任羽羽，王立娟，陳 楠，袁啟鳳，馬玉華

(1 貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴陽，550025；2 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹科學(xué)研究所，貴陽，550006)

百香果又稱西番蓮PassifloracoeruleaL.，原產(chǎn)自南美洲，是西番蓮科(Passifloraceae)西番蓮屬的一種藤本植物[1]。我國臺灣于1901年引入百香果，目前在臺灣、福建、廣東、廣西、重慶、云南和貴州等地都有栽培[2]。百香果因其具有多種水果香味而得名，蘊(yùn)含豐富的營養(yǎng)價值[3]，加上百香果當(dāng)年種植當(dāng)年結(jié)果，具有產(chǎn)值高和見效快等特點(diǎn)[4]。

病毒病害是引起百香果品質(zhì)降低和減產(chǎn)的重要因素，可造成葉片花葉、畸形、黃化、斑駁，以及果實畸形、木質(zhì)化等癥狀[5]。百香果以無性繁殖為主，隨著百香果品種增多和大面積推廣種植，加快了病毒病的蔓延。目前國內(nèi)外已報道32種可侵染百香果的病毒，我國主要有10種。Cheng等[6]最早在臺灣地區(qū)檢測出大戟曲葉病毒(Euphorbialeafcurlvirus，ELCV)和廣東番木瓜曲葉病毒(PapayaleafcurlGuangdongvirus，PaLCuGdV)兩種雙生病毒屬病毒；徐平東等[7]等、謝麗雪等[8-9]和Xie等[10]在福建地區(qū)百香果上檢測到黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)、夜來香花葉病毒(Telosmamosaicvirus，TeMV)、東亞西番蓮病毒(EastAsianPassifloravirus，EAPV)和西番蓮嚴(yán)重斑駁相關(guān)病毒(Passionfruitseveremottle-associatedvirus，PfSMAV)。謝慧婷等[11]、李戰(zhàn)彪等[12]和黃誠梅等[13]在廣西地區(qū)百香果上檢測到CMV、TeMV、EAPV、EuLCV(一品紅曲葉病毒，Euphorbialeafcurlvirus)、PaLCuGdV和PWV(西番蓮木質(zhì)化病毒，Passionfruitwoodinessvirus)；宋若楠等[14]和Chen等[15]在廣東地區(qū)檢測到西番蓮斑駁病毒(Passionfruitmottlevirus，PaMV)和蕪菁花葉病毒(Turnipmosaicvirus，TuMV)；張紹康等[16]在廣西和云南省的百香果上檢測到南瓜蚜傳黃化病毒(Cucurbitaphid-borneyellowvirus，CABYV)。嚴(yán)佳文等[17]在貴州地區(qū)檢測到 CMV和TeMV，從而首次為貴州百香果感染病毒病提供了依據(jù)。前期通過對疑似病毒侵染的百香果樣品進(jìn)行高通量測序和病毒種類鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)混樣中存在TeMV、EAPV和西番蓮潛隱病毒(Passifloralatentcarlavirus，PLV)這3種病毒，且病毒含量較高，其他病毒含量極低，檢測結(jié)果中并未發(fā)現(xiàn)CMV。本研究通過調(diào)查TeMV、EAPV和PLV在貴州百香果上的發(fā)生、分布，以期為后期百香果病毒病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2020年6月至2021年6月，在貴州省鎮(zhèn)寧縣、貞豐縣、關(guān)嶺縣和羅甸縣百香果主要種植地采集主要表現(xiàn)葉片斑駁、皺縮及黃化等疑似感病癥狀的百香果葉片105份，所有葉片均用液氮處理后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取 采用RNA提取試劑盒(普洛麥格北京生物技術(shù)有限公司產(chǎn))，參照說明書提取百香果葉片總RNA。利用超微量分光光度計(IMPLEN)測定提取核酸的濃度和純度，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的總RNA質(zhì)量。檢測合格的總RNA使用反轉(zhuǎn)錄試劑(Thermo Scientific)合成cDNA，具體步驟參照說明書，最后保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物合成 根據(jù)GenBank中夜來香花葉病毒TeMV(DQ851493)、東亞西番蓮病毒EAPV(AB246773)和西番蓮潛隱病毒PLV(MT723990)基因組序列，利用Primer Premier 5.0軟件，針對TeMV、EAPV和PLV的CP基因設(shè)計特異性引物，引物設(shè)計后經(jīng)Blast比對保證其特異性，由上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行合成(見表1)。

表1 3種病毒RT-PCR檢測特異性引物

1.2.3 cDNA合成及PCR擴(kuò)增 以提取總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。檢測反應(yīng)體系包括：Dream Taq Green PCR Master Mix(2×)為10 μL，上下游引物(10 μmol/L)為0.5 μL，cDNA為2 μL，用ddH2O補(bǔ)足后混合均勻，總體積為 20 μL。具體反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。

1.2.4 PCR產(chǎn)物測序分析 采用DNA凝膠回收試劑盒(大連TaKaRa寶生物有限公司產(chǎn))將目的片段進(jìn)行回收純化，將純化回收后的PCR產(chǎn)物送測序，將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫里序列進(jìn)行Blast比對分析。

1.2.5 病毒RT-PCR體系靈敏性檢測 以復(fù)合感染3種病毒的百香果總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為試驗樣本，按照10倍梯度稀釋法依次將模板稀釋為10、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，在上述體系及條件下分別對3種病毒引物靈敏性進(jìn)行分析。

1.2.6 RT-PCR檢測方法的應(yīng)用 從貴州省鎮(zhèn)寧縣、貞豐縣、關(guān)嶺縣和羅甸縣百香果種植地中隨機(jī)共采集疑似感病的百香果樣品105份，應(yīng)用RT-PCR方法對樣品進(jìn)行檢測，統(tǒng)計分析檢測結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取質(zhì)量

試驗提取樣品總RNA的OD 260/OD 280比值均在1.9～2.2范圍內(nèi)，表明總RNA質(zhì)量合格，可滿足后續(xù)試驗要求。

2.2 3種病毒RT-PCR擴(kuò)增

結(jié)果顯示，各引物對均能擴(kuò)增出特異性條帶，條帶位置與預(yù)期產(chǎn)物大小(463、559和261 bp)基本吻合，條帶清晰無雜帶(見圖1)。

注：M.DNA marker，1.TeMV，2.EAPV，3.PLV，4.對照(空白)。

2.3 RT-PCR的特異性分析

測序結(jié)果顯示，3種病毒核苷酸序列與已報道的TeMV、EAPV和PLV序列有較高的相似性，其中，TeMV、EAPV和PLV與已報道分離物核苷酸序列相似性分別為98.6%(KJ789129)，99.4%(MG650164)和94.9%(MT723990)。結(jié)果表明，試驗所用的引物適用于TeMV、EAPV和PLV的檢測。

2.4 RT-PCR的靈敏性分析

TeMV、EAPV和PLV 3種病毒的cDNA的稀釋極限分別為10-5、10-4和10-6。因此，在cDNA的10-4稀釋液中能同時檢測到TeMV、EAPV和PLV 3種病毒，利用超微量分光光度計測得cDNA的10-4稀釋液最低濃度約89.65 ng/μL(見圖2)。

注：A.TeMV，B.EAPV，C.PLV，M.DNA marker；1～7.依次為10、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7cDNA稀釋液。

2.5 RT-PCR技術(shù)檢測百香果感病情況

選擇健康植株的RNA提取物作為陰性對照，檢測結(jié)果正常，未擴(kuò)增出條帶。應(yīng)用RT-PCR方法對貴州省主要百香果種植地百香果進(jìn)行檢測，統(tǒng)計檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，百香果感染了多種病毒，其中TeMV病毒侵染率最高，高達(dá)100%；其次EAPV病毒，侵染率高達(dá)81.9%；而PLV病毒侵染率為74.3%。

105份百香果樣品中，所有地區(qū)的樣品均檢測到TeMV；鎮(zhèn)寧縣、貞豐縣和羅甸縣等地的EAPV與PLV的檢出率較高，達(dá)到80%以上；關(guān)嶺縣15份樣品均未檢出EAPV，且僅有20%的樣品檢測到PLV(見表2)。說明貴州省采樣的4個主產(chǎn)區(qū)百香果均受到不同程度的病毒侵染，部分地區(qū)病毒侵染情況嚴(yán)重。

表2 貴州省百香果樣品中病毒檢測結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本研究前期通過高通量測序方法對采集的疑似病毒侵染的百香果樣品進(jìn)行病毒種類鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種主要病毒分別為TeMV、EAPV和PLV。目前對TeMV和EAPV兩種病毒的報道較多，謝麗雪等[9-10]首次報道侵染百香果的TeMV和EAPV的陽性檢出率僅為1.8%和1.7%；謝慧婷等[12]對廣西地區(qū)百香果進(jìn)行檢測時發(fā)現(xiàn)，TeMV和EAPV的陽性檢出率分別為64.2%和41.3%。本研究中，TeMV和EAPV檢出率分別為100%和81.9%，遠(yuǎn)高于之前的研究結(jié)果?？赡苁欠N苗主要來源于廣西和福建地區(qū)，也可能是本研究采集的樣品相對較多，加上貴州地區(qū)百香果種植面積較大，導(dǎo)致病毒傳播速度快。目前這2種病毒在種植區(qū)普遍存在，是感染百香果的優(yōu)勢病毒。

目前國內(nèi)鮮有PLV侵染百香果的明確報道。PLV侵染百香果后，感病植株主要表現(xiàn)為不明顯的系統(tǒng)性花葉癥狀，老葉出現(xiàn)斑駁癥狀[18]。本研究通過RT-PCR方法檢測到的PLV陽性檢出率較高。究其原因可能有幾點(diǎn)：(1)百香果原產(chǎn)自南美洲，貴州地區(qū)種植的品種均來自外地引種栽培，且繁殖方式主要以扦插或嫁接為主，無性繁殖方式容易積累病毒；(2)目前百香果的種植地集中分布南方地區(qū)，品種也比較單一，加上沒有建立有效的脫毒體系，因此苗木容易帶有病毒；(3)目前生產(chǎn)上缺乏對百香果病毒檢疫和防范意識，引種時未考慮病毒檢測，田間管理缺乏病毒病預(yù)防相關(guān)措施；(4)貴州百香果近些年發(fā)展快速，對苗木需求量大，苗木引種多從廣西和福建等地引進(jìn)，引種過程中容易受到病毒侵染。

本研究應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測到貴州各地區(qū)侵染百香果病毒的情況，且病毒多以復(fù)合侵染為害百香果。因此，后期需要建立完善的脫毒體系，加強(qiáng)對百香果種苗的檢測；同時提高百香果栽培管理水平，預(yù)防病毒病發(fā)生，從而保障百香果種苗健康生長，促進(jìn)貴州百香果產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展。