田 旭 侯振平 玉 霞 張雪蕾 龍 云 龍 亮 王 榮 王 敏 吳端欽*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所，長沙410205；2.中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，長沙410125；3.湖南德農(nóng)牧業(yè)集團有限公司，湘西416144)

近年來，隨著我國居民收入和生活水平的不斷提高，人們對風味獨特且富含蛋白質(zhì)的牛、羊肉需求量逐漸增加[1]。在新冠肺炎疫情影響下，我國牛、羊肉消費產(chǎn)業(yè)雖然受到了影響，但消費仍然保持增長。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2020年我國牛肉進口量和消費量分別高達211.93萬和951.50萬t，同比增長分別為27.70%和3.05%[2]。隨著我國牛、羊肉消費需求的持續(xù)增長，預計到2030年我國牛、羊肉消費總量將達到1 987萬t，且難以依靠國際市場滿足[3]。因此，大力促進我國草食畜牧業(yè)發(fā)展勢在必行。然而，由于我國牧草產(chǎn)品產(chǎn)量不足且品質(zhì)參差不齊，以苜蓿為代表的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)飼草資源長期短缺，致使我國草食畜牧業(yè)高效發(fā)展受到極大制約。因此，合理利用非常規(guī)飼料資源、積極挖掘潛在的優(yōu)質(zhì)飼草資源、開發(fā)新的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)飼草資源，可以從根本上解決困擾我國草食畜牧業(yè)發(fā)展的草畜不平衡問題。

苧麻(BoehmerianiveaL. Gaudich.)為蕁麻科(Urticaceae)，苧麻屬，多年生宿根性草本植物。其生態(tài)適應性強，生物產(chǎn)量高，粗蛋白質(zhì)含量達22%左右，氨基酸種類豐富，是一種具有巨大開發(fā)潛力的蛋白質(zhì)飼草資源[4]。目前，關于飼用苧麻與紫花苜蓿等優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)飼草組合使用的研究已經(jīng)取得一定進展，奶牛飼糧中33%～67%的青貯苧麻替代苜蓿干草，對奶牛的生產(chǎn)性能和血清生化指標無不良影響[5]。10%～20%的飼用苧麻和稻草混合青貯替代紫花苜蓿干草飼喂奶牛，改善了奶牛干物質(zhì)消化率，顯著提高了牛奶乳脂率和總干物質(zhì)率[6]。此外，20%和40%的青貯苧麻替代云嶺牛飼糧中的青貯玉米，不僅對其生長性能和健康狀況無負面影響，還可顯著降低血清尿素氮的含量，提高機體蛋白質(zhì)利用率[7]。在山羊飼糧中，低于35%的飼用苧麻替代苜蓿干草對山羊生產(chǎn)性能、瘤胃發(fā)酵功能和瘤胃微生物區(qū)系無顯著影響[8]。此外，在全混合日糧中添加20%的飼用苧麻飼喂山羊，對其生長性能和血液生化指標均無不良影響，還可提高山羊肉多不飽和脂肪酸比例，改善肉品質(zhì)[9]。

目前，關于苧麻和苜蓿組合對體外模擬瘤胃發(fā)酵特性的相關研究報道較少。因此，本試驗旨在利用體外模擬瘤胃發(fā)酵技術，探究苧麻和苜蓿組合對體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響，篩選苧麻與苜蓿在畜牧生產(chǎn)中的合理配比，為實際生產(chǎn)中飼用苧麻與苜?？茖W配制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用種植于中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所沅江試驗基地的“中飼苧1號”苧麻和紫花苜蓿作為試驗材料。苧麻收割于2019年8月，株高100～120 cm，高度為80～100 cm。收割后利用揉絲機將苧麻與苜蓿分別切碎至2 cm左右，65 ℃烘干，粉碎過1 mm篩。將苧麻與苜蓿按不同質(zhì)量[干物質(zhì)基礎(DM)]比例(10∶90、20∶80、30∶70、40∶60、50∶50、60∶40、70∶30、80∶20和90∶10)混合均勻作為發(fā)酵底物，保存于密封袋中備用。發(fā)酵底物干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)(CP)、粗灰分(Ash)、粗脂肪(EE)含量參照AOAC(2005)[10]的方法測定。中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量參照Van Soest等[11]的濾袋法測定?？偰?GE)采用等溫式全自動熱量儀(5E-AC8018，長沙開元儀器有限公司)測定。

1.2 試驗動物及飼糧

選取3只體重[(25.0±2.0) kg]相近且安裝永久性瘤胃瘺管的健康成年湘東黑山羊作為瘤胃液供體動物，單籠飼養(yǎng)，自由飲水。飼糧精粗比為50∶50，其中粗飼料為稻草，精飼料組成為玉米47.00%、豆粕24.00%、麥麩22.00%、食鹽0.77%、石粉2.23%和預混料4.00%。整個試驗期內(nèi)，每天飼喂精飼料和稻草各300 g(干物質(zhì)基礎)，每日飼喂2次(08:00和18:00)。

1.3 體外發(fā)酵

參照Menke等[12]的方法配制人工瘤胃緩沖液2 000 mL，配制好后持續(xù)通入純二氧化碳(CO2)以確保溶液厭氧環(huán)境，然后于39.5 ℃恒溫水浴鍋中預熱備用。試驗當天晨飼前采集瘤胃內(nèi)容物，用6層脫脂紗布過濾500 mL瘤胃液與人工瘤胃緩沖液混合，制成混合人工瘤胃培養(yǎng)液。在此過程中，采用恒溫磁力攪拌器持續(xù)攪拌，溫度恒定在39.5 ℃，并不斷通入CO2保持厭氧環(huán)境。

參照Wang等[13]的方法，利用全自動化體外模擬瘤胃發(fā)酵系統(tǒng)進行體外發(fā)酵試驗。精確稱取0.6 g發(fā)酵底物于150 mL厭氧發(fā)酵瓶中，置于39.5 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中預熱2 h，接種前向厭氧發(fā)酵瓶中通入CO2以保證發(fā)酵瓶中為厭氧環(huán)境。最后用瓶口分液器迅速向每個發(fā)酵瓶中加入事先預熱好的人工瘤胃培養(yǎng)液60 mL，并立即蓋嚴瓶塞。將發(fā)酵瓶轉(zhuǎn)移至39 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后終止發(fā)酵。發(fā)酵瓶通過導管與三通電磁閥和壓力傳感器連接。壓力傳感器與計算機連接，實時測定并記錄瓶中壓力，通過壓力與氣體體積間關系計算氣體生成量。當發(fā)酵瓶中壓力超過9 kPa，三通電磁閥在計算機控制下自動打開，厭氧瓶中頂部空間的氣體釋放并進入氣相色譜儀(安捷倫7890A，美國)，從而對氣體中的氫氣和甲烷產(chǎn)量進行測定[14]。產(chǎn)氣參數(shù)、氫氣和甲烷產(chǎn)量參考Wang等[15]的方法進行計算。每個發(fā)酵瓶為1個平行，每次試驗的每個處理和空白均設置3個平行，重復體外發(fā)酵試驗3次，每次試驗使用的瘤胃液來自2只不同瘺管羊。

1.4 樣品采集與測定

48 h體外模擬瘤胃發(fā)酵試驗結(jié)束后，用高精度便攜式pH計(S210，Mettler Toleddo，上海)測定發(fā)酵液的pH。取5 mL發(fā)酵液，在4 ℃條件下離心10 min(15 000×g)，取1.5 mL上清液，加入0.15 mL 25%(質(zhì)量體積比)的偏磷酸固定，靜置15 min后，在-20 ℃條件下保存過夜。參考Wang等[16]方法測定總揮發(fā)性脂肪酸及各組分濃度。采用300目紗布過濾離心管中剩余發(fā)酵底物，用蒸餾水漂洗剩余底物至水清后，置于105 ℃條件下烘干至恒重，參照程景等[17]方法，計算干物質(zhì)降解率。

1.5 數(shù)據(jù)分析

應用非線性軟件(NLREG 5.4[18])程序，計算不同時間點的產(chǎn)氣參數(shù)；按照下面的公式計算最大產(chǎn)氣量及起始底物降解速率(FRD0)等參數(shù)[19-20]：

GPt=Vf[1-exp(-kt)]/[1+exp(b-kt)]；
FRD0=k/[1+exp(b)]。

式中：GPt為t時間點底物的累積產(chǎn)氣量(mL)；Vf為潛在最大產(chǎn)氣量(mL)；k為產(chǎn)氣速率(h-1)；b為曲線的形狀參數(shù)。

用Excel 2010記錄數(shù)據(jù)并做初步處理，采用SPSS 23.0軟件中的一般線性模型程序?qū)?shù)據(jù)進行方差分析，通過Duncan氏法對各組平均值作多重比較，使用正交多項式比較分析各個指標隨苧麻和苜蓿組合比例變化的趨勢。以P<0.05作為差異顯著判斷標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 苧麻和苜蓿組合常規(guī)營養(yǎng)成分含量

由表1可知，不同比例的苧麻和苜蓿組合后，發(fā)酵底物中干物質(zhì)含量在91.12%～92.60%，粗蛋白質(zhì)含量在22.15%～22.97%，中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維和粗灰分含量均隨苧麻比例的增加而升高，粗脂肪含量和總能隨著苧麻比例的增加而降低。

表1 苧麻和苜蓿組合的常規(guī)營養(yǎng)成分(干物質(zhì)基礎)

2.2 苧麻和苜蓿組合對體外瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣參數(shù)的影響

由圖1可知，苧麻與苜蓿組合的總產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣速率存在差異。由表2可知，干物質(zhì)降解率、每克底物的產(chǎn)氣量、降解每克底物的產(chǎn)氣量、產(chǎn)氣速率和起始底物降解速率隨苧麻比例的增加呈顯著線性降低(P<0.05)。與苧麻比例≤20%相比，當苧麻比例≥30%時，底物干物質(zhì)降解率顯著降低(P<0.05)；當苧麻比例≥40%時，每克底物的產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣速率顯著降低(P<0.05)；當苧麻比例≥70%時，降解每克底物的產(chǎn)氣量顯著降低(P<0.05)。

圖1 苧麻和苜蓿組合對體外瘤胃發(fā)酵總產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣速率的影響

表2 苧麻和苜蓿組合對48 h體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

2.3 苧麻和苜蓿組合對體外瘤胃發(fā)酵氫氣和甲烷生成的影響

由表3可知，苧麻與苜蓿組合每克底物的氫氣產(chǎn)量、氫氣潛在最大產(chǎn)量、降解每克底物的氫氣產(chǎn)量和氫氣產(chǎn)生速率均隨苧麻比例的增加呈顯著線性升高(P<0.05)。與苧麻比例≤20%相比，當苧麻比例≥70%時，氫氣潛在最大產(chǎn)生量和降解每克底物氫氣產(chǎn)量顯著升高(P<0.05)；當苧麻比例≥80%時，氫氣產(chǎn)生速率顯著升高(P<0.05)。

每克底物的甲烷產(chǎn)量、降解每克底物的甲烷產(chǎn)量和甲烷產(chǎn)生速率均隨苧麻比例的增加呈顯著線性降低(P<0.05)。與苧麻比例≤20%相比，當苧麻比例≥30%時，每克底物的甲烷產(chǎn)量顯著降低(P<0.05)；當苧麻比例≥40%時，甲烷潛在最大產(chǎn)量和降解每克底物的甲烷產(chǎn)量顯著降低(P<0.05)；當苧麻比例≥60%時，甲烷的產(chǎn)生速率顯著降低(P<0.05)。

2.4 苧麻和苜蓿組合對體外瘤胃發(fā)酵揮發(fā)性脂肪酸組成的影響

由表4可知，苧麻和苜蓿組合體外發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液pH介于6.68～6.79，各組合比例之間差異不顯著(P>0.05)。總揮發(fā)性脂肪酸濃度、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸比例均隨苧麻比例的增加呈顯著線性降低(P<0.05)，乙酸比例和乙丙比隨苧麻比例的增加呈顯著線性升高(P<0.05)。與苧麻比例≤20%相比，當苧麻比例≥50%時，總揮發(fā)性脂肪酸濃度和異丁酸比例顯著降低(P<0.05)；當苧麻比例≥70%時，丁酸比例顯著降低(P<0.05)；當苧麻比例≥80%時，乙酸比例和乙丙比顯著升高(P<0.05)，而丙酸和異戊酸的比例顯著降低(P<0.05)。

3 討 論

3.1 苧麻和苜蓿組合對體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

飼糧經(jīng)瘤胃微生物發(fā)酵后產(chǎn)生CO2、氫氣和甲烷等氣體，其體外模擬瘤胃發(fā)酵的產(chǎn)氣量和降解率已成為衡量飼糧可發(fā)酵程度的重要指標[21]。飼糧中所含非結(jié)構(gòu)性碳水化合物與結(jié)構(gòu)性碳水化合物相比更易被微生物分解利用，因此，當飼糧富含非結(jié)構(gòu)性碳水化合物時，其體外發(fā)酵的產(chǎn)氣量和降解率也更高[7]。在本試驗中，隨著苧麻比例的增加，體外發(fā)酵產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣速率呈現(xiàn)線性降低。這是因為與紫花苜蓿相比，飼用苧麻的非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量較低，結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量較高，而后者瘤胃降解率低于前者。陽伏林等[22]研究得出，不同比例的小麥秸稈與苜蓿干草體外發(fā)酵總產(chǎn)氣量隨小麥秸稈比例的增加而降低。這與本試驗結(jié)果相似。當苧麻比例低于30%時，總產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣速率無顯著變化，這表明苧麻比例低于30%時，對體外瘤胃發(fā)酵不會產(chǎn)生負面影響。干物質(zhì)降解率與飼糧中可發(fā)酵碳水化合物含量和體外發(fā)酵產(chǎn)氣量具有高度相關性[23]。在本試驗中，干物質(zhì)降解率與總產(chǎn)氣量變化趨勢一致，當苧麻比例低于20%時，干物質(zhì)降解率沒有顯著變化，但隨著苧麻比例的增加，干物質(zhì)降解率呈現(xiàn)線性降低。這表明飼糧中苧麻添加比例較高時，對體外發(fā)酵具有一定的抑制作用，這可能是因為苧麻粗纖維含量較高[5]。許蘭嬌等[24]利用尼龍袋法研究發(fā)現(xiàn)，不同比例苧麻和象草混合青貯，瘤胃干物質(zhì)降解率隨苧麻比例的增加而降低。這與本試驗研究結(jié)果相一致。

3.2 苧麻和苜蓿組合對體外瘤胃發(fā)酵氫氣和甲烷生成的影響

飼糧可發(fā)酵碳水化合物在瘤胃微生物的作用下生成揮發(fā)性脂肪酸的過程中往往伴隨著氫的產(chǎn)生，反芻動物為維持瘤胃內(nèi)氫分壓的穩(wěn)定，瘤胃內(nèi)甲烷菌會將氫氣轉(zhuǎn)化為甲烷排出體外[25]。反芻動物瘤胃甲烷排放不僅造成了飼糧能量的損失，同時也加劇了溫室效應。

研究表明，不同粗飼料組合對反芻動物瘤胃發(fā)酵和甲烷的排放具有調(diào)節(jié)作用，其主要是通過提高飼糧非結(jié)構(gòu)性碳水化合物比例，降低中性洗滌纖維比例，瘤胃發(fā)酵模式由乙酸型向丙酸型轉(zhuǎn)變[26]，飼糧在發(fā)酵生成乙酸過程中，會釋放大量的氫，而在生成丙酸的過程中，會競爭性利用甲烷菌所需的氫，從而降低甲烷排放[27]。在本試驗結(jié)果中，隨著苧麻比例的增加，發(fā)酵底物的中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量均增加，每克底物甲烷產(chǎn)量、甲烷潛在最大產(chǎn)量和甲烷產(chǎn)生速率均呈現(xiàn)線性降低。這可能是與苧麻比例過高抑制底物發(fā)酵有關。然而，降解每克底物甲烷的產(chǎn)量也呈現(xiàn)線性降低，這說明甲烷生成過程受到了抑制。有研究結(jié)果表明，苧麻含有單寧和黃酮類化合物，其中苧麻單寧酸含量在0.6%左右，不同品種和茬次的苧麻雖存在一定差異，但均顯著高于紫花苜蓿[28]。此外，在苧麻根中黃酮類化合物含量為0.51%，韌皮中為1.77%，而葉中達2.74%[29]。單寧和黃酮類化合物可對甲烷菌產(chǎn)生直接的抑制作用，減少甲烷菌對氫氣的利用，從而減少甲烷產(chǎn)生[30-31]。

3.3 苧麻和苜蓿組合對體外瘤胃發(fā)酵揮發(fā)性脂肪酸組成的影響

瘤胃液pH是影響瘤胃微生物生長代謝的重要因素，更是反映瘤胃發(fā)酵狀況的關鍵指標。在本試驗中，各組合發(fā)酵液pH介于6.68～6.79，均在適宜范圍內(nèi)，表明人工瘤胃緩沖液配制合理，達到了維持體外發(fā)酵環(huán)境穩(wěn)定的作用。研究表明，瘤胃發(fā)酵類型和揮發(fā)性脂肪酸濃度及組成主要由飼糧非結(jié)構(gòu)性碳水化合物和中性洗滌纖維比例決定[32]。在本試驗中，隨苧麻比例的增加，總揮發(fā)性脂肪酸濃度、丙酸和丁酸比例呈現(xiàn)線性降低，乙酸比例和乙丙比呈線性升高。這主要是因為苧麻比例的增加導致發(fā)酵底物中非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量降低，中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量增加，促使更多的乙酸生成。Gao等[6]采用飼用苧麻和稻草混合青貯后，以10%～20%的比例替代紫花苜蓿干草飼喂奶牛，結(jié)果發(fā)現(xiàn)苧麻添加對瘤胃總揮發(fā)性脂肪酸濃度和組成無顯著影響。同樣，Du等[33]研究也表明，低于20%的苧麻替代苜蓿對山羊瘤胃總揮發(fā)性脂肪酸濃度和組成無顯著影響，這與本試驗結(jié)果相一致[6,33]。此外，苧麻與苜蓿以20∶80組合時，總揮發(fā)性脂肪酸濃度和乙酸比例最高，這表明在本試驗條件下苧麻與苜蓿以20∶80組合更有利于飼糧發(fā)酵。異丁酸和異戊酸均屬異構(gòu)酸，瘤胃內(nèi)異構(gòu)酸主要來源于粗蛋白質(zhì)降解成氨基酸后在微生物作用下經(jīng)氫化脫氨基或脫羧基后的產(chǎn)物[34]。本試驗中，異丁酸和異戊酸比例隨苧麻比例的增加而降低。這可能是因為隨著苧麻比例的增加提高了底物中單寧含量提高，進而抑制了微生物對粗蛋白質(zhì)的降解，導致氨基酸分解減少，異丁酸和異戊酸比例降低[35]。

4 結(jié) 論

在本試驗條件下，當苧麻比例≤20%時，對體外模擬瘤胃發(fā)酵和底物降解影響較小，并且對甲烷生成具有抑制作用；本研究結(jié)果提示，生產(chǎn)中苧麻替代苜蓿飼喂反芻動物時其比例不宜超過20%。