：精密吸取濃度為20μg/mL 的α-熊果苷標(biāo)準(zhǔn)溶液20μL，注入HPLC 中測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣5 次，根據(jù)峰面積計(jì)算精密度，結(jié)果RSD 為0.37%（n=5）。

穩(wěn)定性考察：將配制好的20μg/mL 的α-熊果苷標(biāo)準(zhǔn)溶液在室溫下放置，分別于0h、1h、3h、5h、7h、12h、24h 精密吸取20μL，注入HPLC 中測(cè)定，結(jié)果RSD 為0.24%（n=3），表明該樣品穩(wěn)定性良好。

回收率試驗(yàn)：取空白接收液1.0mL 分別加入高（80μg/mL）、中（40μg/mL）、低（20μg/mL）三個(gè)濃度梯度的α-熊果苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，混合均勻后，精密吸取20μL 注入HPLC 測(cè)定，結(jié)果RSD 為0.91%，平均回收率103.81%（n=3）。

圖4 線性關(guān)系圖Fig. 4 The linearity

2.4 體外透皮試驗(yàn)

取小鼠脫頸處死，剝離腹部皮膚，剔除毛發(fā)并剝離皮下組織，用生理鹽水沖洗干凈，并切成3.0cm×3.0cm 大小，夾于立式擴(kuò)散池中間，角質(zhì)層面向供給池，真皮層面向接收池。將擴(kuò)散池固定于恒溫磁力攪拌器上，設(shè)定溫度為32±0.5℃，攪拌速度100r/min。接收池中加入5mL 純化水作為接收液，供給池中分別將含當(dāng)歸油0%、0.1%、0.5%、1.0%、1.5%的白及多糖微凝膠貼片小心黏附于小鼠皮膚角質(zhì)層上，然后分別于0.5、1.0、1.5、2.5、3.5、4.5h 時(shí)取樣0.2mL 并及時(shí)補(bǔ)液，樣品經(jīng)0.22μm 微孔濾膜過(guò)濾后，精密量取20μL 注入HPLC，按下式計(jì)算累積透過(guò)量。

式中ΔM 代表藥物累積透過(guò)量；Ci 代表第i 次所取樣品的濃度（μg/L）；V 代表釋放介質(zhì)體積（mL），A 為有效透過(guò)面積（cm2）。

圖5 不同含量當(dāng)歸油微凝膠貼片中α-熊果苷累積釋藥圖Fig. 5 The cumulative release of α-arbutin from micro-gel patch with different angelica oil contents

結(jié)果如圖5 顯示，含當(dāng)歸油的微凝膠貼片中α-熊果苷的累積透過(guò)量均高于空白對(duì)照組，表明當(dāng)歸油對(duì)白及多糖微凝膠貼片中的α-熊果苷的透皮吸收具有顯著的促進(jìn)作用。隨著處方中當(dāng)歸油的濃度逐漸升高，α-熊果苷的累積透過(guò)量也隨之增加，表明當(dāng)歸油對(duì)α-熊果苷的促滲作用具有一定的濃度依賴性，當(dāng)歸油濃度為1.0%時(shí)，α-熊果苷的累積透過(guò)量為最大，在4.5h 時(shí)1.0%當(dāng)歸油累積透過(guò)量分別是0.5%的1.14 倍、0.1%的1.56 倍、1.5%的1.42 倍、空白對(duì)照組的1.89 倍。當(dāng)當(dāng)歸油的濃度升高至1.5%時(shí)，α-熊果苷的累積透過(guò)量反而有所下降，推測(cè)其原因可能與當(dāng)歸油對(duì)皮膚角質(zhì)層類脂雙分子層結(jié)構(gòu)的影響有關(guān)。

2.5 差示掃描量熱儀（DSC）分析

將2.4 項(xiàng)下各組試驗(yàn)后的皮膚置于生理鹽水中沖洗，去除表面殘留制劑，濾紙吸干水分，剪成約5mg 的小塊，置于鋁坩堝中密封，經(jīng)差示掃描量熱儀進(jìn)行掃描分析，以未經(jīng)作用的小鼠皮膚同法處理為空白對(duì)照，DSC 升溫范圍為-20～200℃，升溫速率為20℃·min-1，測(cè)定氣氛為高純度N2。

圖3 α-熊果苷HPLC 圖Fig. 3 The HPLC of α-arbutin

結(jié)果如圖6 所示：從對(duì)照組DSC 掃描圖可看出，小鼠皮膚在140℃處有一明顯的特征吸熱峰，推測(cè)為皮膚角質(zhì)層中蛋白質(zhì)的變性峰，不含當(dāng)歸油的微凝膠貼片作用后的小鼠皮膚，其DSC 掃描圖與對(duì)照組差別不大，而加了當(dāng)歸油的微貼片作用后的小鼠皮膚DSC 掃描圖中角質(zhì)層特征吸熱峰隨著當(dāng)歸油濃度的增加而明顯減小，當(dāng)當(dāng)歸油的濃度為1.0%時(shí)，特征吸熱峰消失，推測(cè)原因可能是當(dāng)歸油改變了角質(zhì)層細(xì)胞類脂質(zhì)雙分子層的空間結(jié)構(gòu)，增加了雙分子層流動(dòng)性[5,6]，因此含當(dāng)歸油的凝膠貼劑作用后，小鼠皮膚在加熱過(guò)程中的吸熱導(dǎo)致相變所需的能量大大減少，導(dǎo)致角質(zhì)層的特征吸熱峰有所下降，當(dāng)當(dāng)歸油的量達(dá)到1.0%時(shí)，類脂質(zhì)雙分子層細(xì)胞的有序排列被擾亂，轉(zhuǎn)為無(wú)序，雙分子層細(xì)胞接近流動(dòng)的液晶態(tài)，因此特征吸熱峰逐漸消失。

圖6 小鼠皮膚用藥前后DSC 分析圖Fig. 6 The DSC analysis of mice’s skin before and after the administration of drug

3 討 論

近年來(lái)，中藥揮發(fā)油對(duì)藥物經(jīng)皮吸收的促進(jìn)作用逐漸受到關(guān)注，如冰片、當(dāng)歸、薄荷、川芎、桉葉等[2]，其作用機(jī)制目前主要認(rèn)為是揮發(fā)油作用于皮膚后可通過(guò)改變皮膚角質(zhì)層細(xì)胞的有序排列、增強(qiáng)角質(zhì)層水合作用以及拉動(dòng)效應(yīng)從而降低皮膚角質(zhì)層的屏障作用，提高通透性。研究表明，一些揮發(fā)油的促滲效果顯著優(yōu)于月桂氮卓酮[7,8]。另外，揮發(fā)油來(lái)源于天然植物，本身也具有一定的藥理活性，相比于化學(xué)促滲劑，其毒性小[9,10]。因此，以揮發(fā)油作為促滲劑，應(yīng)用于制劑中，不僅能夠增加制劑安全性，還可同時(shí)發(fā)揮促滲和治療的雙重作用。近年來(lái)從中藥揮發(fā)油中尋找高效、安全的促滲劑已成為透皮給藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。