魏 翊 劉永發(fā) 鞏 璐 扶佳歡 班志彬,2 咼于明 張炳坤*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，長春130000)

蛋雞產(chǎn)蛋高峰后期，生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)都會隨著日齡的增加而下降[1]，且產(chǎn)蛋中后期蛋雞腹部沉積大量脂肪，卵巢和輸卵管被大量脂肪包裹，尤其是分泌蛋殼的子宮部周圍脂肪沉積增加，這會影響蛋殼形成，降低蛋殼質(zhì)量[2-4]。因此，降低產(chǎn)蛋中后期蛋雞的腹脂沉積，改善輸卵管健康，是提高產(chǎn)蛋中后期蛋雞蛋品質(zhì)量的有效手段。研究表明，添加黃酮類化合物可以提高蛋雞的生產(chǎn)性能，改善脂代謝和蛋品質(zhì)[5]。槲皮素作為一種多酚類黃酮，主要以糖苷形式存在于各種食物中，包括漿果、洋蔥和青蔥、蘋果、茶和巧克力[6]，其具有多種生物活性，包括改善腸道環(huán)境、抗氧化和抗凋亡特性[7-9]，其能通過改善異常脂代謝緩解機(jī)體脂肪沉積，提高產(chǎn)蛋性能和蛋品質(zhì)[10-11]。但是目前槲皮素對蛋雞影響作用的研究大多集中在產(chǎn)蛋前期或高峰期[12-15]，對產(chǎn)蛋中后期的研究較少，尤其是腹脂沉積和脂代謝等方面，目前尚無深入研究。因此，本試驗(yàn)以產(chǎn)蛋中后期的海蘭褐蛋雞為試驗(yàn)對象，研究槲皮素對產(chǎn)蛋中后期蛋雞蛋品質(zhì)、腹脂率和血清脂代謝等指標(biāo)的影響，為改善產(chǎn)蛋中后期蛋雞蛋品質(zhì)和腹脂沉積提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物與試驗(yàn)飼糧

試驗(yàn)選用健康且體重[(2 110.8±105.5) g]相近的46周齡海蘭褐蛋雞320只，隨機(jī)分為4組，每組8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只雞，密閉雞舍階梯式籠養(yǎng)。試驗(yàn)分為預(yù)試期1周和正試期10周，預(yù)試期飼喂玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧，期間對蛋雞進(jìn)行替換，保證各組間蛋雞初始體重和產(chǎn)蛋率相近；正試期對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加100、300和600 mg/kg槲皮素(購自陜西某生物科技有限責(zé)任公司，純度為98%)的試驗(yàn)飼糧。基礎(chǔ)飼糧參照NRC(1994)和《海蘭褐蛋雞管理手冊(2008)》配制。基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表1項(xiàng)目 Items含量 Content營養(yǎng)水平 Nutrient levels3)表觀代謝能 AME/(MJ/kg)11.67粗蛋白質(zhì) CP16.60鈣 Ca 3.59有效磷 AP0.32蘇氨酸 Thr0.58色氨酸 Try0.17蛋氨酸 Met0.42賴氨酸 Lys0.85蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys0.72

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)開始前雞舍清掃消毒，根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行籠位編號。每天光照16 h，光照強(qiáng)度為20 lx左右。雞舍溫度控制在20～22 ℃，相對濕度50%～80%，舍內(nèi)負(fù)壓式通風(fēng)。試驗(yàn)期間自由采食和飲水，每天清糞、喂料和撿蛋。人工喂料(每日2次，07：30、14：00)、撿蛋(每日1次，15：00)。每周消毒1次，常規(guī)免疫。

1.3 樣品采集

蛋雞飼養(yǎng)到56周齡的最后1 d晚上進(jìn)行斷料，12 h后稱重，并記錄蛋雞重。稱重后再飼喂各組對應(yīng)飼糧，從每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)挑選1只體重相近的蛋雞，按照指標(biāo)測定要求采血后解剖，將肝臟、脾臟和腹脂分離后，置于-20 ℃保存，直至進(jìn)一步檢測。

1.4 指標(biāo)測定與方法

1.4.1 蛋品質(zhì)

在試驗(yàn)期第10周的最后1 d收集試驗(yàn)蛋雞當(dāng)天所產(chǎn)的所有雞蛋，用蛋品儀(NABEL，日本)測定蛋重、蛋殼強(qiáng)度、蛋白高度、哈氏單位、蛋黃重量。使用電子數(shù)顯卡尺測定雞蛋大頭端、中部和小頭端的蛋殼厚度和雞蛋的長徑、短徑，并計(jì)算蛋殼厚度均值和蛋形指數(shù)(長徑/短徑)。

1.4.2 器官指數(shù)和腹脂率

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每個(gè)重復(fù)選擇1只雞，采血處理后剖開稱取肝臟、脾臟和腹脂。按照下述公式計(jì)算肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和腹脂率：

肝臟指數(shù)(‰)=(肝臟重/體重)×1 000；
脾臟指數(shù)(‰)=(脾臟重/體重 )×1 000；
腹脂率(‰)=(腹脂重/體重)×1 000。

1.4.3 血常規(guī)指標(biāo)

試驗(yàn)結(jié)束后(第56周齡)，蛋雞饑餓8 h后從每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)挑選1只稱重，翅靜脈采血于含有肝素鈉抗凝管中，采用血常規(guī)生化儀(Sysmex K4500，日本)測定白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血紅蛋白含量(HGB)、大型血小板比率(P-LCR)等血液常規(guī)指標(biāo)。

1.4.4 肝臟甘油三酯(TG)含量

常溫解凍-80 ℃冷凍的肝臟樣品，稱取10 g左右并記錄肝臟鮮重，冷凍干燥機(jī)(FD-1A-50，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)凍干并稱重。按照GB/T 6433—2006的方法，稱取1.0 g左右肝臟凍干樣品裝入濾紙包內(nèi)，記錄濾紙包、樣品重和二者的總重。在索氏提取器內(nèi)倒入石油醚(沸點(diǎn)30～60 ℃)，放入裝有樣品的濾紙包，抽提4～6 h；取出已抽提完畢的濾紙包，放入通風(fēng)櫥中，使殘留的石油醚揮發(fā)完畢，再放入烘箱烘干后，稱取烘干后的含有樣品的濾紙包重量，計(jì)算肝臟甘油三酯含量。

肝臟甘油三酯含量(%)=(肝臟凍干重-脫脂
肝臟重)/肝臟凍干重×100。

1.4.5 血清脂代謝指標(biāo)

試驗(yàn)結(jié)束后，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取1只蛋雞，饑餓8 h后翅靜脈采血5 mL左右于惰性帶分離膠離心管中，4 ℃下3 000 r/min離心15 min，分離血清將其分裝，保存在-80 ℃冰箱中。采用全自動生化分析儀(深圳市庫貝爾生物科技有限公司，iChem-340)測定血清中總膽固醇(TC)(CHOD-PAP法)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)(直接法-選擇抑制法)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)(直接法-表面活性劑清除法)、TG(GPO-PAP法)和游離脂肪酸(NEFA)(ACS-ACOD法)含量，先將血清樣本用MX-S渦旋儀[大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司]渦旋15 s后上機(jī)檢測，讀取原始數(shù)據(jù)后，進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，離群值重新上機(jī)檢測。

1.4.6 血清脂聯(lián)素和瘦素含量

試驗(yàn)結(jié)束后，每個(gè)重復(fù)選取1只雞，饑餓8 h后翅靜脈采血5 mL左右于促凝管中，4 ℃下3 000 r/min離心15 min，分離血清將其分裝，保存在-80 ℃冰箱中。按照脂聯(lián)素和瘦素試劑盒(購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司)說明書進(jìn)行檢測，在多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices，SpectraMax i3x，美國)于450 nm處讀取數(shù)據(jù)，計(jì)算血清脂聯(lián)素和瘦素含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)先經(jīng)過Excel 2010處理后，再采用SPSS 26.0的one-way ANOVA程序進(jìn)行分析，F(xiàn)檢驗(yàn)先確定組間方差齊性，ANOVA進(jìn)行方差分析，Duncan氏法進(jìn)行多重比較。Contrast命令獨(dú)立于多重比較用以檢驗(yàn)線性和二次關(guān)系。Graph pad prism 9進(jìn)行繪圖分析，P<0.01判定為差異極顯著，P<0.05判定為差異顯著，而0.05≤P<0.10判定為差異具有顯著趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 槲皮素對產(chǎn)蛋中后期蛋雞蛋品質(zhì)的影響

由表2可知，與對照組相比，飼糧中添加100、300和600 mg/kg槲皮素均極顯著提高了蛋殼厚度和蛋殼強(qiáng)度(P<0.01)，其中槲皮素添加水平為300 mg/kg時(shí)效果最好；飼糧中添加300 mg/kg槲皮素顯著提高了蛋殼重(P<0.05)，極顯著提高了蛋白高度P<0.01)，且對蛋重和哈氏單位有提高趨勢(P=0.079和P=0.059)。隨槲皮素添加水平的提高，蛋重、蛋殼厚度、蛋殼強(qiáng)度呈線性和二次變化(P<0.05)，蛋白高度和哈氏單位呈現(xiàn)二次變化(P<0.05)。

表2 槲皮素對產(chǎn)蛋中后期蛋雞蛋品質(zhì)的影響

2.2 槲皮素對蛋雞產(chǎn)蛋中后期器官指數(shù)和腹脂率的影響

由表3可知，與對照組相比，飼糧中添加100、300和600 mg/kg槲皮素均顯著降低了蛋雞的腹脂率(P<0.05)，對肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)均無顯著影響(P>0.05)。隨槲皮素添加水平的提高，肝臟指數(shù)和腹脂率有線性降低的趨勢(P=0.095和P=0.082)，腹脂率則呈現(xiàn)二次變化(P=0.012)。

表3 槲皮素對蛋雞產(chǎn)蛋中后期器官指數(shù)的影響

2.3 槲皮素對蛋雞產(chǎn)蛋中后期血常規(guī)指標(biāo)的影響

由表4可知，與對照組相比，飼糧中添加300 mg/kg槲皮素極顯著提高了血小板數(shù)量(P<0.01)，大型血小板比例有增加趨勢(P=0.062)，而添加100 mg/kg槲皮素則顯著降低了血小板數(shù)量(P<0.05)。血小板數(shù)量隨槲皮素添加水平的提高有線性升高的趨勢(P=0.075)，而大型血小板比率則隨槲皮素添加水平的提高呈二次變化(P=0.028)。

表4 槲皮素對蛋雞產(chǎn)蛋中后期血常規(guī)指標(biāo)的影響

2.4 槲皮素對蛋雞產(chǎn)蛋中后期肝臟甘油三酯含量的影響

由圖1所示，與對照組相比，飼糧中添加100、300和600 mg/kg槲皮素均極顯著降低了肝臟甘油三酯含量(P<0.01)，其中以槲皮素添加水平為300 mg/kg時(shí)效果最好，且肝臟甘油三酯含量隨槲皮素添加水平的提高呈線性和二次變化(P<0.01)。

數(shù)據(jù)柱形標(biāo)注無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

2.5 槲皮素對蛋雞產(chǎn)蛋中后期血清脂代謝指標(biāo)的影響

由表5可知，與對照組相比，飼糧中添加100、300和600 mg/kg槲皮素均顯著降低了血清LDL-C、TG和NEFA含量(P<0.05)，且上述指標(biāo)隨槲皮素添加水平的提高呈線性和二次變化(P<0.05)。此外，300 mg/kg槲皮素組血清TC和GLU含量極顯著低于對照組(P<0.01)。隨槲皮素添加水平的提高，血清TC含量呈線性降低和二次變化(P=0.003、P=0.005)，血清GLU含量呈二次變化(P=0.040)。

表5 槲皮素對蛋雞產(chǎn)蛋中后期血清脂代謝指標(biāo)的影響

2.6 槲皮素對蛋雞產(chǎn)蛋中后期血清脂聯(lián)素和瘦素含量的影響

由表6可知，與對照組相比，飼糧中添加100、300和600 mg/kg槲皮素均極顯著提高了血清脂聯(lián)素和瘦素含量(P<0.01)，其中血清脂聯(lián)素含量分別提高了7.6%、8.9%和9.4%，血清瘦素含量分別提高了7.1%、6.7%和11.6%。隨槲皮素添加水平的提高，血清脂聯(lián)素和瘦素含量均呈線性(P=0.001、P<0.001)和二次變化(P=0.001、P=0.001)。

表6 槲皮素對蛋雞產(chǎn)蛋中后期血清脂聯(lián)素和瘦素含量的影響

近年來，一些研究證實(shí)，黃酮類化合物可以提高家禽的生產(chǎn)性能，改善脂代謝和蛋品質(zhì)[5,16-18]。槲皮素作為植物黃酮類物質(zhì)的一種，也同樣具有改善蛋雞生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)的功能[19,14]。前人研究報(bào)道，飼糧中添加一定劑量的槲皮素能夠改善蛋雞脂代謝，增加蛋殼強(qiáng)度、蛋殼厚度和哈氏單位[10-11,20]。本研究結(jié)果表明，蛋殼強(qiáng)度、蛋殼厚度和蛋白高度均隨槲皮素添加水平的提高呈線性增加，分析原因可能與槲皮素發(fā)揮雌激素樣作用，改善輸卵管健康有關(guān)，這也與前人的研究結(jié)果[13]一致。類似的發(fā)現(xiàn)，如呼林林[14]對29周齡海賽蛋雞進(jìn)行了為期8周的試驗(yàn)，結(jié)果表明，槲皮素可以顯著提高蛋雞的蛋殼厚度和蛋殼強(qiáng)度。有報(bào)道指出，隨著母雞年齡的增長，因雞體激素(甲狀旁腺激素、降鈣素、雌激素[21-22])水平和24-羥化酶活性降低等造成鈣代謝

3 討 論

紊亂

[23]

，使得蛋殼質(zhì)量下降。雌激素物質(zhì)對腸道鈣吸收的積極作用已在人類中得到證實(shí)

[24]

。有研究指出槲皮素具有雌激素樣作用

[25]

，可提高機(jī)體雌激素水平，增加產(chǎn)蛋后期蛋雞的蛋殼厚度和蛋殼強(qiáng)度，從而提高蛋品質(zhì)

[13,26]

，這可能也是本研究中蛋殼強(qiáng)度和蛋殼厚度提高的原因。此外，本研究結(jié)果表明，隨槲皮素添加水平的提高，雞蛋的哈氏單位呈二次變化，提示槲皮素能一定程度保持雞蛋的新鮮度，延長雞蛋的存儲期。

血小板是循環(huán)血液中最小的血細(xì)胞，具有多項(xiàng)生理活性。研究表明，機(jī)體由于免疫系統(tǒng)功能紊亂導(dǎo)致外周血循環(huán)中血小板數(shù)量減少[27]，可引起皮膚、黏膜和內(nèi)臟出血，嚴(yán)重危及生命。其中大型血小板是指骨髓新生的血小板，其聚集和黏附功能增強(qiáng)，是反映血小板活化的一個(gè)重要指標(biāo)[28]。當(dāng)人體代謝紊亂，血管內(nèi)皮損傷時(shí)，血小板消耗增多，進(jìn)而導(dǎo)致循環(huán)血液中大型血小板數(shù)量減少[28-29]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨槲皮素添加水平的提高，蛋雞血小板數(shù)量有線性提高的趨勢，提示槲皮素可能對緩解產(chǎn)蛋中后期蛋雞炎癥反應(yīng)有一定作用。此外，在本試驗(yàn)中蛋雞血漿中大型血小板比率隨槲皮素添加水平的提高呈二次變化，這與之前的研究結(jié)果[30]存在不一致，這可能與試驗(yàn)動物和生理狀態(tài)不同有關(guān)。因?yàn)榧仪菅Ｒ?guī)指標(biāo)的正常范圍值尚不規(guī)范，因此具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

家禽體內(nèi)的脂肪主要包括腹部脂肪、皮下脂肪和肌內(nèi)脂肪，其中脂肪沉積主要出現(xiàn)在腹部和皮下[31]。前人研究報(bào)道，產(chǎn)蛋后期蛋雞產(chǎn)蛋率與腹脂沉積存在一定的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為-0.69～-0.83[32]。產(chǎn)蛋高峰后期，母雞產(chǎn)蛋量逐漸下降，且對能量較為敏感，多余的能量一般以脂肪形式在體內(nèi)沉積，其中以腹部脂肪沉積最多，然而沉積的腹脂又進(jìn)一步影響蛋雞的產(chǎn)蛋性能[33]。前人研究表明，黃酮類化合物具有調(diào)控脂代謝等多種內(nèi)分泌調(diào)節(jié)功能[34-37]。研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加槲皮素后，蛋雞腹脂沉積得到明顯改善，蛋殼腺因受到腹脂的擠壓減弱，從而維持其正常的分泌功能，進(jìn)而顯著改善蛋品質(zhì)量。王密[38]通過在飼糧中添加0.06%槲皮素顯著降低了肉雞腹脂率，且指出槲皮素在肝臟通過肝激酶B1(LKB1)-腺苷酸活化蛋白激酶γ(AMPKγ)-過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)信號通路增加脂質(zhì)氧化分解，加強(qiáng)脂質(zhì)從肝臟中轉(zhuǎn)出，減少脂肪沉積。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨槲皮素添加水平的提高，蛋雞腹脂率有線性降低的趨勢，且呈二次變化，這進(jìn)一步證實(shí)了槲皮素可降低產(chǎn)蛋中后期蛋雞腹脂沉積。

為了進(jìn)一步研究槲皮素對腹脂沉積的影響，本試驗(yàn)對蛋雞血常規(guī)指標(biāo)、血清脂代謝指標(biāo)和肝臟TG含量進(jìn)行了研究。多項(xiàng)研究表明，槲皮素可以顯著降低肝臟中TG含量[35,39,40-42]，且呈劑量依賴性。另外，在相關(guān)薈萃分析中，長期補(bǔ)充槲皮素與血清TG、TC和LDL-C含量的降低有關(guān)[43]。本研究結(jié)果顯示，飼糧中添加槲皮素未改變蛋雞血清HDL-C含量，但線性降低了血清LDL-C、TC、TG和NEFA含量，且血清GLU含量隨槲皮素添加水平的提高呈二次降低的趨勢。研究表明，槲皮素可以顯著改善db/db小鼠的血脂異常和肝臟脂肪變性，降低肝臟中TG和膽固醇的沉積[44]，這可能是因?yàn)殚纹に赝ㄟ^降低血清中合成膽固醇的3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶的活性，使膽固醇合成受到抑制[45]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)通過調(diào)節(jié)脂肪合成和能量儲存相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)脂肪的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和儲存等[38]，槲皮素可通過抑制脂肪細(xì)胞中PPARγ的表達(dá)，調(diào)節(jié)脂肪的合成和胞內(nèi)沉積[46]。血液中GLU的含量可反映機(jī)體內(nèi)糖代謝的平衡狀態(tài)。研究表明，飼糧中添加6 mg/kg大豆黃酮可使29周齡蛋雞血清GLU含量降低81.05%[47]，可能是因?yàn)辄S酮類物質(zhì)增強(qiáng)胰島素敏感性和刺激β細(xì)胞分泌胰島素來降低GLU含量[48-49]。本研究結(jié)果顯示，產(chǎn)蛋中后期蛋雞飼糧中添加槲皮素顯著提高了血清脂聯(lián)素和瘦素含量，提高了GLU的利用率和胰島素敏感性[50]，通過胰島素的增加和脂肪酸氧化[51]，降低肥胖和血清GLU含量，提示槲皮素有利于改善產(chǎn)蛋中后期蛋雞的糖、脂代謝，進(jìn)一步證實(shí)槲皮素在改善肥胖和糖尿病方面的有益作用。

4 結(jié) 論

飼糧中添加100～600 mg/kg槲皮素可線性增加產(chǎn)蛋中后期蛋雞血清脂聯(lián)素和瘦素含量，降低血清和肝臟甘油三酯含量，調(diào)節(jié)糖、脂代謝，減少腹脂沉積，改善蛋殼腺正常分泌功能，進(jìn)而改善產(chǎn)蛋中后期蛋品質(zhì)。在本試驗(yàn)條件下，飼糧中添加300 mg/kg槲皮素對蛋雞的作用效果最佳。