孫 磊 劉艷華 王志剛 陳寶江,

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，保定071000；2.河北省牛羊胚胎技術(shù)創(chuàng)新中心，保定071000)

近年來，隨著抗生素的禁用，越來越多的植物源性添加劑被應(yīng)用到家兔飼糧中，發(fā)揮著抗菌、抗氧化以及改善生長性能和繁殖性能的作用[1-3]。β-胡蘿卜素作為一種天然的類胡蘿卜素，存在于多種植物中，不僅被廣泛應(yīng)用于人類食品以及化妝品中，也在動物飼糧中廣泛應(yīng)用[4]。β-胡蘿卜素具有多個雙鍵，在光、熱、氧氣及活潑性較強(qiáng)的自由基離子存在的條件下易氧化，可有效預(yù)防DNA和脂蛋白的氧化損傷，維持細(xì)胞功能，延緩機(jī)體衰老。研究表明，1分子β-胡蘿卜素可抑制1 000分子的活性氧[5]。此外，β-胡蘿卜素還與動物妊娠時合成和分泌孕酮(PROG)的過程有關(guān)。缺乏β-胡蘿卜素而導(dǎo)致的黃體細(xì)胞PROG分泌減少的現(xiàn)象能通過補(bǔ)充β-胡蘿卜素而得到改善，但增加維生素A的補(bǔ)充量則不能起到改善作用[6]。β-胡蘿卜素作為黃體的組成成分，可以進(jìn)入卵泡液轉(zhuǎn)化為維生素A，調(diào)節(jié)生殖活動，促進(jìn)黃體生成生殖激素，從而調(diào)節(jié)動物的繁殖能力[7]。資料顯示，國內(nèi)外關(guān)于β-胡蘿卜素應(yīng)用的報道主要集中于豬和牛，如梁寧等[8]和馮俊[9]研究發(fā)現(xiàn)，β-胡蘿卜素能夠顯著提高母豬繁殖性能，并且在每個繁殖階段起到了不同的作用。王波[7]和孫勝祥[10]研究表明，飼糧中添加β-胡蘿卜素能夠提高奶牛生產(chǎn)性能，降低繁殖疾病的發(fā)病率。β-胡蘿卜素在家兔生產(chǎn)中應(yīng)用的報道極少，賈福昌等[11]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加40 mg/kg β-胡蘿卜素可以提高6周齡新西蘭兔增長速度，降低料重比。因此，本試驗(yàn)旨在研究飼糧中添加不同水平β-胡蘿卜素對青年母兔生長性能、抗氧化能力、生殖激素指標(biāo)及卵泡發(fā)育的影響，為β-胡蘿卜素在家兔生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計和飼養(yǎng)管理

動物試驗(yàn)于2020年12月至2021年1月于保定市唐縣華益兔業(yè)養(yǎng)殖基地進(jìn)行。選取55～60日齡、體重[(1.679±0.114) kg]相近、健康狀態(tài)良好的雌性伊拉肉兔160只，隨機(jī)分為4組，每組20個重復(fù)，每個重復(fù)2只。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組在基礎(chǔ)飼糧中分別添加15(Ⅰ組)、30(Ⅱ組)、45 mg/kg(Ⅲ組)β-胡蘿卜素。預(yù)試期7 d，正試期28 d。整個試驗(yàn)期肉兔自由采食和飲水，以重復(fù)為單位單籠飼養(yǎng)，保證光照和通風(fēng)。

1.2 試驗(yàn)飼糧

以玉米、小麥麩、豆粕為主要原料，參照谷子林等[12]推薦的營養(yǎng)需要配制基礎(chǔ)飼糧，其組成及營養(yǎng)水平見表1。各組飼糧均制成直徑×長度為4 mm×10 mm的顆粒料。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 生長性能

試驗(yàn)期開始和結(jié)束時，以重復(fù)為單位稱量各組試驗(yàn)兔的體重，獲得初始體重(IBW)和終末體重(FBW)，計算平均日增重(ADG)，計算公式如下：

ADG=(FBW-IBW)/試驗(yàn)天數(shù)。

1.3.2 樣品采集

分別于試驗(yàn)第14和28天，每組隨機(jī)選取6只試驗(yàn)兔采集血液，得到血清樣品，-20 ℃保存，用于測定血清抗氧化和生殖激素指標(biāo)。試驗(yàn)第28天，每組隨機(jī)選取6只試驗(yàn)兔進(jìn)行屠宰，取右側(cè)卵巢樣品，-80 ℃保存，用于測定卵巢抗氧化和生殖激素指標(biāo)。取左側(cè)卵巢樣品，經(jīng)生理鹽水沖洗干凈后，放入10%多聚甲醛溶液中，用于測定卵巢組織形態(tài)。

1.3.3 抗氧化指標(biāo)

利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法測定血清和組織勻漿后的卵巢樣品中的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量及總抗氧化能力(T-AOC)，ELISA試劑盒購于南京建成生物工程研究所，參照內(nèi)置說明書進(jìn)行檢測。

1.3.4 激素指標(biāo)

利用ELISA法測定血清和組織勻漿后的卵巢樣品中的促黃體激素(LH)、促卵泡素(FSH)、雌二醇(E2)、PROG含量，ELISA試劑盒購于南京建成生物工程研究所，參照內(nèi)置說明書進(jìn)行檢測。

1.3.5 卵巢組織形態(tài)

固定卵巢組織，經(jīng)脫水、修剪、包埋、切片、染色、封片后采用Pannoramic 250數(shù)字切片掃描儀進(jìn)行圖像采集，采用Panthera數(shù)碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng)對切片進(jìn)行圖像采集，先于40倍下觀察全部組織，觀察大體病變，然后采集40倍和200倍圖片，記錄并計算原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、成熟卵泡、閉鎖卵泡和黃體比例。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Excel 2010進(jìn)行整理和初步計算，再利用SPSS 25.0一般線性模型(GLM)進(jìn)行多因素方差分析，統(tǒng)計模型中包括時間、添加水平和時間×添加水平。單個因素間的比較則利用SPSS 25.0進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，Duncan氏法進(jìn)行多重比較。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 β-胡蘿卜素對青年母兔生長性能的影響

由表2可知，飼糧中添加β-胡蘿卜素對青年母兔FBW和ADG均無顯著影響(P>0.05)。

表2 β-胡蘿卜素對青年母兔生長性能的影響

2.2 β-蘿卜素對青年母兔抗氧化功能的影響

2.2.1 β-蘿卜素對青年母兔血清抗氧化指標(biāo)的影響

由表3可知，試驗(yàn)第14天時，與對照組相比，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組血清GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)，Ⅱ、Ⅲ組血清SOD活性顯著升高(P<0.05)。試驗(yàn)第28天時，與對照組相比，Ⅰ組血清GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)，Ⅱ、Ⅲ組血清SOD活性顯著降低(P<0.05)。添加水平對血清GSH-Px活性有顯著影響(P<0.05)，添加水平為15和30 mg/kg血清GSH-Px活性顯著高于添加水平為0和45 mg/kg(P<0.05)。時間對血清SOD活性有顯著影響(P<0.05)，第28天血清SOD活性顯著高于第14天(P<0.05)。添加水平和時間的互作效應(yīng)對血清SOD、GSH-Px活性以及MDA含量有顯著影響(P<0.05)。

表3 β-胡蘿卜素對青年母兔血清抗氧化指標(biāo)的影響

2.2.2 β-蘿卜素對青年母兔卵巢抗氧化指標(biāo)的影響

由表4可知，飼糧中添加β-胡蘿卜素對青年母兔卵巢SOD、GSH-Px活性和T-AOC及MDA含量均無顯著影響(P>0.05)。

表4 β-胡蘿卜素對青年母兔卵巢抗氧化指標(biāo)的影響

2.3 β-胡蘿卜素對青年母兔生殖激素指標(biāo)的影響

2.3.1 β-胡蘿卜素對青年母兔血清生殖激素指標(biāo)的影響

由表5可知，試驗(yàn)第14天時，與對照組相比，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組血清LH含量顯著升高(P<0.05)，Ⅰ、Ⅱ組血清FSH含量顯著提高(P<0.05)，Ⅰ、Ⅲ組血清E2和PROG含量顯著提高(P<0.05)。試驗(yàn)第28天時，與對照組相比，Ⅰ組血清E2含量顯著提高(P<0.05)。添加水平對血清LH、FSH和E2含量有顯著影響(P<0.05)。添加水平為15 mg/kg血清LH含量顯著高于添加水平為0、30、45 mg/kg(P<0.05)，添加水平為15 mg/kg血清FSH含量顯著高于添加水平為0、45 mg/kg(P<0.05)，添加水平為15、45 mg/kg血清E2含量顯著高于添加水平為0、30 mg/kg(P<0.05)。時間對血清FSH、E2和PROG含量有顯著影響(P<0.05)。第28天血清FSH、E2和PROG含量顯著高于第14天(P<0.05)。添加水平和時間的互作效應(yīng)對血清LH、E2和PROG含量有顯著影響(P<0.05)。

表5 β-胡蘿卜素對青年母兔血清中生殖激素指標(biāo)的影響

2.3.2 β-胡蘿卜素對青年母兔卵巢生殖激素指標(biāo)的影響

由表6可知，飼糧中添加β-胡蘿卜素對青年母兔卵巢LH、FSH、E2和PROG含量均無顯著影響(P>0.05)。

表6 β-胡蘿卜素對青年母兔卵巢生殖激素指標(biāo)的影響

2.4 β-胡蘿卜素對青年母兔卵泡發(fā)育的影響

由圖1可知，與對照組相比，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組卵巢中原始卵泡比例顯著降低(P<0.05)，Ⅱ、Ⅲ組卵巢中初級卵泡比例顯著提高(P<0.05)，Ⅰ、Ⅲ組卵巢中次級卵泡和成熟卵泡比例顯著提高(P<0.05)，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組卵巢中黃體比例顯著提高(P<0.05)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 討 論

3.1 β-胡蘿卜素對青年母兔生長性能的影響

β-胡蘿卜素是廣泛存在于植物中的一種天然類胡蘿卜素，是維生素A的前體物質(zhì)[13]。有研究發(fā)現(xiàn)β-胡蘿卜素應(yīng)用于動物飼糧中可以對其生長起到積極作用[14-15]，但也有研究表明其促生長作用較小。楊旭[16]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加β-胡蘿卜素育成牛對ADG無顯著影響。畢宇霖等[17]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加不同水平β-胡蘿卜素對肉牛FBW、ADG和干物質(zhì)采食量均無顯著影響。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧中添加β-胡蘿卜素對青年母兔FBW、ADG均無顯著影響，這可能是由于本試驗(yàn)所添加的β-胡蘿卜素在青年母兔體內(nèi)主要發(fā)揮了維生素A前體作用，對生長的直接促進(jìn)作用不明顯。

3.2 β-胡蘿卜素對青年母兔抗氧化能力的影響

抗氧化酶類是動物抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分，一般認(rèn)為能反映機(jī)體抗氧化能力的指標(biāo)有SOD、GSH-Px活性和MDA含量以及T-AOC[18-19]。β-胡蘿卜素是有效的抗氧化劑，可以通過提高機(jī)體抗氧化酶活性，減少體內(nèi)的自由基，提高機(jī)體抗氧化能力[20]。孫志英等[21]研究發(fā)現(xiàn)，給小鼠灌喂10 mg/kg β-胡蘿卜素28 d后，其血清和肝臟GSH-Px活性顯著增加；韓磊等[22]研究發(fā)現(xiàn)，給小鼠補(bǔ)充4.28 mg/kg β-胡蘿卜素可以提高其血清GSH-Px活性，降低血清MDA含量；劉明美等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在山羊飼糧中添加82.5 mg/d β-胡蘿卜素，可以提高山羊血清GSH-Px活性和T-AOC，降低血清MDA含量。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧中添加15和30 mg/kg β-胡蘿卜素均顯著提高了青年母兔血清GSH-Px活性量，與上述研究結(jié)果一致，說明飼糧中添加β-胡蘿卜素可以提高肉兔抗氧化能力。這可能是由于β-胡蘿卜素通過觸發(fā)核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)“開關(guān)”，激活Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白(Keap1)-Nrf2-抗氧化反應(yīng)元件(ARE)通路，增加抗氧化酶基因的表達(dá)量[24]。而且，Rocha等[25]試驗(yàn)證明，β-胡蘿卜素可以改變谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶等抗氧化酶的活性。

3.3 β-胡蘿卜素對青年母兔生殖激素指標(biāo)的影響

動物的生殖活動受到多種生殖激素共同調(diào)控，一般認(rèn)為，動物體內(nèi)LH、FSH、E2和PROG含量可以反映其生殖激素的水平，進(jìn)而反映其生殖力的高低。FSH和LH分泌主要受促性腺激素釋放激素(GnRH)調(diào)控，F(xiàn)SH和LH可以促進(jìn)卵巢分泌E2并排卵。E2則可以刺激垂體來調(diào)控FSH與LH的分泌。動物排卵后，黃體分泌大量PROG，PROG與E2共同作用會促使母畜發(fā)情，大量的PROG則會抑制發(fā)情[26-27]。β-胡蘿卜素一方面可以進(jìn)入卵泡內(nèi)，直接調(diào)控激素分泌；另一方面β-胡蘿卜素良好的抗氧化作用可以保護(hù)卵巢顆粒細(xì)胞的完整性，從而有助于激素分泌[28]。Ulziisaikhan[29]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加β-胡蘿卜素可以提高奶牛血清LH、PROG、FSH和E2含量；李超[30]研究發(fā)現(xiàn)，飼喂不同水平β-胡蘿卜素對奶牛血清E2和LH含量影響顯著；劉銳鋼等[31]在妊娠后期母豬飼糧中添加微囊化β-胡蘿卜素，發(fā)現(xiàn)母豬血清E2和PROG含量顯著提高。本試驗(yàn)研究證實(shí)，飼糧中添加β-胡蘿卜素提高了青年母兔血清LH、FSH以及E2含量，說明β-胡蘿卜素可以促進(jìn)肉兔生殖激素的分泌，同時添加水平和時間具有互作效應(yīng)。這可能是由于β-胡蘿卜素可以隨血液進(jìn)入卵泡內(nèi)，發(fā)揮了維生素A的作用，提高了黃體內(nèi)類固醇水平，改善子宮環(huán)境，從而促進(jìn)了激素分泌[32]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加β-胡蘿卜素對青年母兔卵巢生殖激素含量沒有顯著影響，但影響了血清生殖激素含量，可能是受GnRH脈沖式分泌的影響[26-27]，但具體機(jī)理還有待探究。

3.4 β-胡蘿卜素對青年母兔卵泡發(fā)育的影響

β-胡蘿卜素可以通過調(diào)節(jié)激素分泌來促進(jìn)卵泡發(fā)育。Kawashima等[33]研究發(fā)現(xiàn)，給干奶期荷斯坦奶牛補(bǔ)充β-胡蘿卜素可以提高其優(yōu)勢卵泡比例。李梓妍[34]研究發(fā)現(xiàn)，奶牛飼糧中添加β-胡蘿卜素能夠提高發(fā)情表現(xiàn)，促進(jìn)卵泡發(fā)育及成熟，減少受配次數(shù)。Yu等[35]研究發(fā)現(xiàn)，利用β-胡蘿卜素作為抗氧化劑能夠提高卵母細(xì)胞質(zhì)量。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧中添加β-胡蘿卜素顯著降低了青年母兔卵巢中原始卵泡比例，提高了青年母兔卵巢中初級卵泡、次級卵泡、成熟卵泡和黃體比例，這說明飼糧中添加β-胡蘿卜素可以加快卵泡發(fā)育過程，促進(jìn)卵泡成熟。在卵泡發(fā)育過程，促性腺激素(FSH和LH)可以促進(jìn)卵泡發(fā)育，誘導(dǎo)卵泡排卵、黃體生成[36]。β-胡蘿卜素一方面作為抗氧化劑，保護(hù)卵泡細(xì)胞的完整性和活力；另一方面作為黃體固有成分，促進(jìn)生殖激素的分泌。因此，機(jī)體促性腺激素含量升高，卵泡發(fā)育得到促進(jìn)[37]。

4 結(jié) 論

① 飼糧中添加β-胡蘿卜素可以提高血清GSH-Px活性，從而改善青年母兔的抗氧化能力。

② 飼糧中添加β-胡蘿卜素可以通過促進(jìn)LH、FSH和E2分泌，促進(jìn)卵泡發(fā)育，進(jìn)而改善青年母兔的繁殖力。

③ 本試驗(yàn)條件下，青年母兔飼糧中β-胡蘿卜素適宜添加水平為30 mg/kg。