張家寶 馬 軻 劉真真 高 宇 藺小奇 楊勇軍

(吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，長春130062)

動(dòng)物消化道微生物種群是影響宿主機(jī)體健康的主要因素[1]。腸道菌群種類繁多，作為胃腸道內(nèi)龐大的生態(tài)系統(tǒng)，對宿主機(jī)體生理機(jī)能具有極其復(fù)雜的影響[2]。乳酸菌作為腸道常駐優(yōu)勢菌[3]，在動(dòng)物體內(nèi)可促進(jìn)免疫器官發(fā)育[4]、調(diào)節(jié)宿主生理機(jī)能[5]、增強(qiáng)對腸道病原菌抵抗[6]等，是一種重要的益生菌。

在“無抗”背景下，為防控沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等致病菌引起的感染，對于畜禽養(yǎng)殖需要選擇抗生素的替代品[3]。畜禽飼糧中添加微生態(tài)制劑可促進(jìn)胃腸道益生菌群繁殖、抑制病原菌群繁殖，發(fā)揮其有益的免疫調(diào)節(jié)特性[7]。篩選對胃腸道環(huán)境以及腸道免疫系統(tǒng)具有良好耐受性的益生菌，利用益生菌抑制腸道致病菌且分泌多種消化酶以及細(xì)菌素等基本生物學(xué)特性，開發(fā)畜禽微生態(tài)制劑對于改善畜禽營養(yǎng)健康狀況及生產(chǎn)性能具有重大意義。

本研究從健康雞腸道內(nèi)分離出對于雞白痢沙門氏菌ATCC19945以及金黃色葡萄球菌USA300具有強(qiáng)抑菌活性的共生菌。研究其種屬特征、生長特性、產(chǎn)酸能力、抗生素敏感性、耐受特性、自聚集能力以及疏水性能等益生特性，為畜禽微生態(tài)制劑的研發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

金黃色葡萄球菌USA300(StaphylococcusaureusUSA300 TCH1516)由吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院韓文瑜教授惠贈(zèng)，雞白痢沙門氏菌ATCC19945(SalmonellapullorumATCC19945)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所韓先干研究員惠贈(zèng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的分離

取健康雞盲腸，采用無菌生理鹽水清理雞腸道，用手術(shù)刀輕柔刮去腸內(nèi)容物，換刀繼續(xù)刮取腸黏膜，取1 g黏膜附屬物樣品稀釋于9 mL滅菌生理鹽水中，充分振蕩混勻。從樣品懸濁液中取1 mL用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer,PBS)稀釋至10-5、10-6、10-7，分別取100 μL樣品懸濁液于無菌乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基，HB0384-1)瓊脂板中均勻涂布，置于厭氧培養(yǎng)箱(37 ℃)中培養(yǎng)[8]。24 h后挑取中等大小、微白色、高圓隆、邊緣整齊等典型乳酸菌特征的單菌落，連續(xù)平板劃線傳代純化，直至平板上菌落形態(tài)單一。挑取單一菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，再以1%(v/v)接種量轉(zhuǎn)接進(jìn)行2次活化，對傳代培養(yǎng)后的菌株進(jìn)行富集并編號，與25%(v/v)甘油混合冷凍保存，以保證后續(xù)試驗(yàn)中菌株的穩(wěn)定可獲得性。

1.2.2 牛津杯瓊脂擴(kuò)散法復(fù)篩

將對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌USA300和雞白痢沙門氏菌ATCC19945分別接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB培養(yǎng)基，HB4114)、肉湯液體培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)中，37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)至細(xì)菌對數(shù)生長期，用PBS洗滌2次，將細(xì)菌懸液濃度調(diào)至1×109CFU/mL作為指示菌液。將純化得到的13株菌株傳代培養(yǎng)2代穩(wěn)定后，MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行二級活化，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，離心(8 000×g, 10 min, 4 ℃)收集上清液。采用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌作用篩選[9]，在表面分別涂有50 μL上述2種病原指示菌液的TSB、LB瓊脂板上等距放置牛津杯，加入各無細(xì)胞發(fā)酵上清液200 μL/孔，每組重復(fù)3次，37 ℃靜置培養(yǎng)16 h，游標(biāo)卡尺測定抑菌圈直徑。

1.2.3 16S rRNA鑒定

選擇經(jīng)篩選抑菌效果最強(qiáng)的菌株Y68送往吉林省庫美生物科技有限公司進(jìn)行16S rRNA測序；所得序列通過NCBI blast，與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知菌株序列進(jìn)行細(xì)菌同源性比對，應(yīng)用軟件MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[10]，確定菌株種屬。

1.2.4 生長曲線及菌液pH變化測定

挑取Y68單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)箱進(jìn)行一級種子液活化。調(diào)整種子液600 nm吸光度(OD600 nm)值為1，按1%(v/v)轉(zhuǎn)接至MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。監(jiān)測72 h內(nèi)細(xì)菌懸液的pH和OD600 nm值變化并繪制變化曲線。

1.2.5 抗生素敏感性試驗(yàn)

活化2代后Y68菌株接種至MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心收集菌體(8 000×g，5 min)，PBS重懸洗滌2次，將Y68調(diào)整至1×109CFU/mL，50 μL菌液涂布平板，夾取藥敏紙片平放置于含菌平板上，每個(gè)紙片的間距不小于24 mm[11]，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，觀察并測量Y68抑菌圈直徑，參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)推薦的紙片擴(kuò)散法標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。

1.2.6 酸耐受試驗(yàn)

酸耐受試驗(yàn)按照Ahire等[12]描述的方法測定。參照1.2.5制備分離株Y68細(xì)菌懸液，將100 μL細(xì)菌懸液分別與900 μL PBS(pH為2.0、3.0、4.0、7.4)混合，37 ℃厭氧培養(yǎng)箱孵育3 h。取經(jīng)處理0、3 h的菌液進(jìn)行稀釋涂布平板法檢測活菌數(shù)，通過孵育后MRS瓊脂平板上菌落數(shù)計(jì)算其存活率，菌落數(shù)以每毫升菌落形成單位的lg值[lg(CFU/mL)]表示。

存活率(%)=100×最終值[lg(CFU/mL)]/
初始值[lg(CFU/mL)]。

1.2.7 腸液、胃液耐受試驗(yàn)

參考《中國藥典》2010版配制人工胃液、人工腸液，并用0.22 μm微孔無菌濾膜(水系)過濾備用。采用Sornsenee等[13]描述的體外模擬胃腸道耐受試驗(yàn)方法進(jìn)行。Y68細(xì)菌懸液按1∶10分別稀釋于模擬人工胃液、腸液中，37 ℃厭氧培養(yǎng)箱分別孵育3、10 h，以滿足胃蛋白酶以及胰酶耐受條件。分別取經(jīng)人工胃液孵育0、3 h，人工腸液孵育0、4和10 h菌液通過稀釋涂布平板法，計(jì)算細(xì)菌存活率，菌落數(shù)以lg(CFU/mL)表示。

1.2.8 膽鹽耐受試驗(yàn)

根據(jù)Chen等[14]的膽汁耐受性試驗(yàn)方法，Y68細(xì)菌懸液在添加膽汁(質(zhì)量體積比分別為0、0.1%、0.3%、0.5%)的MRS肉湯中1∶10稀釋，37 ℃厭氧培養(yǎng)箱孵育4 h。取經(jīng)處理0、4 h的菌液計(jì)算細(xì)菌存活率，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3個(gè)重復(fù)。

1.2.9 細(xì)菌自凝集試驗(yàn)

根據(jù)Del Re等[15]細(xì)菌自凝集試驗(yàn)方法，將細(xì)菌懸液用PBS稀釋至OD600 nm值=0.5，置于37 ℃厭氧環(huán)境下靜置孵育，分別收取0、2、4、12和24 h上清液，測定OD600 nm值。自聚集率的計(jì)算公式如下：

自聚集率(%)=[1-(Atime/A0)]×100。

式中：Atime為特定時(shí)間的吸光度；A0為0 h的吸光度。

1.2.10 細(xì)菌疏水性試驗(yàn)

參照Sornsenee等[13]二甲苯萃取法測定菌株的疏水性。將菌體在OD600 nm值=0.5的PBS中重懸制得細(xì)菌懸液。取2 mL細(xì)菌懸液與1 mL二甲苯混合，在37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中靜置孵育30 min以分離水相和有機(jī)相。孵育后測量水相的OD600 nm值。疏水率采用如下公式計(jì)算：

疏水率(%)=[(A0-A)/A0]×100。

式中：A0和A是二甲苯萃取前后測定的吸光度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Graphpad Prism 7.0軟件進(jìn)行分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離篩選結(jié)果

從雞盲腸壁分離得到13株共生菌，以培養(yǎng)48 h的共生菌為研究對象，以雞白痢沙門氏菌ATCC19945和金黃色葡萄球菌USA300為指示菌進(jìn)行抑菌作用篩查，由圖1抑菌試驗(yàn)結(jié)果可知，有3株共生菌發(fā)酵上清液對2種指示菌均有較強(qiáng)抑菌作用，編號分別為Y14、Y68、Y187。其中Y68菌株對雞白痢沙門氏菌ATCC19945抑菌圈直徑為(21.64±0.31) mm，對金黃色葡萄球菌USA300抑菌圈直徑為(15.13±0.23) mm。

A: 13株共生菌培養(yǎng)物對雞白痢沙門氏菌ATCC19945抑菌效果評價(jià)；B:13株共生菌培養(yǎng)物對金黃色葡萄球菌USA300抑菌效果評價(jià)；C:Y14、Y68、Y187抑菌效果圖。

2.2 菌種鑒定結(jié)果

將獲得的菌株Y68的16S rRNA序列通過NCBI blast進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示它和卷曲乳桿菌ATCC33820序列比對結(jié)果相似度為100%。通過MEGA 7.0軟件的Neighboring-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，并將測序結(jié)果與同源性相近的菌株進(jìn)行多重序列比較，通過親緣關(guān)系進(jìn)一步確定菌株Y68為乳桿菌屬的卷曲乳桿菌。

Lactobacillus acidophilus strain NBRC 13951：嗜酸乳桿菌NBRC 13951；Lactobacillus helveticus strain NBRC 15019：瑞士乳桿菌NBRC 15019；Lactobacillus ultunensis strain CCUG 48460：厄爾納拉乳桿菌CCUG 48460：厄爾納拉乳桿菌CCUG 48460；Lactobacillus kefiranofaciens strain LMG 19149：馬乳酒樣乳桿菌LMG 19149；Lactobacillus kitasatonis strain JCM 1039：卡氏乳桿菌JCM 1039；Lactobacillus amylovorus strain DSM 20531：噬淀粉乳桿菌DSM 20531；Lactobacillus crispatus strain ATCC 33820：卷曲乳桿菌ATCC 33820；Lactobacillus hamster strain DSM 5661：倉鼠乳桿菌DSM 5661；Lactobacillus kullabergensis strain Biut2N：庫拉堡乳桿菌Biut2N。

2.3 生長曲線及菌液pH

卷曲乳桿菌Y68對數(shù)生長期為6～24 h，穩(wěn)定期為24～60 h，60 h后進(jìn)入衰亡期(圖3)。菌液pH在0～24 h內(nèi)下降速度較快，在24～48 h菌液pH下降速度減慢，48 h后菌液pH穩(wěn)定在3.89(圖3)，Y68表現(xiàn)出較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力。

圖3 卷曲乳桿菌Y68生長曲線及發(fā)酵液pH變化

2.4 抗生素敏感性試驗(yàn)結(jié)果

如表1所示，Y68對所檢測的β-內(nèi)酰胺類抗生素(青霉素、頭孢菌素)、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(紅霉素、麥迪霉素)、酰胺醇類(氯霉素)、半合成衍生物(克林霉素)、糖肽類抗生素(萬古霉素)較為敏感，對所檢測的四環(huán)素、喹諾酮類抗生素(諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星)、氨基糖苷類抗生素(慶大霉素、卡那霉素)以及呋喃唑酮均表現(xiàn)出耐藥。

表1 卷曲乳桿菌Y68抗生素敏感試驗(yàn)結(jié)果

2.5 卷曲乳桿菌Y68在體外模擬胃腸道條件下的存活率

卷曲乳桿菌Y68的酸耐受結(jié)果如圖4-A所示。卷曲乳桿菌Y68在pH 2.0環(huán)境下孵育3 h后存活率從83.07%下降至52.61%，仍具有較高的存活率；在pH 3.0環(huán)境中分別孵育0、3 h后，存活率分別為94.07%和90.92%；在pH 4.0環(huán)境中分別孵育0、3 h后，存活率分別為99.29%和92.60%。

在人工胃液中，卷曲乳桿菌Y68的菌落數(shù)在3 h后從8.87 lg (CFU/mL)(0 h)下降到5.84 lg (CFU/mL)(3 h)，存活率為65.92%(圖3-B)。在人工胃液中培養(yǎng)4 h后，未檢測到細(xì)菌存活(圖4-B)。在人工腸液中，4 h時(shí)卷曲乳桿菌Y68的存活率為93.19%(圖4-B)，10 h時(shí)存活率為86.23%(圖4-B)。

A：卷曲乳桿菌Y68酸耐受能力；B：卷曲乳桿菌Y68胃腸液耐受能力；C：卷曲乳桿菌Y68膽鹽耐受能力。

在膽鹽耐受試驗(yàn)中(圖4-C)，卷曲乳桿菌Y68在0.1%(w/v)膽鹽環(huán)境中菌落數(shù)為7.89 lg (CFU/mL)，存活率為94.95%；0.3%(w/v)膽鹽環(huán)境中菌落數(shù)為6.39 lg (CFU/mL)，存活率為76.94%；0.5%(w/v)膽鹽環(huán)境中菌落數(shù)為4.83 lg ( CFU/mL)，存活率為58.14%。

2.6 細(xì)菌自凝集以及疏水性試驗(yàn)結(jié)果

卷曲乳桿菌Y68的自聚集率如圖5所示，在37 ℃厭氧環(huán)境下卷曲乳桿菌Y68具有較強(qiáng)的自聚集能力，2 h時(shí)自聚集率為(29.71±0.40)%，4 h自聚集率為(66.23±0.56)%，12 h自聚集率為(95.04±0.16)%，24 h時(shí)自聚集率為(97.23±0.76)%。經(jīng)細(xì)菌疏水性檢測，計(jì)算得到卷曲乳桿菌Y68的疏水率為(89.59±0.63)%。

圖5 卷曲乳桿菌Y68自聚集率

3 討 論

卷曲乳桿菌作為健康女性陰道微生物組中的優(yōu)勢菌群，常見定植于人類陰道中，另外也發(fā)現(xiàn)可定植于人的口腔和腸道[16]，以及雞的腸道和嗉囊等部位[17]。卷曲乳桿菌可調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)[18]、減輕小鼠過敏癥狀[19]、下調(diào)癌基因表達(dá)以及抑制癌細(xì)胞增殖[20]以及產(chǎn)生各種抗菌物質(zhì)[21]，而被認(rèn)為具有很大的開發(fā)為畜禽微生態(tài)制劑的潛力。

抗菌活性被認(rèn)為是益生菌菌株篩選的一項(xiàng)重要標(biāo)準(zhǔn)。Wang等[22]發(fā)現(xiàn)從陰道分離的卷曲乳桿菌產(chǎn)生的抗菌化合物能夠強(qiáng)烈抑制白色念珠菌的生長、菌絲形成并調(diào)節(jié)毒力相關(guān)基因表達(dá)。Lee等[23]發(fā)現(xiàn)卷曲乳桿菌可以拮抗結(jié)核分枝桿菌。而Scillato等[21]發(fā)現(xiàn)，從人陰道分離的卷曲乳桿菌對包括金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和糞腸球菌等在內(nèi)的多種病原菌，均有較強(qiáng)的抗菌活性。本研究從雞盲腸壁分離的1株卷曲乳桿菌Y68，顯示出對雞白痢沙門氏菌ATCC19945和金黃色葡萄球菌USA300較強(qiáng)的抑菌活性。因此，本試驗(yàn)分離得到的卷曲乳桿菌Y68具備開發(fā)為新型畜禽微生態(tài)制劑的首要前提。

益生菌進(jìn)入腸道后，通常需要快速定植并迅速生長，從而在微生物競爭中獲得優(yōu)勢，成為優(yōu)勢菌群[6]。本試驗(yàn)中，卷曲乳桿菌Y68培養(yǎng)6 h進(jìn)入對數(shù)生長期，24 h進(jìn)入穩(wěn)定生長期，具備快速生長能力，在厭氧培養(yǎng)發(fā)酵后培養(yǎng)上清pH可以降至3.9左右，充分說明卷曲乳桿菌Y68良好的生長特性及較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力。

益生菌通常含有一些抗性基因，但一般被認(rèn)為是無害的?？股孛舾行栽囼?yàn)表明，卷曲乳桿菌Y68對紅霉素、麥迪霉素、青霉素、頭孢菌素、氯霉素、萬古霉素、克林霉素較為敏感，對諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、慶大霉素、卡那霉素以及呋喃唑酮表現(xiàn)出耐藥。有研究認(rèn)為，氨基糖苷類抗生素抗性基因(如慶大霉素、卡那霉素)在卷曲乳桿菌中是普遍存在的，不太可能以菌株特異性方式發(fā)揮作用[16]。而對四環(huán)素表現(xiàn)出耐藥，幾乎是所有乳酸菌都具有的[24]。卷曲乳桿菌Y68耐藥基因還需從基因組水平進(jìn)一步確定，從而為臨床應(yīng)用提供更加有效的支撐。

益生菌進(jìn)入腸道定植，需耐受胃腸道的特殊環(huán)境，而這也被認(rèn)為是益生菌應(yīng)當(dāng)具備的關(guān)鍵特性[25]。因此，體外模擬胃腸道環(huán)境，評估菌株的耐受特性是評價(jià)益生菌功能的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)中，卷曲乳桿菌Y68在pH 3.0環(huán)境下存活率高達(dá)90.92%，而在pH 2.0環(huán)境下存活率仍達(dá)52.61%，在模擬胃液中存活率為65.92%，模擬腸液中處理4 h時(shí)存活率達(dá)93.19%，充分說明其可以耐受胃腸道環(huán)境。動(dòng)物腸道不同部位含有一定量的膽鹽，濃度通常在0.03%～0.50%波動(dòng)，因此，對膽鹽耐受有利于益生菌在宿主腸道定植[26]。卷曲乳桿菌Y68在0.5%(w/v)膽鹽環(huán)境中存活率達(dá)58.14%，說明具有良好的耐受膽鹽的能力。對胃腸道環(huán)境較強(qiáng)的耐受特性，進(jìn)一步表明卷曲乳桿菌Y68具備開發(fā)為畜禽微生態(tài)制劑的潛在條件。

益生菌突破胃腸道環(huán)境后，在腸道增殖及發(fā)揮功能，需要具備對腸上皮細(xì)胞或腸黏膜表面較強(qiáng)的黏附特性，因此，黏附能力成為篩選益生菌的重要標(biāo)準(zhǔn)之一[27]。益生菌的自聚集能力和疏水能力被廣泛地用于評價(jià)益生菌黏附性[28-29]。有研究發(fā)現(xiàn)，卷曲乳桿菌對宿主細(xì)胞的黏附性與自聚集能力存在關(guān)系，且自聚集能力強(qiáng)的卷曲乳桿菌對黏液或Caco2細(xì)胞的黏附性更好[30]。另外，有研究同樣發(fā)現(xiàn)，在小鼠體內(nèi)自聚集特性也可以增強(qiáng)卷曲乳桿菌的腸道定植[31]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，卷曲乳桿菌Y68也具有較強(qiáng)的自聚集能力，表明卷曲乳桿菌Y68具有對腸道強(qiáng)黏附的潛力，具有可促進(jìn)形成胃腸道防御屏障的潛能。

4 結(jié) 論

本研究從雞盲腸壁分離得到1株卷曲乳桿菌Y68，滿足作為益生菌的標(biāo)準(zhǔn)，包括自聚集能力以及疏水能力、對低pH和高膽鹽以及消化酶的耐受性、對某些抗生素的敏感性。卷曲乳桿菌Y68可以適應(yīng)胃腸道生存環(huán)境，抵御腸道病原體的定植，可以為宿主機(jī)體提供潛在保護(hù)，具有用于研制畜禽微生態(tài)制劑的潛力。