謝 巖 王 暉 李 娜 賈漫麗 黃 露 孫志超 李季生

(承德醫(yī)學(xué)院蠶業(yè)研究所，河北省高校特產(chǎn)蠶桑應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，承德067000)

家蠶(Bombyxmori)為寡食性昆蟲，通過(guò)與其宿主桑樹(MorusalbaL.)的自然選擇和長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化，對(duì)桑葉表現(xiàn)出偏好的采食性和桑葉營(yíng)養(yǎng)成分消化吸收的適應(yīng)性[1-3]。人工飼料可以克服桑樹生長(zhǎng)期對(duì)蠶業(yè)生產(chǎn)季節(jié)性的限制，通過(guò)人為調(diào)配營(yíng)養(yǎng)成分來(lái)提高生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化程度[4-5]，現(xiàn)已成為蠶業(yè)科學(xué)發(fā)展的一個(gè)研究熱點(diǎn)。但由于家蠶的攝食性和營(yíng)養(yǎng)需求受到品種、地域、飼養(yǎng)環(huán)境的諸多影響，難以形成統(tǒng)一人工飼料用于大規(guī)模推廣和全齡期飼用，而且全齡人工飼料飼育效果難以達(dá)到桑葉的飼育效果[6]。因此，桑葉仍然是家蠶的最適宜食物來(lái)源。桑葉營(yíng)養(yǎng)成分含量直接影響家蠶的生長(zhǎng)和經(jīng)濟(jì)性能[7-8]，適宜的優(yōu)質(zhì)桑葉的選擇是家蠶健康生長(zhǎng)和蠶繭生產(chǎn)的保障。桑葉成熟度是桑葉營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變動(dòng)的重要因素，其與家蠶生長(zhǎng)和經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)系研究較多[9-12]，但鮮有深入揭示其分子機(jī)制的研究，難以為實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用提供準(zhǔn)確的理論指導(dǎo)。家蠶是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，也是基礎(chǔ)生物學(xué)研究的優(yōu)良模式動(dòng)物[13-14]。全基因組計(jì)劃的完成和遺傳圖譜的構(gòu)建奠定了其在現(xiàn)代生命科學(xué)領(lǐng)域的優(yōu)勢(shì)地位，并促進(jìn)了家蠶功能基因組學(xué)研究的發(fā)展。蛋白質(zhì)組學(xué)是功能基因組學(xué)的重要組成部分，通過(guò)研究參與特定生理或試驗(yàn)處理狀態(tài)的所有的蛋白質(zhì)種類及其變化闡述生命活動(dòng)機(jī)理，相對(duì)和絕對(duì)定量同位素標(biāo)記(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)技術(shù)因其高通量、高重現(xiàn)性、高靈敏性的特點(diǎn)成為蛋白質(zhì)組定性和定量研究的有效工具，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)功能注釋、生物標(biāo)記篩選、藥物效應(yīng)驗(yàn)證等生命科學(xué)領(lǐng)域[15-16]，已在家蠶免疫、性別分化和滯育等機(jī)制的研究中發(fā)揮重要作用。

家蠶5齡食桑量占全齡食桑量的80%以上[17]，該齡期飼喂不同成熟度桑葉，蠶體會(huì)發(fā)生明顯差異[10,18-19]，家蠶脂肪體具有類似哺乳動(dòng)物肝臟和腎臟的功能，存在大量與合成、代謝、免疫和繁殖相關(guān)的蛋白[20-21]，是研究家蠶對(duì)攝食物質(zhì)響應(yīng)的關(guān)鍵器官[22-23]。本試驗(yàn)在測(cè)定秋季老、嫩桑葉營(yíng)養(yǎng)和活性物質(zhì)含量的基礎(chǔ)上，采用iTRAQ結(jié)合質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)高效捕獲5齡蠶脂肪體對(duì)2種成熟度桑葉營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變動(dòng)反應(yīng)的差異表達(dá)蛋白，并應(yīng)用生物信息方法對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行功能聚類和互作分析，以揭示桑葉成熟度與其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量的聯(lián)系，攝食2種成熟度桑葉的家蠶脂肪體蛋白質(zhì)組差異程度，蠶體攝食2種成熟度桑葉后其脂肪體細(xì)胞內(nèi)差異表達(dá)蛋白的功能分類和表達(dá)模式，蠶體對(duì)攝食物質(zhì)質(zhì)量變動(dòng)作出響應(yīng)的關(guān)鍵蛋白，篩選出的桑葉主要差異營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和蠶體響應(yīng)功能蛋白，為進(jìn)一步揭示單一營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變動(dòng)對(duì)蠶體生長(zhǎng)和生產(chǎn)影響的關(guān)聯(lián)機(jī)制奠定基礎(chǔ)，以期豐富飼養(yǎng)家蠶營(yíng)養(yǎng)組分的合理選擇和調(diào)配的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣本采集

家蠶品種：菁松×皓月。1～4齡家蠶幼蟲相同條件(25 ℃，同質(zhì)葉片)下飼喂，5齡幼蟲眠起，隨機(jī)挑選200頭分為2組(每組100頭)，測(cè)定總重并分別飼喂9月桑樹老葉(春伐抽條基部4片葉)和嫩葉(春伐抽條頂部完全展開葉片4片)，每天定量飼喂3次，次日清晨飼喂前(排出腸道糞便)稱重并記錄。

連續(xù)飼喂3 d后，解剖蠶體采集脂肪體組織，每個(gè)組設(shè)置2個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)為6個(gè)個(gè)體(雌雄各占1/2)脂肪體混合樣品，共計(jì)4個(gè)樣品(C1、C2、T1、T2)，C1、C2為老葉組(C組)樣品，T1、T2為嫩葉組(T組)樣品。

1.2 桑葉物質(zhì)含量測(cè)定

飼蠶用老、嫩新鮮桑葉真空低溫凍干，在45 ℃烘箱內(nèi)烘至恒重，測(cè)定失水量，失水量和鮮葉重的比值作為水分含量值。凍干樣品研磨成粉末，過(guò)80目篩。粗脂肪和粗蛋白質(zhì)含量分別采用索氏抽提法和凱氏定氮法測(cè)定(青島科創(chuàng)質(zhì)量檢測(cè)有限公司承擔(dān))。可溶性糖含量采用植物可溶性糖含量檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：BC0030)測(cè)定，還原性糖含量采用3，5-二硝基水楊酸(DNS)比色法測(cè)定，多糖含量采用蒽酮-硫酸比色法測(cè)定，總黃酮含量采用Al(NO3)3-NaNO2-NaOH比色法測(cè)定，總多酚含量采用福林酚比色法測(cè)定，上述指標(biāo)均由紫外可見分光光度計(jì)(普析通用，中國(guó))檢測(cè)。1-脫氧野尻霉素(1-DNJ)含量采用高效液相色譜(HPLC)法，使用LC-2030高效液相色譜儀(島津，日本)測(cè)定。除水分外，其余物質(zhì)均采用測(cè)定物質(zhì)重量和干物質(zhì)重量的比值作為含量值。每種成熟度均采集3個(gè)生物學(xué)重復(fù)樣品用于物質(zhì)測(cè)定，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)形式表示，含量數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行描述統(tǒng)計(jì)量計(jì)算和單因素方差分析。

1.3 家蠶樣品總蛋白提取

取適量樣品加入液氮研磨，采用三氯乙酸(TCA)/丙酮沉淀法去除雜質(zhì)，預(yù)冷純丙酮洗滌沉淀3～5次。裂解液[8 mol/L尿素、30 mmol/L 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)、2 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、10 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)]重懸蛋白后，進(jìn)行還原烷基化處理。再加入4倍體積的預(yù)冷丙酮，沉淀蛋白，用含0.1%(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))十二烷基磺酸鈉(SDS)的50%(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))三乙醇胺(TEA)復(fù)溶后離心，保留上清。分別使用Bradford法和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對(duì)提取的蛋白進(jìn)行定量和完整性檢測(cè)。

1.4 家蠶樣品總蛋白iTRAQ標(biāo)記和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)定性和定量分析

樣本總蛋白的iTRAQ標(biāo)記與質(zhì)譜分析委托華大基因科技有限公司進(jìn)行。每個(gè)樣品取100 μg，加入等量適宜的胰蛋白酶(trypsin)將蛋白酶解為肽段，進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記方法和步驟參照iTRAQ?Reagent-8 Plex Multiplex Kit(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，美國(guó))說(shuō)明書，1個(gè)樣品標(biāo)記1種同位素標(biāo)記，真空抽干標(biāo)記肽段用于后續(xù)試驗(yàn)。

各標(biāo)記肽段樣品等量混合后通過(guò)Agilent 1100高效液相色譜儀(安捷倫，美國(guó))和SCX 100強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱(飛諾美，美國(guó))進(jìn)行預(yù)分級(jí)，通過(guò)梯度洗脫分離30個(gè)組分，合并為16個(gè)，再使用Acclaim PepMap C18 100(賽默飛，美國(guó))反相色譜除鹽。脫鹽組分依次通過(guò)納升液相系統(tǒng)Dionex ultimate 3000 nano LC system(賽默飛，美國(guó))的Strata-X C18 300色譜柱(艾杰尓，美國(guó))進(jìn)行梯度洗脫分離。質(zhì)譜檢測(cè)采用Q-Exactiv質(zhì)譜儀(賽默飛，美國(guó))，檢測(cè)參數(shù)：正離子模式，母離子掃描范圍350～2 000 Da，二級(jí)分辨率17 500，離子源電壓1 800 V，毛細(xì)管溫度320 ℃，碎裂模式為高能碰撞解離(higher collision energy dissociation，HCD)。

將質(zhì)譜掃描的原始文件輸入到Proteome Discoverer 1.3軟件(賽默飛，美國(guó))進(jìn)行提取和篩選質(zhì)譜譜圖[母離子質(zhì)量范圍：350～6 000 Da，二級(jí)質(zhì)譜圖中最小峰數(shù)：10，信噪比(S/N)域值：1.5]。提取后的譜圖用Mascot 2.3.0軟件在Bom_mori_uni數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行蛋白質(zhì)的定性和定量分析。

1.5 差異表達(dá)蛋白的篩選、功能富集分析和互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

篩選差異表達(dá)倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)>1.25或<0.80，即|log2FC|>0.33且P<0.05的蛋白進(jìn)行功能信息注釋、富集分析和互作分析。采用蛋白索引號(hào)(UniProtKB AC)在UniProt(http://www.uniprot.org)獲取蛋白名稱和基本功能，無(wú)信息的蛋白注釋其氨基酸序列在AmiGO2(http://wiki.geneontology.org/index.php/AmiGO_2)和NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中比對(duì)到最高同源序列(相似性大于80%)的信息；通過(guò)QuickGO(http://www.ebi.ac.uk/QuickGO/)和WEGO2.0(http://wego.genomics.org.cn)對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO注釋和功能富集分析，通過(guò)KEGG(https://www.kegg.jp/)獲取差異表達(dá)蛋白參與的代謝通路；使用STING(https://string-db.org/)和Cytoscape 3.9.1軟件繪制差異表達(dá)蛋白互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 家蠶體重變化

分別以老、嫩桑葉定量飼喂100頭5齡眠起蠶，每天調(diào)查1次蠶體總重和存活數(shù)，共投食3 d，測(cè)定數(shù)據(jù)4次(包括眠起采食前的測(cè)定，即第0天)，其中老葉組家蠶4次平均體重分別為0.66、1.37、1.61、2.13 g，嫩葉組家蠶4次平均體重分別為0.65、1.38、1.72、2.37 g。如圖1所示，飼喂不同成熟度葉片第2天開始，嫩葉組家蠶體重明顯高于老葉組，并且在第3天差異趨勢(shì)愈加明顯。

圖1 家蠶飼喂老、嫩桑葉的體重增長(zhǎng)趨勢(shì)

2.2 老、嫩桑葉物質(zhì)含量差異分析

依次測(cè)定老、嫩桑葉營(yíng)養(yǎng)成分含量：水分、粗蛋白質(zhì)、可溶性糖、粗脂肪和還原性糖；活性物質(zhì)含量：多糖、總黃酮、總多酚、1-DNJ。其中糖類均采用無(wú)水葡萄糖配制梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品，總黃酮、總多酚和1-DNJ分別采用蘆丁、沒(méi)食子酸、1-DNJ標(biāo)準(zhǔn)品配制適宜梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，各測(cè)定成分標(biāo)準(zhǔn)曲線線性程度良好，R2均高于0.99，結(jié)果見表1。除水分和多糖外，老、嫩桑葉的各物質(zhì)含量均存在顯著或極顯著差異(P<0.05或P<0.01)。嫩桑葉的粗脂肪、粗蛋白質(zhì)、還原性糖、總黃酮、總多酚、1-DNJ含量均高于老桑葉，可溶性糖含量則低于老桑葉。

表1 桑葉物質(zhì)含量

2.3 總蛋白提取質(zhì)量

Bradford法繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.183x-0.023，R2=0.993，提取的總蛋白濃度為1.09～1.52 μg/μL，總量為654～912 μg，取等量各樣品進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果如圖2，蛋白質(zhì)電泳條帶清晰完整，無(wú)降解。

1～4泳道分別為家蠶脂肪體樣本C1、C2、T1、T2，泳道M為蛋白質(zhì)marker(14～94 kDa)。

2.4 家蠶脂肪體蛋白質(zhì)譜鑒定及定量結(jié)果

通過(guò)質(zhì)譜掃描、PD篩選和Mascot 2.3.0匹配，共鑒定到：總譜圖數(shù)344 774，匹配譜圖數(shù)81 713，肽段種類數(shù)16 170和蛋白數(shù)2 172。設(shè)置FC>1.20或<0.83且P<0.05為篩選條件，共獲得173個(gè)差異表達(dá)蛋白，見表2，相對(duì)于老葉組，嫩葉組上調(diào)表達(dá)蛋白為85個(gè)，下調(diào)表達(dá)蛋白為88個(gè)。

表2 家蠶脂肪體差異表達(dá)蛋白數(shù)(嫩葉組相對(duì)于老葉組)

2.5 家蠶脂肪體差異表達(dá)蛋白功能注釋和聚類結(jié)果

選取FC>1.25或<0.80的58個(gè)上調(diào)蛋白和53個(gè)下調(diào)蛋白用于功能聚類分析，通過(guò)UNIPROTKB、NCBI和STRINGS等獲取的綜合信息對(duì)上述蛋白的基本信息和功能進(jìn)行注釋，除9個(gè)蛋白外，102個(gè)蛋白均能注釋到蛋白名稱、基因名稱和功能概述中的至少1條信息。

差異表達(dá)蛋白在細(xì)胞組分、生物學(xué)過(guò)程和分子功能3個(gè)方面的GO分析，共注釋到38個(gè)上調(diào)表達(dá)蛋白和43個(gè)下調(diào)表達(dá)蛋白，見圖3。分析發(fā)現(xiàn)：1)差異表達(dá)蛋白參與9種細(xì)胞組分，細(xì)胞內(nèi)組分多于細(xì)胞膜和細(xì)胞外區(qū)，組成細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的蛋白最多；2)差異表達(dá)蛋白參與14個(gè)分子功能，綁定、離子綁定、蛋白綁定、催化活性富集到的蛋白較多；3)差異表達(dá)蛋白參與16個(gè)生物學(xué)過(guò)程，參與細(xì)胞過(guò)程、代謝過(guò)程、有機(jī)物代謝過(guò)程、初級(jí)代謝過(guò)程、氮化合物代謝過(guò)程的蛋白數(shù)量明顯高于其他過(guò)程，其次富集到蛋白較多的過(guò)程為生物過(guò)程的調(diào)節(jié)、發(fā)展過(guò)程、對(duì)刺激的反應(yīng)、對(duì)應(yīng)激的反應(yīng)。

圖3 家蠶脂肪體差異表達(dá)蛋白GO注釋

111個(gè)差異表達(dá)蛋白中的53個(gè)通過(guò)KEGG的BlastKOALA得到通路注解，共有34個(gè)蛋白映射到84個(gè)三級(jí)通路，三級(jí)通路根據(jù)功能相似性歸納為30個(gè)二級(jí)通路，進(jìn)一步概括為6個(gè)一級(jí)功能集合：代謝、遺傳信息過(guò)程、環(huán)境信息過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程、機(jī)體系統(tǒng)和人類疾病，見圖4。其中代謝、人類疾病和機(jī)體系統(tǒng)注釋到的蛋白和通路最多，分別為11個(gè)蛋白、38個(gè)通路，12個(gè)蛋白、20個(gè)通路和15個(gè)蛋白、13個(gè)通路。差異表達(dá)蛋白具體聚類到KEGG各個(gè)三級(jí)通路和功能信息見圖5。

圖4 家蠶脂肪體差異表達(dá)蛋白KEGG功能分類

圖5 家蠶脂肪體差異表達(dá)蛋白KEGG通路注釋

結(jié)合GO和KEGG分析富集到參與物質(zhì)代謝、免疫、發(fā)育、繁殖、對(duì)刺激反應(yīng)的功能相似蛋白集合，根據(jù)基因功能注釋信息，進(jìn)行匯總和分類統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見圖6。在功能聚類中按差異表達(dá)蛋白數(shù)量由多到少依次為：物質(zhì)能量代謝、發(fā)育過(guò)程、對(duì)刺激的反應(yīng)、免疫和感染類疾病、信號(hào)分子轉(zhuǎn)導(dǎo)和互作、細(xì)胞死亡和循環(huán)、繁殖。同時(shí)還統(tǒng)計(jì)到一些結(jié)構(gòu)和功能相似的家族蛋白，如表皮蛋白、低分子30K蛋白、核糖體蛋白、氧化或還原蛋白和熱應(yīng)激蛋白。注釋的代謝相關(guān)蛋白有46個(gè)，占參與分析的差異表達(dá)蛋白總數(shù)(111個(gè))的41.44%，包括已知的糖、脂和能量代謝蛋白：蘋果酸脫氫酶1(MDH1)、ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G超家族成員(ABCG)、酸性脂肪酶1(PGLIP1)、天門冬酰胺合成酶活性蛋白(ASNS)等。注釋的發(fā)育相關(guān)蛋白有23個(gè)，占參與分析的差異表達(dá)蛋白總數(shù)的20.72%，包括表皮、肌肉、神經(jīng)、壽命等組織發(fā)育相關(guān)蛋白：CPR4、CPR5、EDG91、CPR68、肌鈣蛋白T(TNNT)、肌侵蛋白(MTPN)、肌球蛋白-2必需輕鏈(MLC-C)、腦星形細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(MANF)、神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)發(fā)育下調(diào)蛋白8(NEDD8)、GLAZ/NLAZ[24]等。注釋的刺激響應(yīng)相關(guān)蛋白有23個(gè)，占參與分析的差異表達(dá)蛋白總數(shù)的20.72%，包括應(yīng)激和刺激感受蛋白：熱應(yīng)激相關(guān)的熱應(yīng)激蛋白20.8(HSP20.8)和熱應(yīng)激蛋白20.4(HSP20.4)、氧化應(yīng)激相關(guān)的γ-干擾素誘導(dǎo)溶酶體硫醇還原酶2(GILT2)和銅伴侶抗氧化劑1(ATOX1)、化學(xué)感受蛋白7(CSP7)等。注釋的免疫、感染相關(guān)蛋白有12個(gè)，占參與分析的差異表達(dá)蛋白總數(shù)的10.81%，主要包括天然免疫相關(guān)蛋白和抗菌肽：蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(ERP57)、鈣網(wǎng)蛋白(CALR)、GILT2、巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)、免疫誘導(dǎo)蛋白(B6TOX)、抗菌肽(ATTA)等。

圖6 家蠶脂肪體差異表達(dá)蛋白功能注釋

2.6 家蠶脂肪體差異表達(dá)蛋白的互作關(guān)系

111個(gè)差異表達(dá)蛋白通過(guò)STINGDE的多序列搜索(multiple sequences search)獲得49個(gè)蛋白，組成78對(duì)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)的PPI富集P值為7.61×10-10。將互作信息文件導(dǎo)入到Cytoscape中構(gòu)建可視網(wǎng)絡(luò)圖和計(jì)算各節(jié)點(diǎn)(網(wǎng)絡(luò)中各個(gè)蛋白)特征，結(jié)果如圖7所示。通過(guò)MCODE插件的k核解析設(shè)定閾值為4獲取2個(gè)子網(wǎng)絡(luò)：7個(gè)節(jié)點(diǎn)[核糖體蛋白S17(RPS17)、核糖體蛋白L23(RPL23)、核糖體蛋白L4(RPL4)、核糖體蛋白L24(RPL24)、核糖體蛋白S28(RPS28)、信號(hào)識(shí)別顆粒蛋白19(SRP19)、NEDD8]的21對(duì)互作關(guān)系；4個(gè)節(jié)點(diǎn)[網(wǎng)格蛋白輕鏈(CLC)、促進(jìn)海藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TRET1)、脂蛋白受體1(LPR1)和脂蛋白受體2(LPR2)]的6對(duì)互作關(guān)系。通過(guò)CentiScape插件3個(gè)統(tǒng)計(jì)量——點(diǎn)度中心性(degree centrality)、接近中心性(closeness centrality)和中介中心性(betweenness centrality)對(duì)各節(jié)點(diǎn)中心度進(jìn)行分析，獲得12個(gè)高中心度的關(guān)鍵蛋白——脂肪酸綁定蛋白(FABP)、ERP57、鈣網(wǎng)蛋白(CALR)、10 kDa熱應(yīng)激蛋白(HSP10)、ATP合酶亞基O(ATPsynO)、RPS17、RPL23、RPL4、RPL24、NEDD8、CLC、紫色酸性磷酸酶(PAP)。子網(wǎng)絡(luò)分析和網(wǎng)絡(luò)中心度分析均顯示RPS17、RPL23、RPL4、RPL24和NEDD8處于蛋白網(wǎng)絡(luò)中心，與其他蛋白互作關(guān)系多。

MLC-C：肌球蛋白-2必需輕鏈 myosin Ⅱ essential light chain；TSP29Fb：四次穿膜蛋白29Fb tetraspanin 29Fb；ASNS：天冬酰胺合成酶 asparagine synthetase；CCDC124：含有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白124 coiled-coil domain containing 124；SURF4：過(guò)量位點(diǎn)蛋白4 surfeit locus protein 4 homolog；ALDH：醛脫氫酶 aldehyde dehydrogenase；ERP57：蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶 protein disulfide-isomerase；FABP：脂肪酸綁定蛋白 fatty acid binding protein；LSD1/2：脂質(zhì)儲(chǔ)存液滴表面結(jié)合蛋白1/2 lipid storage droplets surface-binding protein 1/2；PGLIP1：酸性脂肪酶1 acid lipase 1；ACBP2：乙酰輔酶A結(jié)合蛋白2 acyl-CoA binding protein 2；ATPsyndelta：ATP合酶delta亞基 ATP synthase delta subunit；ATPsynO：ATP合酶亞基O ATP synthase subunit O；MDH1：蘋果酸脫氫酶1 malate dehydrogenase 1；MANF：中腦星形細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor；FKBP13：肽基脯氨酰異構(gòu)酶 peptidylprolyl isomerase；RPS17：核糖體蛋白S17 ribosomal protein S17；HSP10：10 kDa熱應(yīng)激蛋白 10 kDa heat shock protein；CALR：鈣網(wǎng)蛋白 calreticulin；MCFD2：多重凝血因子缺乏蛋白2 multiple coagulation factor deficiency protein 2；METAP1：甲硫氨酸胺基肽酶1 methionine aminopeptidase 1；RPL23：核糖體蛋白L23 ribosomal protein L23；RPL4：核糖體蛋白L4 ribosomal protein L4；RPL24：核糖體蛋白L24 ribosomal protein L24；RPS28：核糖體蛋白S28 ribosomal protein S28；SRP19：信號(hào)識(shí)別顆粒蛋白19 signal recognition particle protein 19；MTPN：肌侵蛋白 myotrophin；NEDD8：神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)發(fā)育下調(diào)蛋白8 neural precursor cell-expressed developmentally down-regulated protein 8；NLP：核質(zhì)蛋白類似蛋白 nucleoplasmin-like protein；dUTPase：脫氧尿苷三磷酸酶 deoxyuridine triphosphatase； apyrase isoform X1：三磷酸腺苷同型X1；PAP：紫色酸性磷酸酶 purple acid phosphatase；MIOX：肌醇加氧酶 inositol oxygenase；BJSP-2：基礎(chǔ)幼年激素抑制蛋白2 basic juvenile hormone-suppressible protein 2；TRET1：促進(jìn)海藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1 facilitated trehalose transporter 1；CLC：網(wǎng)格蛋白輕鏈 calreticulin；LPR1/2：脂蛋白受體1/2 lipophorin receptor 1/2；MSBP：膜類固醇綁定蛋白 membrane steroid binding protein；GLB1：β-半乳糖苷酶1 beta-galactosidase 1；GLAZ/NLAZ：載脂蛋白D同源蛋白Glial Lazarillo/Neural Lazarillo apolipoprotein D homolog protein Glial Lazarillo/Neural Lazarillo；CPR68：假定表皮蛋白68 putative cuticle protein 68；MP20：肌肉蛋白20 muscle protein 20；TNNT：肌鈣蛋白T troponin T；HSP20.8：熱應(yīng)激蛋白20.8 heat shock protein 20.8；SPARC：分泌蛋白、酸性、富含半胱氨酸 secreted protein, acidic, cysteine-rich；ApoLp-Ⅲ：載脂蛋白III apolipophorin Ⅲ。

3 討 論

3.1 老、嫩桑葉物質(zhì)含量差異與家蠶體重增長(zhǎng)的聯(lián)系

為了明確食入組分變化和家蠶體重增加的聯(lián)系，我們測(cè)定了老、嫩桑葉的主要營(yíng)養(yǎng)成分和活性物質(zhì)含量。在營(yíng)養(yǎng)成分上，嫩桑葉中粗脂肪、粗蛋白質(zhì)含量高于老桑葉，尤其是粗蛋白質(zhì)。李瑞等[18]采用秋季不同成熟度葉片飼喂5齡蠶，檢測(cè)到嫩桑葉粗蛋白質(zhì)含量高于老桑葉，盛食期蠶體重與飼喂桑葉的成熟度呈顯著負(fù)相關(guān)。Alebiosu等[10]用不同成熟度(嫩、成熟、老、混合)桑葉飼喂2個(gè)品種家蠶，分析確定嫩桑葉的粗蛋白質(zhì)含量顯著高于其他成熟度葉片，粗蛋白質(zhì)含量與幼蟲體重顯著正相關(guān)。這些研究結(jié)果與我們測(cè)定的物質(zhì)含量和家蠶體重變化趨勢(shì)一致。此外，我們測(cè)定出老桑葉中可溶性糖的含量顯著高于嫩桑葉，但還原性糖含量則相反，與呂順霖等[25]發(fā)現(xiàn)單糖在嫩桑葉中含量高于老桑葉結(jié)果一致?？扇苄钥偺前▎翁恰㈦p糖、寡聚糖、部分多糖，除蔗糖外，水溶性單糖和雙糖都有還原性，為可溶性還原糖。單糖和雙糖更易于5齡家蠶吸收，吸收效率在92%～94%，并且單糖>雙糖[25]，可為細(xì)胞生長(zhǎng)快速供能。結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果與相關(guān)研究報(bào)道表明，桑葉成熟度顯著影響其粗蛋白質(zhì)和低分子糖類含量，是家蠶體重增長(zhǎng)的原因之一。另外，給家蠶添飼適量的藥用植物提取物或特定黃酮、多酚物質(zhì)會(huì)提高家蠶的體重和壽命[26-29]，嫩桑葉本身黃酮、多酚、1-DNJ等活性物質(zhì)的含量高也是家蠶體重增加的重要因素。因此，秋季嫩桑葉的物質(zhì)含量特征促進(jìn)壯蠶期家蠶增重。

3.2 攝食2種成熟度桑葉的家蠶脂肪體差異表達(dá)蛋白功能聚類

綜合以往的飼養(yǎng)研究來(lái)看，大蠶期建議飼喂適熟桑葉(第6～7葉位葉片或生長(zhǎng)期為30～35 d的葉片)，而嫩桑葉或老桑葉飼喂蠶在發(fā)育速度、抗逆性、存活率、繭量、繭重量、繭絲率、產(chǎn)卵量和良卵率等部分指標(biāo)弱于適熟桑葉的飼喂效果[10,18-19,30]。相對(duì)于攝食適熟桑葉的蠶，一般攝食嫩桑葉的蠶體重和蠶繭生產(chǎn)性能高，而健康程度和存活率低，原因?yàn)椋耗凵Ｈ~相對(duì)蛋白質(zhì)含量高而糖含量低使蠶體氨累積而中毒，嫩桑葉含水多干物質(zhì)少使得蠶攝食營(yíng)養(yǎng)不足[18,31]。相對(duì)于攝食適熟桑葉的蠶，攝食老桑葉的蠶則發(fā)育、抗逆性低，產(chǎn)卵量和良卵質(zhì)量高，蠶繭生產(chǎn)性能低，原因?yàn)椋豪仙Ｈ~含水少而粗纖維含量高導(dǎo)致蠶體消化利用率低，總糖含量高而蛋白質(zhì)含量低導(dǎo)致蠶體糖供給充足而蛋白質(zhì)供給短缺[16]。因此，桑葉的成熟度與其物質(zhì)含量差異密切相關(guān)，從而影響家蠶發(fā)育、抗病、繭質(zhì)和繁殖等多方面性能。

在本研究中，食入秋季嫩桑葉的家蠶脂肪體相對(duì)于攝入老桑葉的蠶：1)細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)蛋白死亡相關(guān)蛋白1(DAP1)[32]、硫磺內(nèi)酯(ENDOS)[33]、NEDD8[34]、含有卷曲螺旋(coiled-coil)結(jié)構(gòu)域蛋白124(CCDC124)[35]、MIF[36]下調(diào)，而細(xì)胞增殖促進(jìn)蛋白ASNS[37]、富含天冬氨酸的TNF同源物(TNFSF13)[38]上調(diào)，由此可見，攝入適宜營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)后蠶體通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和促進(jìn)細(xì)胞增殖增加細(xì)胞體積和數(shù)量導(dǎo)致體重增長(zhǎng)；2)營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)存蛋白TRET1、低分子30K蛋白、載脂蛋白、貯存蛋白1(SP1)、芳基蛋白質(zhì)亞基β、堿性保幼激素抑制蛋白-2(BJSP-2)均上調(diào)[39-41]，家蠶蛹化后不再進(jìn)食，其所需物質(zhì)能量均來(lái)源于幼蟲，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的增加儲(chǔ)備會(huì)影響家蠶的產(chǎn)絲和產(chǎn)卵成績(jī)；3)氧化應(yīng)激蛋白肌醇加氧酶(MIOX)[42]下調(diào)，抗氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白ERP57[43]、醛脫氫酶(ALDH)[44]、ATOX1[45]下調(diào)，抗氧化應(yīng)激保護(hù)性蛋白HSP20.4、HSP20.8[46]、GLAZ/NLAZ[47]、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G家族成員(ABCG)[48]上調(diào)，動(dòng)物體的生命活動(dòng)都涉及到物質(zhì)和能量利用，嫩葉組家蠶氧化應(yīng)激水平低于老葉組，免疫水平也是如此，說(shuō)明機(jī)體應(yīng)激和免疫消耗降低，可以將更多物質(zhì)和能量用于生長(zhǎng)發(fā)育。綜上所述，家蠶對(duì)短期(3 d)食入的不同成熟度的桑樹葉片在脂肪體內(nèi)會(huì)做出復(fù)雜和綜合性反應(yīng)，可發(fā)掘出一批與家蠶體與攝入桑葉物質(zhì)成分變化聯(lián)系的候選蛋白，可為發(fā)掘有利于家蠶生長(zhǎng)、經(jīng)濟(jì)性狀改善的物質(zhì)和分子標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。

3.3 家蠶體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變動(dòng)的關(guān)鍵響應(yīng)蛋白挖掘

通過(guò)蛋白質(zhì)互作中的子網(wǎng)絡(luò)分析和網(wǎng)絡(luò)中心度分析，顯示NEDD8和4個(gè)核糖體蛋白R(shí)PS17、RPL23、RPL4、RPL24與其他蛋白的聯(lián)系度高，說(shuō)明它們處在蠶體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變化響應(yīng)上的核心位置。

核糖體蛋白組成核糖體，在細(xì)胞內(nèi)與RNA結(jié)合行使蛋白質(zhì)翻譯合成功能，此外，核糖體蛋白展示出多樣的核糖體外功能[49]。本研究共發(fā)現(xiàn)11個(gè)核糖體蛋白——RPS17、RPS18、RPS21、RPS28、RPS30、RPL4、RPL7Ae、RPL6、RPL23、RPL24、RPL34在嫩葉組和老葉組間存在顯著差異，除了RPS28、RPS30、RPL7Ae在嫩葉組下調(diào)外，其余在嫩葉組均上調(diào)。核糖體蛋白-MDM2-P53通路在感應(yīng)細(xì)胞應(yīng)激、整合營(yíng)養(yǎng)壓力方面起關(guān)鍵作用[50-51]。攝入營(yíng)養(yǎng)的質(zhì)量改變核糖體生物發(fā)生，引起核糖體蛋白作為營(yíng)養(yǎng)變動(dòng)的二級(jí)信使，通過(guò)與小鼠雙微粒體2(MDM2)結(jié)合使細(xì)胞發(fā)生物質(zhì)和能量代謝的適應(yīng)性變動(dòng)[52]。已發(fā)現(xiàn)14個(gè)核糖體蛋白可以綁定到MDM2酸域(central acidic domain，CAD)，負(fù)向調(diào)控MDM2對(duì)P53蛋白泛素化，起到活化或穩(wěn)定P53蛋白的作用[53]。真核生物存在80種基本核糖體蛋白，不斷有新的核糖體蛋白與MDM2-P53互作被證實(shí)，如RPL4[54]、RPL6[55]和RPL34[56]。P53是總新陳代謝分子網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點(diǎn)[57-58]，可以在非靜態(tài)或低脅迫條件下改變細(xì)胞代謝程序[59]，在本研究中，飼喂不同成熟度的桑葉也是一種溫和的、持續(xù)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)差異刺激，PRL23、RPL4、RPL6、RPL34的蛋白量變化與組間處理的聯(lián)系，說(shuō)明它們可能通過(guò)核糖體蛋白-MDM2-P53通路發(fā)揮代謝調(diào)控作用。非單一的核糖體蛋白變動(dòng)可能是由于不同的刺激誘導(dǎo)特定核糖體蛋白與MDM2結(jié)合，核糖體蛋白需要形成多聚復(fù)合物才能有效調(diào)節(jié)MDM2，核糖體蛋白之間存在互作等原因[53]。

NEDD8是類泛素蛋白的一種，通過(guò)類泛素化調(diào)控靶定基因發(fā)揮生物學(xué)作用。在本研究中，NEDD8在攝取嫩葉組下調(diào)。NEDD8和泛素蛋白參與脂肪細(xì)胞分化和脂肪代謝[34,60]。Park等[63]發(fā)現(xiàn)分化中的3T3-L1脂肪細(xì)胞，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)(機(jī)體物質(zhì)能量代謝的重要調(diào)控因子)[61-62]的含量正向依賴于NEDD8的表達(dá)量，NEDD8類泛素化通過(guò)與泛素化競(jìng)爭(zhēng)抑制PPARγ2降解，從而調(diào)控PPARγ2靶定基因的轉(zhuǎn)錄。于潔[64]在2017年克隆到家蠶NEDD8基因，在家蠶BmN細(xì)胞中篩選和鑒定到28個(gè)NEDD8修飾底物蛋白，其中24%的蛋白富集到代謝功能，5個(gè)蛋白注釋到氨基酸代謝通路，因此，家蠶NEDD8蛋白量變化可從調(diào)節(jié)氨基酸和脂肪合成或代謝蛋白質(zhì)的功能和效應(yīng)方面調(diào)控蠶體物質(zhì)代謝。

本研究和相關(guān)文獻(xiàn)初步支持核糖體蛋白-MDM2-P53通路蛋白和類泛素蛋白NEDD8在蠶體對(duì)持續(xù)的、溫和的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)質(zhì)量差異響應(yīng)上敏感，是研究營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變動(dòng)和動(dòng)物機(jī)體變化機(jī)制的切入點(diǎn)，具體攝入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量差異和特異蛋白的確定聯(lián)系、響應(yīng)機(jī)制和效應(yīng)通路有待于進(jìn)一步發(fā)掘和驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)分析秋季老、嫩2種成熟度的桑葉基本物質(zhì)含量差異和短期(3 d)采食它們的5齡家蠶脂肪體總體蛋白質(zhì)相對(duì)變化水平，揭示了家蠶體重增長(zhǎng)與桑葉內(nèi)物質(zhì)組成的聯(lián)系和作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)：秋季嫩桑葉中粗蛋白質(zhì)、低分子糖、總黃酮、總多酚、1-DNJ含量高，促進(jìn)蠶體增重；攝食2種成熟度桑葉的家蠶脂肪體細(xì)胞共鑒定出173個(gè)差異表達(dá)蛋白，功能涉及代謝、發(fā)育、健康、抗性、生產(chǎn)和繁殖等生理作用；差異表達(dá)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析篩選出NEDD8和核糖體蛋白是蠶體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變動(dòng)響應(yīng)的關(guān)鍵候選蛋白。這些發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步探索營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)配比對(duì)家蠶生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)節(jié)和控制的分子機(jī)制提供了數(shù)據(jù)。