歐琳 張余 陳曉芳 周剛 黃宇宏 陳蕾 肖調(diào)義 劉巧林

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 湖南省特色水產(chǎn)資源利用工程技術(shù)研究中心，湖南長(zhǎng)沙 410128)

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)俗稱小龍蝦，隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門、甲殼綱、十足目、螯蝦科、原螯蝦屬，原產(chǎn)于美國，現(xiàn)已成為我國重要的淡水養(yǎng)殖蝦類[1-5]。該蝦肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，深受市場(chǎng)歡迎，是近幾年夏季消費(fèi)的“網(wǎng)紅”產(chǎn)品[6-7]。湖南省是我國克氏原螯蝦的主要養(yǎng)殖省份之一，小龍蝦養(yǎng)殖已成為當(dāng)?shù)禺a(chǎn)值超百億元人民幣的特色新產(chǎn)業(yè)，其中洞庭湖區(qū)的益陽、岳陽、常德等3市為主要產(chǎn)區(qū)?？耸显r種質(zhì)資源的研究對(duì)其保護(hù)和利用、提高養(yǎng)殖產(chǎn)量、良種選育等具有重要意義[8]。開展對(duì)克氏原螯蝦群體遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳變異的相關(guān)研究，有助于豐富其種質(zhì)資源多樣性，保證相關(guān)產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

近年來，分子生物學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，不僅被國內(nèi)廣大學(xué)者廣泛應(yīng)用于水生生物遺傳學(xué)分析[9-13]，還被國外學(xué)者大量應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種研究[14-18]。動(dòng)物的線粒體DNA分子量較小，結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，進(jìn)化速度較快，遵循嚴(yán)格的母系遺傳，是進(jìn)行群體研究的理想材料[19]。其中，細(xì)胞色素b(Cytb)基因和細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)基因的長(zhǎng)度和進(jìn)化速率適宜，常被用于群體遺傳學(xué)研究[20-23]。本研究基于以上兩種基因，對(duì)洞庭湖區(qū)岳陽華容縣和益陽南縣2處主養(yǎng)殖區(qū)共11個(gè)采集點(diǎn)的克氏原螯蝦群體進(jìn)行了遺傳多樣性分析，以期豐富克氏原螯蝦種質(zhì)資源的研究數(shù)據(jù)，為洞庭湖區(qū)克氏原螯蝦的綜合養(yǎng)殖和育種研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣本采集

樣本采集點(diǎn)參照當(dāng)?shù)匦竽了a(chǎn)局提供的養(yǎng)殖小龍蝦大戶或合作社名單確定。在岳陽市華容縣選取6個(gè)采集點(diǎn)，共計(jì)180個(gè)樣本；益陽市南縣選取5個(gè)采集點(diǎn)，共計(jì)150個(gè)樣本。樣本個(gè)體健壯，生長(zhǎng)良好，附肢齊全，顏色呈暗紅或黑紅，體表光澤度好。剪取樣本的肌肉組織，置于1.5 mL離心管中，-80 ℃冷凍保存。

1.2 DNA提取

根據(jù)Tissue DNA Kit(D3396-01)試劑盒上的說明提取樣本DNA。

1.3 Cytb和COⅠ基因擴(kuò)增與測(cè)序

反應(yīng)引物及序列見表1。PCR反應(yīng)體系為：1 μL DNA，0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物，10 μL 2×TaqDNA poly-merase Mix，8 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35次循環(huán)；72 ℃延伸5 min，于4 ℃保存。

表1 基因擴(kuò)增引物

將得到的產(chǎn)物用加入1%瓊脂糖凝膠液的凝膠板通電進(jìn)行電泳(60～100 V，40 min)，電泳完畢后，將凝膠進(jìn)行染色，用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

將含有目的條帶的產(chǎn)物送到武漢奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

測(cè)序所得各片段用GENEIOUS 9.13軟件進(jìn)行序列的雙向拼接并校對(duì)，排查刪除錯(cuò)誤片段，截取等長(zhǎng)的有效片段，導(dǎo)出fasta文件用于后期單倍型分析。通過DnaSp 5.0軟件進(jìn)行遺傳多樣性參數(shù)分析。通過MEGA 7.0軟件采用鄰接法(neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，同時(shí)對(duì)11個(gè)采集點(diǎn)樣本之間的遺傳距離進(jìn)行簡(jiǎn)要分析。

2 結(jié)果

2.1 Cytb基因序列分析

2.1.1 堿基組成

經(jīng)質(zhì)量檢測(cè)，在所提取的克氏原螯蝦基因組DNA中，華容縣采集點(diǎn)獲得179個(gè)有效樣本，益陽南縣采集點(diǎn)獲得149個(gè)有效樣本。PCR擴(kuò)增后，經(jīng)雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)雙向拼接并校對(duì)，排查刪除錯(cuò)誤片段后，截取等長(zhǎng)的有效Cytb基因序列為762 bp，堿基平均含量由高到低依次為：T(34.08%)、A(31.08%)、C(18.51%)、G(16.33%)，其中A+T的含量(65.16%)明顯高于G+C的含量(34.84%)。這說明11個(gè)采集點(diǎn)的克氏原螯蝦在Cytb基因的堿基組成上表現(xiàn)出一定的偏向性。

2.1.2 遺傳多樣性參數(shù)

11個(gè)采集點(diǎn)Cytb基因的遺傳多樣性參數(shù)見表2。結(jié)果表明，11個(gè)采集點(diǎn)的克氏原螯蝦的遺傳多樣性指數(shù)略有差異，華容縣6個(gè)采集點(diǎn)克氏原螯蝦的遺傳多樣性指數(shù)要高于南縣5個(gè)采集點(diǎn)的，總體表現(xiàn)出較低的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性。

表2 11個(gè)采集點(diǎn)Cytb基因的遺傳多樣性參數(shù)

2.1.3 單倍型分布及系統(tǒng)進(jìn)化樹

在不包含空白與缺失位點(diǎn)的檢測(cè)下，11個(gè)采集點(diǎn)共檢測(cè)出5個(gè)單倍型(見表3)。其中，南縣5個(gè)采集點(diǎn)的克氏原螯蝦群體存在3個(gè)單倍型，而華容縣6個(gè)采集點(diǎn)的克氏原螯蝦群體存在4個(gè)單倍型。結(jié)果顯示，Hap1、Hap3為11個(gè)采集點(diǎn)所共有，Hap2、Hap4為華容縣6個(gè)采集點(diǎn)所特有，Hap5為南縣5個(gè)采集點(diǎn)所特有，單倍型以Hap1(62.2%)為主。

表3 11個(gè)采集點(diǎn)Cytb基因單倍型在群體中的分布

基于Kimura 2-Parameter模型，以鄰接法構(gòu)建克氏原螯蝦11個(gè)采集點(diǎn)Cytb基因的單倍型系統(tǒng)進(jìn)化樹(見圖1)，設(shè)置檢驗(yàn)次數(shù)為1 000次。結(jié)果顯示，Hap2和Hap3最先聚為1支，然后與Hap1聚為1支，接著與Hap4聚為1支，最后和Hap5聚為1支。結(jié)果表明，11個(gè)采集點(diǎn)的克氏原螯蝦群體聚類在一起，不存在明顯的遺傳分化。

注：HR表示華容縣樣本，NX表示南縣樣本。

2.1.4 遺傳距離

11個(gè)采集點(diǎn)Cytb基因的遺傳距離見表4。結(jié)果顯示，華容縣6個(gè)采集點(diǎn)的克氏原螯蝦的種內(nèi)遺傳距離(0.551)大于11個(gè)采集點(diǎn)間的遺傳距離(0.535)，而南縣5個(gè)采集點(diǎn)的克氏原螯蝦的種內(nèi)遺傳距離(0.519)相較于11個(gè)采集點(diǎn)間的遺傳距離又偏小。試驗(yàn)表明，11個(gè)采集點(diǎn)之間不存在明顯的遺傳分化(P>0.05)。

表4 11個(gè)采集點(diǎn)Cytb基因的遺傳距離

2.2 COⅠ基因序列分析

2.2.1 堿基組成

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)雙向測(cè)序、拼接校對(duì)，排查刪除錯(cuò)誤片段后，截取等長(zhǎng)有效COⅠ基因序列為847 bp，堿基平均含量由高到低依次為：T(40.00%)、A(26.90%)、G(18.55%)、C(13.50%)，其中A+T的含量(66.90%)明顯高于G+C的含量(32.05%)。這表明11個(gè)采集點(diǎn)的克氏原螯蝦COⅠ基因存在著明顯的T/A堿基偏向。

2.2.2 遺傳多樣性參數(shù)

11個(gè)采集點(diǎn)COⅠ基因的遺傳多樣性參數(shù)見表5。結(jié)果表明，11個(gè)采集點(diǎn)COⅠ基因的遺傳多樣性參數(shù)略有差異，華容縣6個(gè)采集點(diǎn)克氏原螯蝦的遺傳多樣性高于南縣5個(gè)采集點(diǎn)的克氏原螯蝦，總體表現(xiàn)出較低的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性。

表5 11個(gè)采集點(diǎn)COⅠ基因的遺傳多樣性參數(shù)

2.2.3 單倍型分布及系統(tǒng)進(jìn)化樹

在不包含空白與缺失位點(diǎn)的檢測(cè)下，11個(gè)采集點(diǎn)共檢測(cè)出9個(gè)單倍型(見表6)。其中南縣5個(gè)采集點(diǎn)的克氏原螯蝦群體存在5個(gè)單倍型，而華容縣6個(gè)采集點(diǎn)的克氏原螯蝦群體存在6個(gè)單倍型。結(jié)果顯示，Hap1、Hap3、Hap7、Hap8、Hap9為11個(gè)采集點(diǎn)所共有，Hap4、Hap5為華容縣6個(gè)采集點(diǎn)所特有，Hap2、Hap6為南縣5個(gè)采集點(diǎn)所特有，單倍型以Hap1(86.1%)為主。

表6 11個(gè)采集點(diǎn)COⅠ基因單倍型在群體中的分布

基于Kimura 2-Parameter模型以鄰接法構(gòu)建克氏原螯蝦11個(gè)采集點(diǎn)COⅠ基因的單倍型系統(tǒng)進(jìn)化樹(見圖2)，檢驗(yàn)次數(shù)設(shè)置為1 000次。結(jié)果顯示，克氏原螯蝦分為2大支，Hap1至Hap6聚為1大支，Hap7、Hap8和Hap9形成另1個(gè)大分支。結(jié)果表明，11個(gè)采集點(diǎn)的克氏原螯蝦群體之間并無明顯的遺傳分化。

注：HR表示華容縣樣本，NX表示南縣樣本。

2.2.4 遺傳距離

11個(gè)采集點(diǎn)COⅠ基因的遺傳距離見表7。結(jié)果表明，華容縣6個(gè)采集點(diǎn)克氏原螯蝦的種內(nèi)遺傳距離(0.122)大于11個(gè)采集點(diǎn)間的遺傳距離(0.114)，而南縣5個(gè)采集點(diǎn)克氏原螯蝦的種內(nèi)遺傳距離(0.099)相較于11個(gè)采集點(diǎn)間的遺傳距離偏小。結(jié)果表明，11個(gè)采集點(diǎn)克氏原螯蝦群體之間遺傳分化不顯著。

表7 11個(gè)采集點(diǎn)COⅠ基因的遺傳距離

3 討論

3.1 序列特征

本研究從線粒體Cytb和COⅠ基因序列分析入手，探討洞庭湖區(qū)養(yǎng)殖克氏原螯蝦的遺傳多樣性。經(jīng)基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增、序列測(cè)定、序列拼接和序列比對(duì)分析，最終獲得的Cytb和COⅠ基因長(zhǎng)度分別為762 bp和847 bp。在以上兩種基因的堿基組成中，A和T的總含量均明顯高于G和C的總含量。這表明克氏原螯蝦線粒體基因序列的堿基組成成分并不均一，具有較強(qiáng)的偏向性。在其他十足目物種中也存在同樣的規(guī)律[24-26]。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因可能是基因長(zhǎng)度和基因表達(dá)水平存在較大的差異。

3.2 遺傳多樣性

在遺傳多樣性參數(shù)中，單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)常常被用來評(píng)價(jià)群體遺傳多樣性水平的高低[27-28]。本研究中，基于Cytb基因序列在華容縣的6個(gè)采集點(diǎn)中，克氏原螯蝦的單倍型多樣性指數(shù)為0.506，核苷酸多樣性指數(shù)為0.272 65；在南縣的5個(gè)采集點(diǎn)中，克氏原螯蝦的單倍型多樣性指數(shù)為0.467，核苷酸多樣性指數(shù)為0.259 74?；贑OⅠ基因序列在華容縣的6個(gè)采集點(diǎn)中，克氏原螯蝦的單倍型多樣性指數(shù)為0.258，核苷酸多樣性指數(shù)為0.136 1；在南縣的5個(gè)采集點(diǎn)中，克氏原螯蝦的單倍型多樣性指數(shù)為0.244，核苷酸多樣性指數(shù)為0.122 3。上述數(shù)據(jù)表明，11個(gè)采集點(diǎn)的克氏原螯蝦群體總體呈現(xiàn)出較低的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性。這一結(jié)果與我國長(zhǎng)江中下游流域克氏原螯蝦群體遺傳多樣性的研究結(jié)果不一致[29-30]，說明洞庭湖區(qū)養(yǎng)殖克氏原螯蝦的種質(zhì)來源比較單一。此外，根據(jù)Cytb基因序列得到的遺傳多樣性水平高于根據(jù)COⅠ基因序列得到的遺傳多樣性水平。這一現(xiàn)象的出現(xiàn)可能是因?yàn)镃ytb基因相較于COⅠ基因變異速率快，這與其他的研究結(jié)果較為一致[31-32]。

在本研究中，單倍型系統(tǒng)進(jìn)化樹和遺傳距離的結(jié)果均表明，洞庭湖區(qū)11個(gè)采集點(diǎn)克氏原螯蝦群體的遺傳分化并不顯著，其共有單倍型數(shù)量較多，存在一定的基因交流。11個(gè)采集點(diǎn)克氏原螯蝦的遺傳結(jié)構(gòu)不同表現(xiàn)在兩個(gè)方面：(1)單倍型數(shù)量不同?；贑ytb基因序列的單倍型南縣(5個(gè)采集點(diǎn))有3個(gè)，華容縣(6個(gè)采集點(diǎn))有4個(gè)?；贑OⅠ基因序列的單倍型南縣(5個(gè)采集點(diǎn))有5個(gè)，華容縣(6個(gè)采集點(diǎn))有6個(gè)；(2)優(yōu)勢(shì)單倍型占比差異較大?；贑ytb基因序列的優(yōu)勢(shì)單倍型為62.2%，基于COⅠ基因序列的優(yōu)勢(shì)單倍型為86.1%，這種差異導(dǎo)致洞庭湖區(qū)養(yǎng)殖克氏原螯蝦遺傳多樣性不豐富。

遺傳多樣性越豐富，物種對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力就越強(qiáng)，而遺傳多樣性降低對(duì)物種的生存極有可能造成不良的影響，甚至使其走向滅亡[33-35]。外來物種在入侵的過程中常常會(huì)經(jīng)歷遺傳漂變或“瓶頸”效應(yīng)，表現(xiàn)為遺傳多樣性偏低[36]。對(duì)于克氏原螯蝦這類外來物種，可以考慮其來源地和引入地，通過多次引種或雜交，提高其遺傳多樣性。