王 敏，蔡虎志，陳新宇，周 芳

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007)

慢性心力衰竭(Chronic heart failure，CHF)是因冠心病、高血壓等心臟結(jié)構(gòu)或功能性疾病進(jìn)展而誘發(fā)的一組臨床綜合征，是各種心血管疾病的終末階段[1]。CHF患者心功能受損，生活自理能力降低，流行病學(xué)調(diào)查顯示，CHF發(fā)病率為0.9%～10.0%，且呈上升趨勢(shì)，CHF已成為威脅公共健康的重大問(wèn)題[2]。CHF屬中醫(yī)“水腫”“怔忡”“胸痹”范疇，中醫(yī)認(rèn)為胸痹、怔忡患者病位在心，涉及脾胃，臨床多以本虛標(biāo)實(shí)為主，本虛表現(xiàn)為氣血虧虛或陽(yáng)虛，標(biāo)實(shí)則以痰濕血瘀多見(jiàn)。近年來(lái)，本院將自制的溫陽(yáng)振衰顆粒用于治療慢性心衰患者，獲得一定成效[3]，但其藥理機(jī)制尚未完全闡明。目前臨床多認(rèn)為，心肌細(xì)胞因子及其相關(guān)信號(hào)通路在CHF中發(fā)揮重要作用[4]。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase，p38MAPK)是MAPK信號(hào)通路的主要亞族，其磷酸化表達(dá)與CHF病情進(jìn)展呈顯著正相關(guān)[5]。另外，外泌體是重要的細(xì)胞間信號(hào)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)載體，而miR-21作為p38MAPK上游非編碼調(diào)控基因，研究顯示，外泌體通過(guò)攜帶miR-21抑制p38MAPK信號(hào)通路[6]。故推測(cè)溫陽(yáng)振衰顆?？赡芘c調(diào)控外泌體miR-21和p38MAPK信號(hào)通路有關(guān)?；诖?，本研究探討溫陽(yáng)振衰顆粒對(duì)CHF大鼠外泌體miR-21和p38MAPK信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：取40只清潔級(jí)SD雄性大鼠，體重200～250 g，鼠齡8～12周，所有動(dòng)物均由本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠在22～26 ℃溫度常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑：溫陽(yáng)振衰顆粒(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室自制制劑)，依那普利注射液(規(guī)格1 ml∶1.25 mg，國(guó)藥準(zhǔn)字X20010498，常州制藥廠有限公司)，阿霉素注射液(國(guó)藥準(zhǔn)字H33021980，海正輝瑞制藥有限公司)。外泌體Exo Quick抽提試劑盒(北京普邁精醫(yī)科技有限公司)，miRNA cDNA Synthesis試劑盒(批號(hào)ZY130911，上海澤葉生物科技有限公司)，Werstern blot法一抗和二抗(批號(hào)SY4836，北京伊塔生物科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建模、分組與給藥：將40只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、依那普利組及溫陽(yáng)振衰組，每組10只。正常組大鼠繼續(xù)以常規(guī)飼料喂養(yǎng)，另外三組采用阿霉素誘導(dǎo)建立CHF大鼠模型。具體方法：用0.9%氯化鈉溶液將阿霉素配制成2.0 mg/ml濃度，腹腔注射1.5 ml/kg，1次/周，連續(xù)干預(yù)6周。在阿霉素誘導(dǎo)CHF建模完成后行超聲檢查，計(jì)算左室短袖縮短率(Fractional shortening，F(xiàn)S)，以心腔擴(kuò)大、FS<30%為CHF建模成功[7]，模型組有2只大鼠因嚴(yán)重心力衰竭死亡，依那普利組1只因肝硬化腹水死亡，溫陽(yáng)振衰組2只死于嚴(yán)重心力衰竭，其余建模成功。以體重60 kg患者的臨床藥量為標(biāo)準(zhǔn)，按劑量-體表面積換算法計(jì)算大鼠用藥量。正常組繼續(xù)常規(guī)飼料喂養(yǎng)，未給予藥物干預(yù)。模型組以0.9%氯化鈉溶液灌胃，依那普利組以依那普利灌胃，溫陽(yáng)振衰組以溫陽(yáng)振衰顆粒劑灌胃，2次/d，連續(xù)干預(yù)4周。

1.2.2 標(biāo)本采集：分別在灌胃前(阿霉素誘導(dǎo)CHF建模后)和灌胃后(灌胃完成后4周)采血，常規(guī)EDTA抗凝后，以3000 r/min，離心15 min，取上清液冷凍保存。采用Exo Quick試劑盒法提取血清中外泌體。具體步驟：取500 μl血漿與120 μl的Exo Quick試劑，混勻后靜置30 min，室溫低速離心30 min，收集沉淀，冷凍保存。在灌胃后4周麻醉處死大鼠，取出心臟，稱重，冷凍備用。

1.2.3 RT-PCR法檢測(cè)心肌組織和外泌體miR-21水平：采用Trizol法提取總RNA，采用miRNA cDNA Synthesis試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，以GAPDH為內(nèi)參，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：5 μl的cDNA，10×PCR Buffer 2.5 μl,dNTP 2 μl,上下游引物各1 μl，再加H2O2至25 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，90 ℃變性15 s，72 ℃退火1 min，60 ℃延伸45 s，共40個(gè)循環(huán)，以2-△△Ct記錄相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 Werstern blot法檢測(cè)p38MAPK蛋白、p38MAPK mRNA、p-p38MAPK蛋白及p-p38MAPK mRNA水平：取20 μg外泌體，行12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳處理，以0.22 μm PVDF膜、100 V恒壓轉(zhuǎn)膜40 min，室溫下5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗(CD9 1∶500，CD63 1∶500)處理，TBST洗膜10 min×5次，再以二抗(山羊抗兔、抗鼠1∶5000稀釋)，37 ℃孵育1 h，TBST洗膜10 min×5次，采用化學(xué)發(fā)光成像儀曝光，記錄條帶灰度值。

1.2.5 心功能指標(biāo)：分別在灌胃前后行腹腔麻醉，起效后將大鼠平臥固定，將探頭置于胸骨左緣，取左室長(zhǎng)軸最大直徑處M型超聲標(biāo)記室間隔、左室后壁收縮末、舒張末心內(nèi)膜位置，記錄左室射血分?jǐn)?shù)(Left ventricular ejection fractions，LVEF)、E峰/A峰(E/A)、左室舒張末內(nèi)徑(Left ventricular end diastolic dimension,LVDD)及左室后壁厚度(Left ventricular posterior wall,LVPW)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 選用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間行單因素方差分析，兩兩比較行t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清外泌體miR-21水平比較 見(jiàn)表1。灌胃前，模型組、依那普利組及溫陽(yáng)振衰組血清外泌體miR-21水平均低于正常組。灌胃前后，四組大鼠血清外泌體miR-21水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。灌胃后，依那普利組和溫陽(yáng)振衰組血清外泌體miR-21水平均高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。灌胃后，依那普利組、溫陽(yáng)振衰組血清外泌體miR-21水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠血清外泌體miR-21水平比較

2.2 各組大鼠心肌組織miR-21水平比較 正常組、模型組、依那普利組及溫陽(yáng)振衰組大鼠心肌miR-21 mRNA水平分別為(1.12±0.37)、(0.76±0.29)、(0.94±0.35)及(1.03±0.28)，組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=58.05，P<0.01)。溫陽(yáng)振衰組和依那普利組大鼠miR-21 mRNA均高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.186、3.430，P<0.05)，但低于正常組(t=4.80，P<0.01)。依那普利組和溫陽(yáng)振衰組大鼠心肌miR-21 mRNA水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.886，P>0.05)。

2.3 各組大鼠p38MAPK、p-p38MAPK mRNA和蛋白水平比較 見(jiàn)表2。四組大鼠心肌組織p38MAPK、p-p38MAPK mRNA和蛋白水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。正常組大鼠心肌組織p38MAPK、p-p38MAPK mRNA和蛋白水平均低于其他三組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。溫陽(yáng)振衰組和依那普利組p38MAPK、p-p38MAPK mRNA和蛋白水平均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。依那普利組和溫陽(yáng)振衰組p38MAPK、p-p38MAPK mRNA和蛋白水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠p38MAPK、p-p38MAPK mRNA和蛋白水平比較

2.4 各組大鼠心功能指標(biāo)比較 見(jiàn)表3。灌胃前和灌胃后，四組大鼠LVEF、E/A、LVDD及LVPW水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。灌胃前，正常組LVEF高于其他三組，E/A、LVDD及LVPW均低于其他三組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。灌胃后，溫陽(yáng)振衰組和依那普利組LVEF高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。依那普利組和溫陽(yáng)振衰組E/A、LVDD及LVPW水平均低于模型組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠心功能指標(biāo)比較

3 討 論

中醫(yī)雖無(wú)CHF病名，但根據(jù)其臨床表現(xiàn)，CHF屬中醫(yī)“水腫”“怔忡”“胸痹”范疇[8]?！端貑?wèn)》記載：“陽(yáng)氣者，精則養(yǎng)神，柔則養(yǎng)筋?！比粜年?yáng)不足，使機(jī)體失于溫煦，進(jìn)而產(chǎn)生痰濁、血瘀。因而，CHF多以本虛標(biāo)實(shí)為主。溫陽(yáng)振衰顆粒是本院自制中藥制劑，已在臨床廣泛應(yīng)用。溫陽(yáng)振衰顆粒以制附子、紅參為君，其中附子被稱為扶陽(yáng)第一要藥，紅參具有復(fù)脈固脫作用，二者聯(lián)用發(fā)揮回陽(yáng)救逆功效[9]；方中輔以干姜、茯苓作為臣藥，其中干姜既能輔助附子，鞏固回陽(yáng)救逆之效，又與茯苓配伍以健脾滲濕；方中麥冬、五味子為佐，養(yǎng)陰生津、固護(hù)陽(yáng)氣[10]；甘草為使藥，調(diào)和諸藥，使全方達(dá)到溫陽(yáng)益氣、固陽(yáng)化陰之功。本研究顯示，灌胃后溫陽(yáng)振衰組和依那普利組LVEF高于模型組，且溫陽(yáng)振衰組LVEF水平高于依那普利組，提示溫陽(yáng)振衰顆粒有助于改善CHF大鼠心功能，達(dá)到與依那普利相近的臨床療效。另外，灌胃后溫陽(yáng)振衰組與依那普利組E/A、LVDD及LVPW雖低于模型組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與樣本量小和觀察時(shí)限較短有關(guān)。

miRNA/p38MAPK信號(hào)通路在CHD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。p38MAPK是具有調(diào)控炎癥反應(yīng)和心肌細(xì)胞增殖作用的信號(hào)通路，心肌細(xì)胞p38MAPK信號(hào)增強(qiáng)，可直接誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡[11-13]。相關(guān)基礎(chǔ)研究顯示，抑制p38MAPK磷酸化能減少炎癥因子分泌，改善心功能[14]。miRNA屬內(nèi)源性非編碼小分子RNA，通過(guò)與靶基因mRNA的3’端非翻譯區(qū)結(jié)合，產(chǎn)生負(fù)性調(diào)控作用，發(fā)揮生物學(xué)功能[15-16]。miR-21則是miRNA內(nèi)源性非編碼單鏈小分子成員，既往已有研究證實(shí)，miR-21在心肌細(xì)胞凋亡、心肌纖維化及平滑肌細(xì)胞增殖過(guò)程中均發(fā)揮重要作用，其作用與調(diào)控p38MAPK信號(hào)通路密切相關(guān)[17]。miR-21可介導(dǎo)p38MAPK信號(hào)通路調(diào)控炎癥因子釋放，進(jìn)而緩解病情[18-19]。外泌體是含有mRNA、蛋白質(zhì)的小膜泡，外泌體攜帶miR-21可減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)而抑制p38MAPK信號(hào)，發(fā)揮抗心肌細(xì)胞凋亡作用。本研究顯示，灌胃后溫陽(yáng)振衰組大鼠心肌p38MAPK和p-p38MAPK蛋白表達(dá)量低于模型組，說(shuō)明溫陽(yáng)振衰顆粒通過(guò)上調(diào)外泌體miR-21，阻斷p38MAPK信號(hào)通路，抑制p38MAPK磷酸化，發(fā)揮抗心肌凋亡作用。但本研究納入樣本量小，結(jié)果仍有待進(jìn)一步研究證實(shí)。另外，有研究顯示，miR-21可通過(guò)下調(diào)張力蛋白表達(dá)抑制心肌細(xì)胞凋亡[20]，這可能是溫陽(yáng)振衰顆粒上調(diào)miR-21后發(fā)揮治療作用的另一途徑，但其具體機(jī)制和相關(guān)蛋白因子有待深入研究。

綜上，溫陽(yáng)振衰顆粒治療CHF療效較好，其作用機(jī)制可能與其通過(guò)上調(diào)外泌體miR-21水平，抑制p38MAPK信號(hào)通路有關(guān)。