車明曉 姚春鳳 陸梓曄 遲淑艷,3,4* 譚北平,3,4

(1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料實(shí)驗(yàn)室，湛江 524088；2.廣東粵海飼料集團(tuán)股份有限公司，湛江524017；3.廣東省水產(chǎn)動(dòng)物精準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)與高效飼料工程技術(shù)研究中心，湛江524088；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南水產(chǎn)與畜禽飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湛江524088)

2020年我國(guó)淡水鱸魚的養(yǎng)殖產(chǎn)量已達(dá)到61.9萬(wàn)t，比2019年增長(zhǎng)29.66%[1]，其中有“淡水石斑魚”之稱的大口黑鱸(Micropterussalmoides)作為一種重要的經(jīng)濟(jì)魚類[2-3]，養(yǎng)殖產(chǎn)量逐年增長(zhǎng)，但是相較于大菱鲆(Scophthalmusmaxmius)[4]和烏鱧(Channaargus)[5]等其他肉食性魚類，大口黑鱸對(duì)血糖清除相對(duì)緩慢[6]，利用飼料中淀粉的能力更低[7]，若攝入過量碳水化合物會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)遲緩和肝糖原異常積累，造成肝臟損傷[8-12]。因此，飼料中淀粉的利用效率直接影響大口黑鱸生長(zhǎng)和養(yǎng)殖成本。

淀粉作為飼料中碳水化合物的主要存在形式，不但為機(jī)體提供能量，還在飼料中起著黏合和膨脹的作用，有助于改善飼料的物理品質(zhì)[13]。淀粉分為直鏈淀粉(AM)和支鏈淀粉(AP)，分子聚集狀態(tài)與結(jié)構(gòu)不同，性質(zhì)和功能也不同[14-15]。AM的分支很少，可以形成具有復(fù)雜晶體結(jié)構(gòu)的抗性淀粉，在動(dòng)物腸道內(nèi)會(huì)抵抗消化[16]，而AP分支多，其分子表面積更大，分子間氫鍵作用力更小[17]，這一特征使其更容易消化[18]。相較于AP，AM糊化溫度更高，穩(wěn)定性能更強(qiáng)，具有抗?jié)櫭浶?，但增稠性和黏合性較低[19]。通過控制飲食中的直鏈淀粉/支鏈淀粉(AM/AP),可改善豬、羊和雞等動(dòng)物生長(zhǎng)和健康狀況[20-22]。AM/AP是淀粉發(fā)揮功能特性的重要因素之一，不僅對(duì)水產(chǎn)膨化飼料的加工產(chǎn)生重要的影響[23]，還影響?zhàn)B殖動(dòng)物對(duì)飼料的消化[24]、蛋白質(zhì)和脂肪的代謝[25]以及能量的分配。因此，本試驗(yàn)通過設(shè)置飼料中不同的AM/AP，一方面評(píng)價(jià)不同AM/AP對(duì)飼料加工特性的影響，另一方面探索不同AM/AP對(duì)大口黑鱸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率和腸道消化酶活性的影響，旨在明確大口黑鱸飼料中淀粉的添加形式，更有效地推動(dòng)高效配合飼料替代鮮活餌料的進(jìn)度，有助于實(shí)現(xiàn)養(yǎng)殖和環(huán)境的可持續(xù)性發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

以魚粉、雞肉粉和酪蛋白為主要蛋白質(zhì)源，豆油和魚油為主要脂肪源，以蠟質(zhì)玉米淀粉(WCS，AM含量為0，AP含量為92.28%)和高直鏈玉米淀粉(HACS，AM含量為65.37%，AP含量為24.47%)來(lái)調(diào)整飼料中AM/AP，使其比值分別為0、0.22、0.56、1.18、2.62，配制5種等氮等脂等淀粉含量的試驗(yàn)飼料(其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1)，同時(shí)各組飼料添加0.1%三氧化二釔作為外源指示劑，用以評(píng)價(jià)大口黑鱸對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率。將原料粉碎過60目篩網(wǎng)，按照配方準(zhǔn)確稱取，采用逐級(jí)擴(kuò)大法將原料混合均勻，在V型混合機(jī)中混合12 min，然后加入魚油、豆油和水(25%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))，用攪拌機(jī)攪拌均勻后，使用干法膨化機(jī)制作沉性膨化顆粒飼料，模板孔徑為3 mm，飼料顆粒長(zhǎng)度為3 mm，制粒完成后在25 ℃空調(diào)房中自然晾干，晾至水分含量約為10%后裝入封口袋，存放于-20 ℃的冰箱中。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(飼喂基礎(chǔ))

續(xù)表1項(xiàng)目 Items組別 GroupsD1D2D3D4D5營(yíng)養(yǎng)水平 Nutrient levels水分 Moisture8.198.108.528.678.22粗蛋白質(zhì) CP50.2250.2450.1750.2950.31粗脂肪 EE10.6810.5110.2910.3210.52直鏈淀粉/支鏈淀粉 AM/AP0.000.220.561.182.62

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

購(gòu)買遺傳背景一致的大口黑鱸魚苗(英熙魚蝦苗場(chǎng)，高州，廣東)，在桶中暫養(yǎng)2周，暫養(yǎng)期間投喂商品飼料(粗蛋白質(zhì)48%，粗脂肪7%)。正式試驗(yàn)開始前，禁飼24 h，挑選健康、規(guī)格均勻的魚苗600尾[初始體重(2.15±0.04) g]，隨機(jī)分配到20個(gè)0.4 m3的玻璃纖維鋼化桶中，試驗(yàn)分為5組，每組4個(gè)重復(fù)，每桶30尾魚苗。每天08:00和16:00投喂至表觀飽食，投喂后用虹吸管清除桶底部的殘餌。養(yǎng)殖試驗(yàn)持續(xù)56 d。養(yǎng)殖試驗(yàn)在廣東湛江國(guó)聯(lián)飼料有限公司室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)進(jìn)行，水溫28～31 ℃，溶解氧含量>5 mg/L。

1.3 樣品收集

養(yǎng)殖試驗(yàn)到第8周結(jié)束，試驗(yàn)魚禁食24 h，記錄每桶魚的數(shù)量和總重量，用于計(jì)算增重率、特定生長(zhǎng)率和存活率；記錄每桶魚攝食飼料的重量，用于計(jì)算飼料系數(shù)。每個(gè)桶隨機(jī)取3尾魚，取腸道于凍存管中，用液氮速凍，后保存在-80 ℃冰箱中，用于測(cè)定腸道消化酶活性。樣品分析前于4 ℃冰箱內(nèi)解凍，在冰盤剪碎并迅速準(zhǔn)確稱取一定量組織，根據(jù)不同酶活性測(cè)定要求加入一定體積的勻漿介質(zhì)，在冰浴條件下機(jī)械勻漿，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定消化酶活性。養(yǎng)殖試驗(yàn)第5周至試驗(yàn)結(jié)束期間收集糞便，投喂飼料3 h后用鑷子收集有完整包膜的糞便，在濾紙上吸干水分放在50 mL離心管中，于-20 ℃冰箱中保存。

1.4 樣品測(cè)定

飼料和糞便樣品中水分含量采用105 ℃常壓烘箱干燥法測(cè)定(GZX-9146MBE干燥箱，上海)，粗蛋白質(zhì)含量采用杜馬斯燃燒法測(cè)定(Primacs SN-100杜馬斯定氮儀，荷蘭)，粗脂肪含量采用索氏抽提法測(cè)定(ANKOMXT15i自動(dòng)脂肪分析儀，美國(guó))。飼料和糞便中Y2O3含量委托上海微譜檢測(cè)技術(shù)有限公司檢測(cè)，使用ICP-OES檢測(cè)(Perkin Elmer Optima 8000，美國(guó))。

飼料硬度和淀粉糊化度委托中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所檢測(cè)。飼料硬度使用Perten硬度分析儀(TVT-6700，瑞典)測(cè)定；飼料淀粉糊化度參照熊易強(qiáng)[26]的方法測(cè)定；飼料溶失率參照《飼料質(zhì)量與安全檢測(cè)技術(shù)》[27]中的方法測(cè)定；飼料沉降速度參照中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所楊俊成等[28]的方法測(cè)定；飼料膨化度參照Glencross等[29]的方法測(cè)定。

腸道胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性采用試劑盒(南京建成生物工程研究所)測(cè)定。其中，胰蛋白酶活性單位定義：在pH 8.0，37 ℃條件下，每毫克蛋白中含有的胰蛋白酶每分鐘使吸光度變化0.003即為1個(gè)酶活力單位。淀粉酶活性單位定義：組織中每毫克蛋白在37 ℃與底物作用30 min，水解10 mg淀粉定義為1個(gè)酶活力單位。脂肪酶活性定義：37 ℃條件下，每克組織蛋白在本反應(yīng)體系中與底物反應(yīng)1 min，每消耗1 μmol底物為1個(gè)酶活力單位。腸道總蛋白酶活性采用試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技公司，上海)測(cè)定。總蛋白酶活性定義：37 ℃條件下，每分鐘內(nèi)催化1 μmol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量定為1個(gè)酶活力單位。

1.5 計(jì)算公式

增重率(WGR，%)=100×(末均重-
初均重)/初均重；
飼料系數(shù)(FCR)=均攝食量/(末均重-初均重)；
特定生長(zhǎng)率(SGR，%/d)=100×(ln末均重-
ln初均重)/飼喂天數(shù)；
干物質(zhì)表觀消化率(%)=100×(1-飼料中
Y2O3含量/糞便中Y2O3含量)；
營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率(%)=100×[1-(糞
便中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量/飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量)×
(飼料中Y2O3含量/糞便中Y2O3含量)]；
沉降速度(cm/s)=水面高度/顆粒從水面
降低到管底所用的時(shí)間。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Duncan氏法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)，顯著性水平為P<0.05，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Pearson Correlation(2-tailed)方法對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，顯著水平為P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 AM/AP對(duì)飼料加工特性的影響

由表2可知，D4組飼料硬度和膨化度顯著低于D1、D2組(P<0.05)，與D3和D5組沒有顯著差異(P>0.05)；D4和D5組淀粉糊化度顯著低于D1、D2和D3組(P<0.05)；各組間飼料溶失率差異不顯著(P>0.05)；D4和D5組飼料沉降速率顯著高于D1和D2組(P<0.05)。

表2 AM/AP對(duì)飼料加工特性的影響

由表3可知，飼料AM/AP與飼料硬度、膨化度、淀粉糊化度和沉降速率呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。

表3 AM/AP與飼料加工特性的相關(guān)性分析

表4 飼料硬度與淀粉糊化度和膨化度的相關(guān)性分析

由圖1看出，飼料膨化度在飼料AM/AP為1.81時(shí)達(dá)到最小值(y=2.418x2-8.751x+41.73，R2=0.998 2)，淀粉糊化度在飼料AM/AP為1.95時(shí)達(dá)到最小值(y=7.325x2-28.5x+58.76，R2=0.930 0)。

圖1 AM/AP和飼料膨化度和淀粉糊化度的相關(guān)性分析

2.2 AM/AP對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)性能的影響

由表5可知，大口黑鱸的增重率、特定生長(zhǎng)率隨AM/AP的升高呈上升趨勢(shì)，D4組顯著高于D1和D2組(P<0.05)，與D3組和D5組沒有顯著差異(P>0.05)。

表5 AM/AP對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)性能的影響

如圖2所示，經(jīng)二元回歸模型擬合分析后發(fā)現(xiàn)，特定生長(zhǎng)率隨著飼料中AM/AP的增加而上升，在AM/AP為1.83時(shí)達(dá)到最大值(y=-0.072 17x2+0.264 5x+3.303，R2=0.875 9)。飼料系數(shù)隨AM/AP的升高呈上升趨勢(shì)，D4組飼料系數(shù)顯著高于D1組(P<0.05)，顯著低于D5組(P<0.05)，和其余各組相比差異不顯著(P>0.05)。

圖2 AM/AP對(duì)大口黑鱸特定生長(zhǎng)率的影響

2.3 AM/AP對(duì)大口黑鱸飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

由表6可知，D4組干物質(zhì)表觀消化率顯著高于D1組(P<0.05)，和其余各組相比差異不顯著(P>0.05)；與D2、D3組相比，D4、D5組粗蛋白質(zhì)表觀消化率差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于D1組(P<0.05)。

表6 AM/AP對(duì)大口黑鱸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

由圖3可看出，粗蛋白質(zhì)表觀消化率在AM/AP為1.50時(shí)達(dá)到最大值(y=-1.879x2+5.644x+92.87，R2=0.683 7)；D4組粗脂肪表觀消化率與D3組差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于D5組(P<0.05)，顯著低于D1和D2組(P<0.05)；D4和D5組顯著低于其余3組(P<0.05)；淀粉表觀消化率在AM/AP為2.15時(shí)達(dá)到最小值(y=7.467x2-32.03x+91.41，R2=0.906 4)。

圖3 AM/AP對(duì)大口黑鱸粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和淀粉表觀消化率的影響

由表7可知，干物質(zhì)表觀消化率與飼料中AM/AP無(wú)顯著相關(guān)(P>0.05)，粗蛋白質(zhì)表觀消化率與飼料中AM/AP呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，粗脂肪表觀消化率與飼料中AM/AP呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，淀粉表觀消化率與飼料中AM/AP呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。

表7 AM/AP與大口黑鱸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的相關(guān)性分析

2.4 AM/AP對(duì)大口黑鱸腸道消化酶活性的影響

由表8可知，D4組腸道總蛋白酶和胰蛋白酶活性與D3和D5組差異不顯著(P>0.05)，顯著高于D1組(P<0.05)；D4和D5組腸道脂肪酶活性顯著低于D1和D2組(P<0.05)；與D2、D3和D5組相比，D4組腸道淀粉酶活性差異不顯著(P>0.05)，但顯著低于D1組(P<0.05)。

表8 AM/AP對(duì)大口黑鱸腸道消化酶活性的影響

由表9可知，腸道總蛋白酶和胰蛋白酶活性與飼料中AM/AP呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，腸道脂肪酶和淀粉酶活性與飼料中AM/AP呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。

表9 AM/AP與大口黑鱸腸道消化酶活性的相關(guān)性分析

3 討 論

3.1 AM/AP對(duì)飼料加工特性的影響

水產(chǎn)動(dòng)物和陸生動(dòng)物相比，對(duì)飼料成形工藝要求較高。在飼料的制造加工過程中，AM/AP是對(duì)飼料質(zhì)量產(chǎn)生影響的重要因素之一[29-30]。AP分子呈分支狀，分子間氫鍵在膨化的高溫作用下易斷裂，形成不易崩塌的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[31]，在膨化過程中能承受較強(qiáng)的壓力而結(jié)構(gòu)不被破壞，因而容易膨化，并且膨化度較大。玉米淀粉在被擠壓的過程中，AP部分會(huì)發(fā)生降解，而AM部分沒有發(fā)生顯著變化[32]。高直鏈玉米的膨化度低于普通玉米，膨化產(chǎn)品內(nèi)部氣室較小且密集[31]。AP含量較高的木薯淀粉參與形成的膨化顆粒飼料的膨化度顯著高于玉米淀粉和面粉組[33-34]。袁軍[35]發(fā)現(xiàn)，添加40%木薯淀粉組膨化度最高，而添加40%玉米淀粉組膨化度最低。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼料中AM/AP與膨化度呈極顯著負(fù)相關(guān)。AP在水產(chǎn)膨化飼料生產(chǎn)過程中起到的膨脹作用強(qiáng)于AM，因此，飼料中較高的AP含量會(huì)提高飼料的膨化度。

淀粉糊化程度會(huì)對(duì)產(chǎn)品最終質(zhì)量產(chǎn)生影響[36]，糊化后的淀粉具有冷黏性，使淀粉凝膠化，增大最終黏度[37-38]。AP與淀粉溶脹現(xiàn)象密切相關(guān)[39]，可以促進(jìn)淀粉的糊化，而AM會(huì)阻礙淀粉的糊化[40-41]，可能是AM分子間連接緊密不易斷裂，導(dǎo)致淀粉糊化度降低[42]，因此淀粉糊化度與飼料中AM/AP呈負(fù)相關(guān)。在本試驗(yàn)中，飼料硬度與膨化度和淀粉糊化度呈顯著正相關(guān)，與袁軍[35]關(guān)于玉米、木薯粉和面粉對(duì)膨化飼料硬度的研究結(jié)果不同，可能是飼料加工時(shí)溫度影響了AM糊化溫度，高直鏈玉米淀粉在115.3 ℃時(shí)開始糊化，完全糊化時(shí)溫度為130.7 ℃[43-44]，溫度不足會(huì)導(dǎo)致AM糊化度較低，凝膠性弱，而AP較AM易糊化[45]，黏結(jié)性強(qiáng)，因此飼料硬度較高[46]。

3.2 AM/AP對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)性能和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

淀粉經(jīng)膨化后，晶體結(jié)構(gòu)被破壞，淀粉凝膠化，消化酶更容易接觸發(fā)揮作用，提高了養(yǎng)殖動(dòng)物對(duì)淀粉的消化利用率，降低了飼料系數(shù)[51-52]。賈艷菊等[51]發(fā)現(xiàn)膨化處理的飼料可以提高鱉的飼料利用率。膨化飼料相較于普通顆粒飼料可以提高異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)[53]和真鯛(Pagrusmajor)[54]的增重率和特定生長(zhǎng)率，降低飼料系數(shù)。郭冉等[55]發(fā)現(xiàn)，淀粉糊化度為32.07%時(shí)，可以顯著提高凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)，高于該值則會(huì)抑制對(duì)蝦生長(zhǎng)。玉米和木薯等AM/AP較低的淀粉源做出的飼料其淀粉糊化度更高，顯著提高了吉富羅非魚對(duì)飼料中營(yíng)養(yǎng)成分的吸收利用[35]。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，AM/AP較低的飼料淀粉糊化度和膨化度更高，盡管飼料系數(shù)最低，但是生長(zhǎng)性能也降低。這原因可能是低AM/AP淀粉消化率高，但消化后的葡萄糖超出魚體承受范圍，對(duì)魚體代謝造成障礙，表現(xiàn)為較慢的生長(zhǎng)速度。

干物質(zhì)表觀消化率在一定程度上能反映出機(jī)體對(duì)養(yǎng)分的消化程度[56]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨飼料中AM/AP增加，干物質(zhì)表觀消化率呈先升高后降低的趨勢(shì)，在D3組達(dá)到最大值。楊偉[47]在羅非魚上的研究表明，當(dāng)飼料中的AM/AP為0.24時(shí)，干物質(zhì)表觀消化率和粗蛋白質(zhì)表觀消化率最高，AM/AP增加到0.76時(shí)，粗脂肪表觀消化率最高，與本試驗(yàn)研究結(jié)果相似，表明適當(dāng)?shù)脑黾语暳现蠥M的含量可以提高大口黑鱸對(duì)飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用能力。隨飼料中AM/AP增加，粗蛋白質(zhì)表觀消化率和腸道中蛋白酶活性呈升高趨勢(shì)，提示飼料中一定含量的AM可以影響大口黑鱸對(duì)蛋白質(zhì)的消化。

3.3 AM/AP對(duì)大口黑鱸腸道消化酶活性的影響

消化酶活性的強(qiáng)弱與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)結(jié)構(gòu)相關(guān)，并直接影響?zhàn)B殖動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化能力[57-58]。淀粉顆粒內(nèi)AM和AP形成的晶體結(jié)構(gòu)會(huì)抵抗水和酶的接觸[59]，影響淀粉在動(dòng)物腸道內(nèi)被消化的程度[60]。AM分子間氫鍵作用力比AP更強(qiáng)，難于被降解，AP越多，豬小腸淀粉的消化率越高[52]，虹鱒[61]和海鱸[62]對(duì)蠟質(zhì)玉米淀粉的消化率明顯高于普通玉米淀粉。AM/AP為0.98時(shí)，羅非魚淀粉表觀消化率明顯低于AM/AP為0.11的飼料[48]，與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。相較于AP，油脂等化合物更易于和AM結(jié)合形成復(fù)合物，導(dǎo)致淀粉疏水性增強(qiáng)，膨化度降低，同時(shí)也降低了與淀粉酶的接觸[63]。并且在制粒過程中，AM分子在擠壓膨化作用下形成了抗性淀粉[64]，而AM含量與抗性淀粉含量成正相關(guān)[21]，對(duì)淀粉酶產(chǎn)生了一定的阻礙作用，導(dǎo)致飼料中的AM更不容易被消化，進(jìn)而影響動(dòng)物消化酶的活性以及對(duì)淀粉的消化率。本試驗(yàn)中大口黑鱸腸道淀粉酶的活性與飼料中AM/AP呈極顯著負(fù)相關(guān)性，與淀粉表觀消化率趨勢(shì)相同，說(shuō)明飼料中AM/AP對(duì)大口黑鱸利用碳水化合物的能力有較大的影響，與Liu等[24]在暗紋東方鲀上的研究結(jié)果一致。隨飼料中AM/AP增加，脂肪消化率和腸道中脂肪酶活性呈降低趨勢(shì)，這可能與AM-脂質(zhì)復(fù)合物抵抗酶解，減緩脂肪的消化吸收有關(guān)。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)條件下，飼料中AM/AP升高會(huì)降低膨化飼料的淀粉糊化度和膨化度。適宜的AM/AP可以提高腸道蛋白酶的活性，增加大口黑鱸干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)表觀消化率，促進(jìn)生長(zhǎng)。綜合大口黑鱸生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率等結(jié)果，飼料中AM/AP為1.18～2.62時(shí)效果較好。