徐 暢 張 姹* 譚成全 習欠云 王聲會 江青艷 束 剛**

(1.華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，農(nóng)業(yè)部華南動物營養(yǎng)與飼料科學觀測實驗站，廣東省動物營養(yǎng)調控重點實驗室，廣州510642；2.廣東溫氏種豬科技有限公司，云浮527400)

雄性動物的生殖能力對于種群繁衍至關重要[1]。雄性激素水平和精子質量不僅決定了受精率[2]和胎兒發(fā)育[3]，還對子代的健康和生長發(fā)育[4]尤為關鍵。精子發(fā)生障礙被定義為精子數(shù)量和質量異常，是雄性動物不育最重要的原因之一[5-6]。精子發(fā)生是從精原細胞經(jīng)增殖分化、減數(shù)分裂形成精子的復雜過程[7]，受睪丸內外因素的影響。內在因素主要表現(xiàn)為睪丸間質細胞可分泌睪酮，維持雄性動物生殖系統(tǒng)發(fā)育和正常生精機能[8]；外在因素則主要表現(xiàn)為下丘腦和垂體分泌的激素對睪丸間質細胞的刺激[9]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，雄性動物睪酮分泌和精子生成會受到營養(yǎng)水平[10-11]、飲食方式[12-14]、應激[15]和運動[16]等因素的影響。其中，運動是改善雄性動物生殖機能最有效的方式之一。

系列研究表明，運動可以通過調控雄性動物睪酮含量，進而調節(jié)其生殖能力[17-19]，但目前關于運動調控雄性動物生殖的機制尚不清楚。功能代謝組學研究發(fā)現(xiàn)，運動產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物如L-蘋果酸和琥珀酸等對提高精子活力和改善精子質量具有重要作用[20-21]，提示這些生物活性代謝中間產(chǎn)物可能通過特定的信號分子介導了運動改善雄性動物生殖的功能。運動時體內代謝中間產(chǎn)物變化各異，其中α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid，AKG)是在阻力運動后產(chǎn)生的一種標志性代謝中間產(chǎn)物[22]，具有廣泛的生理學功能[23]。AKG的受體酮戊二酸受體1(oxoglutarate receptor 1，OXGR1)在睪丸組織中高豐度表達[24]。但OXGR1在睪丸組織中何種細胞上表達且對雄性動物生殖有何影響目前均不清楚。因此，本試驗旨在研究AKG/OXGR1系統(tǒng)對雄性動物睪酮分泌和精子生成的影響，為深入揭示代謝中間產(chǎn)物調控睪酮分泌和精子生成的分子機制提供科學依據(jù)，且為靶向雄性生殖的營養(yǎng)調控策略提供借鑒價值。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗設計

試驗所用雄性C57BL/6J小鼠購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心。酮戊二酸受體1敲除(OXGR1 knockout，OXGR1KO)小鼠購自上海南方模式生物研究中心，是以C57BL/6J為遺傳背景進行設計。

為研究OXGR1KO對雄性小鼠血清睪酮含量和精子生成的影響，選取10周齡雄性C57BL/6J小鼠和OXGR1KO小鼠各6只，并按體重隨機分成2組(n=3)。

為研究急性注射AKG對雄性C57BL/6J小鼠睪酮分泌的作用，在急性試驗中，首先選取16只10周齡雄性C57BL/6J小鼠，按體重隨機分成4組(n=4)，分別為對照組和注射1、5、10 mg/kg AKG組。再選取10周齡雄性WT小鼠和OXGR1KO小鼠各12只，并按體重隨機分成4組(n=3)，每組注射5 mg/kg AKG 6 h后檢測血清睪酮含量。

為研究AKG對TM3細胞睪酮分泌和胞內瞬時鈣離子信號的影響，選取TM3細胞系，分別用不同濃度AKG以及不同濃度AKG和100 ng/mL促黃體生成素(LH)共處理TM3細胞24 h后，檢測TM3細胞上清液睪酮含量，并使用200 μmol/L AKG處理TM3細胞檢測細胞內瞬時鈣離子濃度。

為研究長期添加AKG對雄性小鼠血清睪酮含量和精子生成的影響，在長期試驗中，首先選取12只8周齡雄性C57BL/6J小鼠，按體重隨機分成2組(n=6)，分別是對照組和飲水添加2%AKG組。再選取8周齡雄性C57BL/6J小鼠和OXGR1KO小鼠各12只，按體重隨機分成4組(n=6)，分別是對照組、對照飲水添加2%AKG組、OXGR1敲除組和OXGR1敲除飲水添加2%AKG組。在室溫(23±3) ℃、相對濕度(70±10)%的條件下，進行12 h循環(huán)光照試驗。對照組和OXGR1敲除組常規(guī)飲水，飼喂基礎飼糧，對照飲水添加2%AKG組和OXGR1敲除飲水添加2%AKG組飼喂基礎飼糧并在飲水中添加2%的α-酮戊二酸鈉(S30041，上海源葉生物科技有限公司)，并調pH至與對照組和OXGR1敲除組相同(pH=7.4)。本試驗飲水AKG添加量是根據(jù)Yuan等[22]試驗中使用的飲水AKG添加量(2%)所確定。基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗期為4周。

1.2 樣品采集

OXGR1KO試驗結束后，用異氟烷麻醉小鼠，眼球采血，放置至血清析出，3 000 r/min離心15 min，收集血清于-20 ℃保存待測。采血后用頸椎脫臼法處死小鼠，75%乙醇涂抹小鼠腹部，用手術剪剪開下腹部，開腹后立即采集睪丸置于睪丸組織固定液(G1121，武漢賽維爾生物科技有限公司)中固定24 h，固定結束后置于70%乙醇中脫水保存。另一側睪丸采集后置于凍存管，立即投入液氮保存，之后放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩＜毙栽囼灲Y束后，收集血清于-20 ℃保存待測。長期試驗結束后，收集血清和睪丸于-20 ℃和睪丸組織固定液中保存待測。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

1.3 樣品測定

1.3.1 睪丸OXGR1分布的測定

使用最佳切割溫度復合物(OCT)包埋小鼠睪丸并以10 μm的厚度制作睪丸冰凍切片。切片在37 ℃濕盒中經(jīng)羊血清封閉30 min后與兔抗OXGR1一抗(1∶1 000，ab140630，Abcam公司，英國)和鼠抗3β-羥類固醇脫氫酶(3β-HSD)一抗(1∶1 000，sc515120，Santa Cruz Biotechnology公司，美國)孵育過夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，每次5 min。然后與三氫-吲哚菁類(Cy3)標記山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗和異硫氰酸熒光素(FITC)標記山羊抗鼠IgG二抗，室溫下孵育1 h，PBS清洗3次，每次5 min。待樣本風干后用含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)的抗熒光淬滅封片劑(0100-20，SouthernBiotech公司，美國)封片，熒光顯微鏡(NIKON ECLIPSE Ti，Nikon公司，日本)下觀察并拍攝。

1.3.2 睪丸形態(tài)和曲細精管空腔面積的測定

OXGR1KO試驗和長期試驗結束后，取固定后的睪丸，經(jīng)沖水、梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋等處理后，以5 μm的厚度切片，常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡(AMEX1000，Thermo Fisher Scientific公司，美國)下觀察并拍照。使用ImageJ 1.8.0軟件統(tǒng)計睪丸曲細精管空腔面積。

1.3.3 血清睪酮含量的測定

OXGR1KO試驗、急性試驗和長期試驗結束后，取-20 ℃保存的血清，使用血清睪酮檢測試劑盒(KGE010，R&D Systems公司，美國)測定小鼠血清睪酮含量。

1.3.4 睪丸樣本實時熒光定量的測定

OXGR1KO試驗結束后，取-80 ℃保存的睪丸組織，經(jīng)全自動樣品快速研磨儀(JXFSTPRP-32，上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司)充分研磨后，使用Trizol法抽提小鼠睪丸組織的總RNA，用核酸蛋白測定儀(N60-Touch，NanoPhotometer公司，德國)測定RNA濃度/純度后反轉錄合成cDNA，通過實時熒光定量PCR檢測精子生成相關標志基因mRNA表達，包括代表精原細胞的早幼粒細胞白血病鋅指基因(promyelocytic leukaemia zinc finger，Plzf)，代表支持細胞的β-微管蛋白Ⅲ(class Ⅲ beta-tubulin，Tubb3)、性別決定基因盒9(sex-determining region Y box 9，Sox9)，代表精母細胞的聯(lián)會復合體蛋白3(synaptonemalcomplex protein 3，Scp3)，代表精子凝集的魚精蛋白1(protamines 1，Prm1)、魚精蛋白2(protamines 2，Prm2)、核變蛋白1(transition nuclear proteins 1，Tnp1)、外質特化蛋白(ectoplasmic specialization protein，Espin)[25]。以β-肌動蛋白(β-actin)作為內參，對數(shù)據(jù)進行處理?；诟髂康幕蚺c內參基因的擴增效率接近，根據(jù)公式計算目的基因相對于內參基因的比值來反映各基因的相對表達水平：2-ΔΔCt=2-(Ct目的基因-Ct內參基因)，其中，Ct目的基因為目的基因的Ct值，Ct內參基因為內參基因的Ct值。所有引物均依據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫公布的小鼠基因序列進行設計，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列見表2。

表2 實時熒光定量PCR所用引物序列

1.3.5 小鼠攻擊行為的測定

短期試驗期間，對照組腹腔注射200 μL生理鹽水，試驗組腹腔注射200 μL濃度為5 mg/kg AKG溶液。注射后6 h進行試驗。取一內徑30 mm、長度300 mm的圓管，將2組小鼠分別置于兩端，觀察小鼠在管內的運動情況。先被頂出圓管的一方定義為“l(fā)oser”，另一方則定義為“winner”。2組小鼠分別交叉配對，每次統(tǒng)計各自loser和winner的次數(shù)。

1.3.6 小鼠睪丸間質細胞上清睪酮含量的測定

將生長狀態(tài)良好的睪丸間質細胞系(TM3)接種于24孔板，待細胞貼壁后將其分成2組。對照組加含0.1%牛血清白蛋白(BSA)、1×胰島素-轉鐵蛋白-硒(insulin-transferrin-selenium，ITS)無酚紅杜氏培養(yǎng)基(dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)，試驗組加含0.1%BSA、1×ITS、不同濃度AKG的無酚紅DMEM。在處理24 h后收集細胞上清液，并用酶聯(lián)免疫吸附劑測定(ELISA)試劑盒檢測睪酮含量的變化[26]。

1.3.7 小鼠TM3細胞內瞬時鈣離子信號的測定

將生長狀態(tài)良好的TM3細胞接種到24孔板，待細胞生長至50%融合時使用Hanks平衡鹽溶液(Hanks balanced salt solutions，HBSS)緩沖液清洗細胞2次，將鈣離子熒光探針Fluo-8 AM(21096，AAT Bioquest公司，美國)溶于二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)緩沖液并稀釋至10 μmol/L的工作液。每孔加入200 μL鈣探針緩沖液，置于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育1 h后取出，使用HBSS緩沖液清洗細胞2次，置于熒光顯微鏡下拍照。

1.3.8 小鼠爪抓力的測定

長期試驗結束后，使用抓力測定儀(BIO-GS3，Bioseb公司，法國)檢測小鼠爪抓力。將小鼠4只鼠爪抓在金屬網(wǎng)格上，輕輕拖動尾巴向后拉直到小鼠無法抓住金屬網(wǎng)格為止。每只小鼠進行8次試驗，并用平均值來代表每只小鼠的爪抓力。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)結果用平均值±均值標準誤(SEM)表示。使用Graphpad Prism 8.0.2軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 OXGR1在小鼠睪丸組織中的細胞定位

He等[24]研究表明，OXGR1在小鼠睪丸組織大量表達，但目前尚無文章報道OXGR1在睪丸何種細胞中表達。對睪丸組織OXGR1與睪丸間質細胞特異性標志物3β-HSD共定位染色發(fā)現(xiàn)，OXGR1特異性在睪丸間質細胞中表達(圖1)。

3β-HSD：3β-羥類固醇脫氫酶 3β-hydroxysteroid dehydrogenase；DAPI：4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽 4′，6-diamidino-2-phenylindole；OXGR1：酮戊二酸受體1 oxoglutarate receptor 1；Merge：合并。

2.2 OXGR1KO對雄性小鼠血清睪酮含量和精子生成的影響

OXGR1KO(圖2-A)對小鼠睪丸形態(tài)大小無明顯影響(圖2-B)，且對小鼠睪丸重量也無顯著影響(P>0.05)(圖2-C)。而ELISA結果表明，與對照組相比，OXGR1KO顯著降低了小鼠血清睪酮含量(P<0.05)(圖2-D)。此外，OXGR1KO對睪丸曲細精管管腔形態(tài)無明顯影響(圖2-E)，且對睪丸曲細精管空腔面積也無顯著影響(P>0.05)(圖2-F)。實時熒光定量PCR結果表明，OXGR1KO顯著或極顯著下調了睪丸支持細胞標志基因Tubb3、Sox9的mRNA相對表達水平(P<0.05或P<0.01)(圖2-G)。

A：OXGR1KO驗證圖；B、C：睪丸大小圖和睪丸重量統(tǒng)計圖；D：血清睪酮含量統(tǒng)計圖；E、F：睪丸HE染色及空腔面積統(tǒng)計圖；G：睪丸精子生成相關標志基因mRNA表達。

2.3 急性注射AKG對雄性小鼠血清睪酮含量和攻擊行為的影響

與對照組相比，注射5 mg/kg的AKG 6 h后可顯著增加小鼠血清睪酮含量(P<0.05)(圖3-A)。而OXGR1KO顯著逆轉了AKG升高血清睪酮含量的效應(P<0.05)(圖3-B)。由于血清睪酮含量與小鼠攻擊行為呈正相關[26]，于是對小鼠的攻擊行為檢測發(fā)現(xiàn)，腹腔急性注射5 mg/kg的AKG 6 h后可顯著增加小鼠的攻擊性(P<0.05)(圖3-C、圖3-D)。

A、B：血清睪酮含量統(tǒng)計圖；C：小鼠試管攻擊行為試驗示意圖；D：小鼠勝利次數(shù)統(tǒng)計圖。

2.4 AKG對TM3細胞睪酮分泌和胞內瞬時鈣離子信號的影響

100 ng/mL LH處理TM3細胞24 h后提高了TM3細胞上清睪酮含量，且與20 和2 000 μmol/L AKG共處理24 h后可極顯著提高TM3細胞上清睪酮含量(P<0.01)(圖4-A)。200 μmol/L AKG處理TM3細胞后可極顯著增加胞內瞬時鈣離子的釋放(P<0.01)(圖4-B)。

A：TM3細胞上清睪酮含量統(tǒng)計圖；B：TM3細胞內瞬時鈣離子濃度變化統(tǒng)計圖。

2.5 長期飲水添加AKG對小鼠血清睪酮含量和精子生成的影響

與對照組相比，長期飲水添加2%AKG可極顯著增加小鼠第10、11和12周的體重(P<0.01)(圖5-A)，且可極顯著增加小鼠爪抓力(P<0.01)(圖5-B)。此外，飲水添加2%AKG可極顯著增加小鼠睪丸重量(P<0.01)(圖5-C、圖5-D)。睪丸組織HE染色結果顯示，飲水添加2%AKG可極顯著減少曲細精管空腔面積(P<0.01)(圖5-E、圖5-F)，從而促進精子生成[19]。此外，飲水添加2%AKG可極顯著增加小鼠血清睪酮含量(P<0.01)(圖5-G)。而OXGR1KO顯著逆轉了AKG減少曲細精管空腔面積和血清睪酮含量的效應(P<0.05)(圖5-H、圖5-I、圖5-J)。

A：體重統(tǒng)計圖；B：爪抓力統(tǒng)計圖；C：睪丸示意圖；D：睪丸重量統(tǒng)計圖；E、F、H、J：睪丸HE染色及空腔面積統(tǒng)計圖；G、I：血清睪酮含量統(tǒng)計圖。WT：對照組；AKG：α-酮戊二酸；OXGR1：酮戊二酸受體1。

3 討 論

運動可產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物進而調控雄性動物生殖能力。Saraf等[20]研究表明，運動產(chǎn)生的L-蘋果酸不僅參與了精子線粒體中丙酮酸的氧化，而且對提高精子活力和受精率都十分重要。Yuan等[22]研究發(fā)現(xiàn)，耐力運動產(chǎn)生的代謝物黃嘌呤含量在血清中明顯下降，而黃嘌呤是男性不育的生物標志物[27]，這意味著耐力運動可間接改善精子質量。此外，運動產(chǎn)生的琥珀酸被發(fā)現(xiàn)在弱精子癥患者的精液中顯著降低[21]，這同樣說明琥珀酸對調控精子質量十分關鍵。而AKG作為運動產(chǎn)生的關鍵代謝中間產(chǎn)物，對其調控雄性動物睪酮含量和精子發(fā)生的研究鮮有報道。本研究發(fā)現(xiàn)，AKG的受體OXGR1在睪丸間質細胞中高豐度表達，OXGR1KO可顯著降低小鼠血清睪酮含量和Tubb3、Sox9等精子發(fā)生相關標志基因mRNA相對表達豐度。腹腔急性注射AKG可通過OXGR1顯著提高小鼠血清睪酮含量和攻擊性。使用AKG和LH共處理小鼠TM3細胞發(fā)現(xiàn)，AKG可以濃度依賴性的方式提高TM3細胞上清睪酮含量，其調控機制可能由胞內瞬時鈣離子信號介導。長期飲水添加AKG可通過OXGR1減少曲細精管空腔面積，提高血清睪酮含量?？傊?，AKG可通過睪丸間質細胞上的OXGR1提高雄性動物睪酮含量，促進精子生成。這為采用運動替代營養(yǎng)策略治療雄性激素分泌不足、精子發(fā)生障礙等雄性不育疾病提供了研究依據(jù)。

OXGR1作為一種定位于質膜上的G蛋白偶聯(lián)受體，參與了機體廣泛的生理學過程。Cherif等[28]研究表明，分布在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cell，RGC)上的OXGR1參與了RGC向丘腦的投射。Liu等[29]研究發(fā)現(xiàn)，脂肪細胞中的OXGR1可介導AKG抑制信號轉導因子和轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)/核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號通路，從而減輕脂肪細胞炎癥。Wang等[30]研究也發(fā)現(xiàn)，成纖維細胞中的OXGR1可通過調控磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亞基(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit gamma，PIK3CG)/AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶1(AKT serine/threonine kinase 1，AKT1)信號通路介導成纖維細胞的生長和分化。而本研究發(fā)現(xiàn)，OXGR1KO可顯著降低小鼠血清睪酮含量，表明OXGR1對小鼠血清睪酮分泌具有重要作用。此外，雄性動物基礎血清睪酮含量相對恒定的維持主要依靠LH的調節(jié)，OXGR1可能介導了其中一部分作用，且運動產(chǎn)生的AKG可通過OXGR1進一步促進血清睪酮的分泌。

AKG作為三羧酸循環(huán)重要代謝中間產(chǎn)物，對促進機體生長發(fā)育、調節(jié)機體能量代謝、維持機體腸道健康、改善機體免疫力等都具有積極作用。AKG的受體OXGR1也介導了機體腎小管酸堿平衡調節(jié)、脂肪細胞炎癥、成纖維細胞生長發(fā)育等生理過程。本研究發(fā)現(xiàn)，急性注射AKG和長期飲水添加AKG均可顯著提高小鼠血清睪酮含量，且AKG與LH共處理TM3細胞系同樣可顯著增加細胞上清睪酮含量。睪酮作為一種調節(jié)雄性動物生長發(fā)育的類固醇激素，不僅對精子的發(fā)生至關重要[31]，而且對動物的行為有重要的調控作用[32]。睪酮的分泌受睪丸間質細胞和下丘腦-垂體分泌的激素的影響。陳靜[33]研究發(fā)現(xiàn)，下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素(gonadotropin releasing hormone，GnRH)可上調類固醇生成蛋白和合成酶的表達從而刺激睪酮的分泌。Xu等[34]研究發(fā)現(xiàn)，鈣網(wǎng)膜蛋白可上調睪丸間質細胞胞內鈣離子水平從而促進睪酮分泌。而本研究發(fā)現(xiàn)，AKG可顯著增加TM3細胞內瞬時鈣離子的釋放，且與LH共處理能顯著上調TM3細胞上清睪酮含量。這表明，AKG可能通過TM3細胞上OXGR1促進胞內瞬時鈣離子的釋放進而促進睪酮的分泌，并最終對雄性動物的生殖能力和行為調控產(chǎn)生積極影響。由于促黃體生成素受體(LHR)胞內信號通路也需要鈣離子信號介導[35]，且LHR可與G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)直接形成異源二聚體[36]，對于LHR和OXGR1之間有無互作仍有待進一步深入研究。

4 結 論

AKG可通過睪丸間質細胞中的OXGR1促進雄性小鼠睪酮分泌，影響曲細精管發(fā)育和精子生成。