田沛霖，李玥琦，王思淵，魯輝，張國林

（江蘇省蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，江蘇 蘇州 215104）

程序性死亡蛋白-1（PD-1）抑制劑是目前唯一在中國應(yīng)用的免疫抑制劑［1］。其通過PD-1免疫檢查點對T淋巴細(xì)胞活化和增殖的抑制作用，恢復(fù)T淋巴細(xì)胞的活性和個體免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細(xì)胞的能力［2］。目前，PD-1抑制劑治療肝癌、胃癌、黑色素瘤、鼻咽癌、非小細(xì)胞肺癌等多種實體瘤的效果良好［3-5］，應(yīng)用前景廣闊?，F(xiàn)已上市的PD-1抑制劑產(chǎn)品多為注射液或凍干粉針劑，往往會加入甘露醇以提高制劑穩(wěn)定性，防止多肽或蛋白相互聚集，調(diào)整緩釋制劑產(chǎn)品降解速率等［6］。甘露醇為六元糖醇，測定方法包括氧化還原滴定法［7-8］、分光光度法［9-10］、高效液相色譜法［11］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［12］、離子色譜法［13］等。其中，高效液相色譜-示差折光檢測器（HPLC-RID）法是目前最常用的方法，已收載于歷版《中國藥典》，普遍用于各PD-1抑制劑產(chǎn)品現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。但RID受溫度及流動相組成等外界因素干擾較大［14］，不適合梯度洗脫，且存在靈敏度較低、信號欠穩(wěn)定等不足［15］，在樣品濃度較低時重復(fù)性較差。電噴霧檢測器（CAD）為新型檢測器，近年來發(fā)展迅速，2020年版《中國藥典（四部）》通則0512 HPLC法中首次增加了對該檢測器的相關(guān)介紹［16］。其檢測原理是將洗脫液霧化后形成顆粒，經(jīng)蒸發(fā)管干燥后與帶電氮氣碰撞，使分析物顆粒表面帶正電荷，通過靜電計測量分析物顆粒表面的電荷量，使分析物顆粒的質(zhì)量色譜峰面積與表面所帶電荷量相關(guān)，成為確定物質(zhì)濃度的依據(jù)［17］。本研究中建立了快速、準(zhǔn)確測定PD-1抑制劑特瑞普利單抗注射液中甘露醇含量的HPLC-CAD法，為完善該類制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UltiMate 3000型高效液相色譜儀（美國賽默飛世爾科技有限公司），包括Corona Veo RS型CAD、變色龍工作站；XSE205DU型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，精度為0.01 mg/0.1 mg）；Millipore Synergy型超純水機(jī)（美國密理博公司）。

1.2 試藥

特瑞普利單抗注射液（國內(nèi)某企業(yè)，批號分別為201908030，201909032，201909034，規(guī) 格 均 為 每 瓶240 mg∶6 mL）；甘露醇對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100533-202006，純度為99.5%）；乙腈（色譜純，霍尼韋爾公司，批號為V3OA1H）；水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Supelco apHera NH2氨基分析柱（150 mm×2 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水溶液（80∶20，V/V）；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣室溫度：5℃；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：3 μL；霧化氣：氮氣（純度超過99.0%），霧化室溫度：50℃；冪率：1.0；采樣頻率：10 Hz；過濾常數(shù)：5.0 s。

2.2 溶液制備

取甘露醇對照品50 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加超純水溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL的對照品貯備液。分別精密量取適量上述溶液，置10 mL容量瓶中，用超純水稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度分別為0.125，0.250，0.500，0.800，1.000 mg/mL的溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。精密量取樣品1 mL，用超純水稀釋50倍，即得供試品溶液。取超純水，作為空白溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：取2.2項下空白溶液、對照品貯備液、供試品溶液各適量，按2.1項下色譜條件分別進(jìn)樣測定。色譜圖見圖1?？梢姡瞻兹芤荷V無干擾；對照品貯備液和供試品溶液色譜中，甘露醇色譜峰理論板數(shù)均大于1 000，拖尾因子均小于1.0，表明方法專屬性良好。

線性關(guān)系考察：CAD的響應(yīng)值與被檢測物質(zhì)的量通常呈指數(shù)關(guān)系，但在小質(zhì)量范圍內(nèi)可基本呈線性關(guān)系［16］。按2.2項下方法配制對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液（取甘露醇對照品51.42 mg，精密稱定），分別精密吸取上述溶液各3 μL，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，以甘露醇質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，mg/mL）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=9.336 6X+1.177 0（r=0.997 3，n=5）。結(jié)果表明，甘露醇質(zhì)量濃度在0.125～1.000 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

定量限和檢測限確定：取2.2項下質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，逐級稀釋并進(jìn)樣測定。當(dāng)信噪比（S/N）約為10∶1時，得到甘露醇的定量限為0.625 μg/mL；當(dāng)S/N約為3∶1時，得到甘露醇的檢測限為0.200 μg/mL。

精密度試驗：取2.2項下質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，按2.1項下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣測定6次。結(jié)果峰面積的RSD為0.49%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.2項下質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，按2.1項下色譜條件分別于0，4，8，12，16，20，24 h時進(jìn)樣測定。測得甘露醇峰面積的RSD為0.23%（n=7），表明甘露醇溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品適量，共6份，依法制備供試品溶液，分別精密加入甘露醇對照品10 mg，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，并計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

1.甘露醇A.空白溶液B.對照品貯備液C.供試品溶液圖1 高效液相色譜圖1.MannitolA.Blank solution B.Reference stock solution C.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

2.4 樣品含量測定及方法比較

取3批樣品，分別按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件分別進(jìn)樣測定，記錄色譜峰峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計算甘露醇含量。同時，按企業(yè)現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的方法，采用HPLC-RID法對產(chǎn)品中甘露醇的含量進(jìn)行測定。結(jié)果2種方法甘露醇含量均在企業(yè)現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定限度范圍，且3批樣品含量測定結(jié)果的相對偏差（RD）分別為0.99%，0.24%，1.10%，表明2種方法均能較好地測定樣品中的甘露醇含量。詳見表2。

表2 HPLC-CAD法和HPLC-RID法測定PD-1抑制劑中甘露醇含量測定結(jié)果Tab.2 Results of content determination of mannitol in the PD-1 inhibitor by the HPLC-CAD and HPLC-RID methods

3 討論

3.1 HPLC-CAD色譜條件參數(shù)選擇

過濾常數(shù)：取同一份質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的甘露醇對照品溶液，分別在過濾常數(shù)為0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，3.6，5.0，10.0 s且其余色譜條件不變的情況下依次進(jìn)樣。當(dāng)過濾常數(shù)小于2.0 s時，色譜峰峰形存在明顯分叉；當(dāng)過濾常數(shù)為10.0 s時，峰高最低。綜合考慮，最終選擇過濾常數(shù)為5.0 s。

進(jìn)樣量：取同一份質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的甘露醇對照品溶液，進(jìn)樣量分別為20，10，5，3 μL。當(dāng)進(jìn)樣量大于10 μL時，色譜峰出現(xiàn)過載；當(dāng)進(jìn)樣量為5 μL時，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系一般（r＜0.99）。故最終選擇進(jìn)樣量為3 μL。

3.2 與現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測結(jié)果比較

由表2可知，2種檢測方法測定甘露醇含量的差異不顯著。但現(xiàn)行HPLC-RID法測得結(jié)果，2份平行樣品之間RD較大，且出峰時間需要約20 min；采用HPLC-CAD法時樣品RD更小，約1.5 min即可出峰，說明該方法重復(fù)性良好，且更加快速、高效。同時，HPLC-CAD法樣品進(jìn)樣只需3 μL，而現(xiàn)行方法為20 μL。對于生產(chǎn)成本較高的生物制品來說，HPLC-CAD法檢測時所需樣品量更少，可在保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確的前提下，有效節(jié)約成本。此外，采用HPLC-CAD法檢測時，定量限和檢測限均明顯低于HPLC-RID法，儀器具有更高的響應(yīng)值和靈敏度。故經(jīng)綜合評估，HPLC-CAD法測定甘露醇具有獨特優(yōu)勢。

3.3 方法評價

目前，我國的生物大分子藥物正處于蓬勃發(fā)展階段，其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)有待進(jìn)一步完善。以PD-1抑制劑中甘露醇含量測定為例，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中多以HPLC-RID法進(jìn)行檢測，但該方法對環(huán)境敏感，靈敏度較差，無法進(jìn)行梯度洗脫，且在低濃度檢測時重復(fù)性較差。CAD是新型通用檢測器，具有檢測范圍寬、靈敏度高、重復(fù)性好、操作簡便等特點［17］。CAD對所有物質(zhì)均有響應(yīng)，且其響應(yīng)值幾乎僅與被測物質(zhì)的量有關(guān)，不依賴于化合物的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，無需進(jìn)行復(fù)雜的衍生操作即可檢測大部分非揮發(fā)性和半揮發(fā)性物質(zhì)［18］。本研究中建立的測定PD-1抑制劑中甘露醇含量的HPLC-CAD法，與現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相比，方法操作簡便、靈敏度高、出峰時間短、有效可控，可為相關(guān)企業(yè)對甘露醇的質(zhì)量控制提供參考。