王宗康，肖艷波，劉 尋，譚怡絲，譚 勁

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔科，湖南 長沙 410007)

口腔黏膜下纖維化，又稱口腔黏膜纖維性變(Oral submucous fibrosis，OSF)，是一種慢性進行性的口腔黏膜下疾病，臨床表現(xiàn)為口干、燒灼痛和張口受限等，好發(fā)于咀嚼檳榔的人群，且存在明顯的癌變傾向[1-2]。中醫(yī)學(xué)認為，長期咀嚼檳榔致邪毒入侵機體，再加患者自身正氣虧損、痼結(jié)痰瘀，導(dǎo)致OSF的發(fā)病，因此治療應(yīng)以益氣、活血、祛痰、解毒為主[3]。加味丹玄口康是基于桃紅四物湯加減而成的中藥復(fù)方制劑，可切實針對毒侵、痰結(jié)、氣虛、血瘀等病機，達到標本兼治、恢復(fù)病損之目的。因此，本研究擬建立OSF模型大鼠，采用加味丹玄口康湯劑灌胃治療，探究加味丹玄口康對OSF模型大鼠Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：35只SPF級成年雄鼠，購買于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[動物許可證號(湘)20190004]，飼養(yǎng)溫度23～25 ℃，相對濕度30%～35%，每日予12 h光照，按照以上條件飼養(yǎng)大鼠1周后進行實驗。本研究經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準。

1.1.2 實驗藥物與試劑：Wnt抑制劑(KYA1797K，美國Selleck公司)；異氟烷(瑞沃德生命科技有限公司)；檳榔提取物(成都德斯特生物公司)；水合氯醛(士鋒生物科技有限公司)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號CW2569，北京康為世紀公司)；Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(批號QPK-201，日本TOY-OBO公司)；Wnt-1抗體(批號ab15251，英國Abcam公司)；β連環(huán)蛋白(β-catenin)抗體(批號ab32572，英國Abcam公司)；軸抑制因子2(Axin2)抗體(批號ab32197，英國Abcam公司)；細胞周期蛋白D1(Cylin D1)抗體(批號ab251892，英國Abcam公司)；顯液(批號23423，Cyanagen公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 加味丹玄口康：由丹參、玄參、當歸、生地黃、白花蛇舌草、生黃芪、薄荷、桔梗、夏枯草、茵陳、白芍各10 g，紅花5 g組成。以上中藥均購自湖南省中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診中藥房，中藥中加入500 ml溫開水，水煎濃縮至生藥濃度為0.23 g/ml。

1.2.2 建模、分組與給藥：在35只SPF級成年雄鼠中隨機挑選5只大鼠作為正常組，剩余30只大鼠首先采用水合氯醛麻醉，隨后予100 μl檳榔提取物(1 mg/ml)注射至大鼠兩側(cè)頰黏膜下進行建模，1次/d，持續(xù)注射8周。以大鼠口腔黏膜顏色發(fā)白、質(zhì)地變硬并形成條索狀，張口明顯受限為口腔黏膜纖維化建模成功標志，最終成功建模25只OSF模型大鼠。將25只OSF模型大鼠隨機分為OSF模型組、加味丹玄口康低劑量組、加味丹玄口康中劑量組、加味丹玄口康高劑量組和Wnt抑制劑組，每組各5只。加味丹玄口康低劑量組、加味丹玄口康中劑量組、加味丹玄口康高劑量組大鼠分別給予4、8、12 ml/kg加味丹玄口康灌胃，Wnt抑制劑組大鼠給予25 mg/kg的KYA1797K腹腔注射，OSF模型組和正常組大鼠給予4 ml/kg的0.9%氯化鈉溶液灌胃。各組均1次/d，持續(xù)給藥4周。

1.2.3 檢測大鼠張口度：分別在治療前、治療2周、治療4周觀察大鼠張口度。在麻醉狀態(tài)下，固定大鼠的上中切牙，利用計力器給予大鼠下中切牙2 N的力，充分打開口腔，隨后采用游標卡尺測量上、下、中切牙的距離，重復(fù)測量3次，取其平均值。

1.2.4 評估頰黏膜評分：分別在治療前、治療2周、治療4周評估大鼠頰黏膜評分。對大鼠頰黏膜的病變程度進行分級，包括口腔黏膜的色澤、光滑程度和纖維條索等三方面，總分為0～3分，病變完全消失則為0分，得分越高，病變越重。

1.2.5 PCR檢測Wnt-1、β-catenin、Cylin D1、Axin mRNA水平：取大鼠頰黏膜組織與1 ml的Trizol混合研磨呈粉末狀，提取頰黏膜組織總RNA，并檢測RNA的含量和純度，隨后采用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對上述總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄處理，獲得cDNA。將cDNA與Wnt-1、β-catenin、Cylin D1和Axin等基因的上下游引物一同進行基因擴增。PCR反應(yīng)體系(20 μl)：1 μl的cDNA模板、10 μl的12×Real-time PCR Mix/2×PCR Mix、1 μl上下游引物、7 μl RNase H2O。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃，4 min；94 ℃，40 s；60 ℃，30 s，循環(huán)40次，75 ℃，5 min，4 ℃，循環(huán)40次。采用2-△△Ct方法計算Wnt-1、β-catenin、Cylin D1和Axin等基因表達量。Wnt-1引物：上游引物5’-CGAAACCGCCGCTGGAACTG-3’，下游引物5’-CGGAGGTGATTGCGAAGATAAAC-3’，片段長度103bp。β-catenin引物：上游引物5’-GGAGGAGATAGTTGAAGGG-3’，下游引物5’-CACAAACAGTGGAATGGTA-3’，片段長度106bp。Cylin D1引物：上游引物5’-GCAAGCACCCGCAAACCT-3’，下游引物5’-AGCTCGGTCAGGGCATCG-3’，片段長度160bp。Axin引物：上游引物5’-ACCGAAATACATTCTTATAAC-3’，下游引物5’-TCCATACCTAACTCTCTC-3’，片段長度450bp。

1.2.6 Western blot法檢測Wnt-1、β-catenin、Cylin D1、Axin蛋白水平：取大鼠頰黏膜組織，磨碎后與60 μl的裂解液混合，提取總蛋白；離心，取上清液，采用BCA蛋白濃度試劑盒測量蛋白濃度；隨后加入蛋白上樣緩沖液，在100 ℃下水浴加熱，持續(xù)5 min；最后依據(jù)蛋白質(zhì)分子量配制凝膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、孵抗體、顯色，并讀取條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠治療前后張口度和頰黏膜評分比較 見表1。治療前，OSF模型組、Wnt抑制劑組、加味丹玄口康低劑量組、加味丹玄口康中劑量組、加味丹玄口康高劑量組大鼠的張口度和頰黏膜評分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，且以上各組大鼠張口度均小于正常組，頰黏膜評分均高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。治療2周及治療4周后，Wnt抑制劑組、加味丹玄口康中劑量組、加味丹玄口康高劑量組大鼠的張口度增大，頰黏膜評分減小，加味丹玄口康高劑量組大鼠的張口度最大、頰黏膜評分最低，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；且以上各組大鼠張口度和頰黏膜評分與正常組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

表1 各組大鼠治療前后張口度、頰黏膜評分比較

2.2 各組大鼠口腔黏膜組織Wnt-1、β-catenin、Cylin D1、Axin mRNA表達比較 見表2。干預(yù)后，OSF模型組、加味丹玄口康低劑量組、加味丹玄口康中劑量組Wnt-1、β-catenin、Cylin D1 mRNA表達水平均高于加味丹玄口康高劑量組和正常組，Axin mRNA表達低于加味單玄口康高劑量組和正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Wnt抑制劑組Wnt-1、β-catenin、Cylin D1 mRNA的表達高于加味丹玄口康高劑量組，Axin mRNA表達低于加味丹玄口康高劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。加味丹玄口康高劑量組Wnt-1、β-catenin、Cylin D1、Axin mRNA的表達與正常組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

表2 各組大鼠口腔黏膜組織Wnt-1、β-catenin、Cylin D1、Axin mRNA表達比較

2.3 各組大鼠口腔黏膜組織Wnt-1、β-catenin、Cylin D1、Axin蛋白表達比較 干預(yù)后，OSF模型組、加味丹玄口康低劑量組、加味丹玄口康中劑量組Wnt-1、β-catenin、Cylin D1蛋白表達高于加味丹玄口康高劑量組和正常組，Axin蛋白表達低于加味丹玄口康高劑量組和正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Wnt抑制劑組Wnt-1、β-catenin、Cylin D1蛋白的表達高于加味丹玄口康高劑量組，Axin蛋白表達低于加味丹玄口康高劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。加味丹玄口康高劑量組Wnt-1、β-catenin、Cylin D1、Axin蛋白的表達水平與正常組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠口腔黏膜組織Wnt-1、β-catenin、Cylin D1、Axin蛋白表達比較

3 討 論

近年來，多種中藥、中成藥和方劑被廣泛應(yīng)用于臨床，且取得較好療效。有研究證實，中醫(yī)藥可有效治療口腔疾病，延緩OSF的進展，其中丹參、蘆葦?shù)忍烊凰幬铮瑲w紅注射液、復(fù)方丹參滴丸等中成藥，玉泉湯、桃紅四物湯等方劑，均可有效緩解OSF的臨床癥狀[4-6]。OSF的癌變涉及多個信號傳導(dǎo)通路，目前研究較為廣泛的是Wnt/β-catenin信號通路。Wnt/β-catenin信號通路涉及多個分子如Wnt-1、β-catenin、Cylin D1和Axin等，不同信號分子相互作用、相互制約，共同調(diào)控細胞的增殖和分化[7]。Wnt-1是Wnt/β-catenin信號通路的初始信號分子，其表達增加有助于Wnt/β-catenin信號通路下游信號的激活。Wnt-1蛋白可抑制胞漿內(nèi)β-catenin蛋白的降解，過表達的β-catenin蛋白可進入核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，促進口腔黏膜上皮細胞向成纖維細胞轉(zhuǎn)化[8]。Cylin D1蛋白是一種細胞G1/S期特異性周期蛋白，可促進原有成纖維細胞的增殖，最終導(dǎo)致OSF惡變[9-10]。在正常情況下，Axin主要是與其他蛋白結(jié)合形成復(fù)合體，促使β-catenin蛋白磷酸化而被降解；Wnt-1蛋白可阻礙Axin蛋白復(fù)合體的形成，抑制胞漿內(nèi)β-catenin蛋白的降解[11-12]。本研究顯示，加味丹玄口康高劑量組療效優(yōu)于Wnt抑制劑組。

加味丹玄口康中丹參、當歸、紅花可活血通絡(luò)，散瘀止痛，促進血液循環(huán)[13]；生黃芪、白芍可補氣固表，提高機體免疫力[14]；白花蛇舌草、夏枯草可清熱解毒，軟堅散結(jié)；薄荷疏風散熱；桔梗祛痰排膿；生地黃、玄參、茵陳可清熱生津，滋陰養(yǎng)血[15-18]。全方共奏活血解毒化瘀、扶正祛邪之功，方中活血化瘀藥能促進血液循環(huán)、改善血液髙黏滯狀態(tài)，且與扶正祛邪藥聯(lián)用，可提高機體免疫力，促進OSF模型大鼠恢復(fù)[19]。

本研究結(jié)果顯示，與OSF模型組大鼠比較，加味丹玄口康高劑量組Wnt-1、β-catenin、Cylin D1 mRNA和蛋白表達水平均降低，Axin mRNA和蛋白表達水平均增高，且在治療第4周，加味丹玄口康高劑量組大鼠與正常組張口度、頰黏膜評分比較無統(tǒng)計學(xué)差異，提示加味丹玄口康通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路，逆轉(zhuǎn)大鼠口腔黏膜纖維化，這與謝賽飛等[20]研究結(jié)果一致。但是，加味丹玄口康對Wnt/β-catenin信號通路具體調(diào)節(jié)起始環(huán)節(jié)和機制尚未完全明確，有待進一步研究。

綜上所述，加味丹玄口康可有效改善OSF模型大鼠的臨床癥狀，通過抑制Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)基因及蛋白的表達，抑制大鼠口腔黏膜纖維化。