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        Toll樣受體4及其調(diào)控的信號通路關(guān)鍵因子在HIV合并馬爾尼菲籃狀菌感染患者單核巨噬細胞中的表達水平及臨床意義▲

        2022-06-09 06:44:50羅朝蓮韋吳迪陳榮鳳蔣俊俊
        廣西醫(yī)學(xué) 2022年7期
        關(guān)鍵詞:水平

        陳 潔 羅朝蓮,2 韋吳迪 陳榮鳳 梁 浩 蔣俊俊,3

        (1 廣西醫(yī)科大學(xué)再生醫(yī)學(xué)與醫(yī)用生物資源開發(fā)應(yīng)用省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心&廣西艾滋病防治研究重點實驗室,南寧市 530021,電子郵箱:1527692073@qq.com;2 四川省婦幼保健院婦幼健康管理部,成都市 610045;3 廣西南寧市第四人民醫(yī)院,南寧市 530023)

        AIDS由HIV感染所致,是全球重大的公共衛(wèi)生問題之一。2020年全球有3 770萬人感染HIV,約有68萬人死于AIDS相關(guān)疾病[1]。馬爾尼菲籃狀菌(Talaromycesmarneffei,T.marneffei)感染是好發(fā)于AIDS患者的機會性真菌感染之一[2]。研究表明Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)4信號通路可以抵抗真菌感染[3]。TLR4識別抗原后通過激活宿主免疫細胞的兩大受體蛋白,即髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)和β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白,從而被招募到巨噬細胞等免疫細胞膜表面,引起早期核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)的活化或晚期干擾素的產(chǎn)生[4]。但是TLR4信號通路是否在HIV合并T.marneffei感染患者中發(fā)揮抗T.marneffei的作用,目前尚未可知。本研究通過檢測HIV合并T.marneffei感染患者與單純HIV感染患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中巨噬細胞(單核巨噬細胞)的TLR4及其調(diào)控的信號通路關(guān)鍵分子的表達水平,探討TLR4信號通路與HIV合并T.marneffei感染的相關(guān)性。

        1 資料與方法

        1.1 臨床資料 遵循知情同意的原則,選取在南寧市第四人民醫(yī)院確診為HIV感染但未經(jīng)抗病毒治療的35例住院患者作為研究對象,其中男性23例、女性12例。納入標準:(1)18周歲以上;(2)HIV抗體陽性;(3)知情并同意參加本研究。排除標準:(1)曾接受抗病毒治療;(2)近期曾接受抗真菌治療。T.marneffei感染的診斷標準:具有T.marneffei感染相應(yīng)的癥狀和體征、影像學(xué)表現(xiàn),以及血液和/或痰液、肺泡灌洗液、腦脊液等體液經(jīng)真菌培養(yǎng)證實為T.marneffei感染或組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)T.marneffei。根據(jù)是否合并T.marneffei感染將患者分為合并T.marneffei感染組(15例)和單純HIV感染組(20例)。本研究獲得廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。

        1.2 資料收集 收集研究對象的電子病歷資料,包括年齡、性別、吸毒情況、合并癥情況、CD4+T淋巴細胞計數(shù)和病毒載量等信息。其中CD4+T淋巴細胞計數(shù)、病毒載量由南寧市第四人民醫(yī)院檢驗科分別應(yīng)用流式細胞儀(美國BD公司,型號:CytoFLEX2)和BD PharmingenTMAPC Mouse anti-Human CD4試劑盒(美國BD公司,生產(chǎn)批號:555349 )、全自動病毒載量分析儀(美國Roche公司,型號:COBAS TaqMan 48)和COBAS TaqMan HIV-1 Test v2.0核酸定量檢測試劑盒(美國Roche公司,生產(chǎn)批號:T01352)進行檢測。

        1.3 相關(guān)蛋白表達情況的檢測

        1.3.1 標本的采集與PBMC的分離:采集研究對象外周靜脈血20 mL,運用Ficoll梯度密度法分離PBMC[5],采用細胞計數(shù)板法計數(shù)后以磷酸緩沖鹽溶液(武漢博士德生物工程有限公司,生產(chǎn)批號:PYG0021)將細胞稀釋至1×104個/μL備用。

        1.3.2 流式細胞術(shù)檢測單核巨噬細胞中相關(guān)蛋白的表達情況:(1)取1×106個/100 μL 1.3.1中的PBMC懸液分裝6管,用于細胞內(nèi)蛋白流式抗體染色。先將CD68抗體(FITC Mouse anti-Human CD68;美國BD公司,生產(chǎn)批號:562117)加入檢測管用于標記人PBMC中的巨噬細胞,然后分別加入TLR2抗體(FITC anti-Human CD282 TLR2 Antibody;美國BD公司,生產(chǎn)批號:392308)、TLR4抗體(PE Mouse anti-Human CD284 TLR4 Antibody;美國BD公司,生產(chǎn)批號:564215)、TLR9抗體(APC Rat anti-Human TLR9 Antibody;美國BD公司,生產(chǎn)批號:560428)、TANK結(jié)合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)抗體(PE Mouse anti-TBK1;美國BD公司,生產(chǎn)批號:558696)。設(shè)立空白組,只破膜,不做其他處理。(2)另取1.25×107個/100 μL 1.3.1中的PBMC懸液分裝5管,用于細胞外分泌蛋白流式抗體染色。于檢測管中分別加入γ干擾素抗體(PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-Human IFN-γ;美國BD公司,生產(chǎn)批號:560742)、白細胞介素6(interleukin 6,IL-6)抗體(APC Rat anti-Human IL-6 Clone MQ2-13A5;美國BD公司,生產(chǎn)批號:561441)、MyD88抗體(MyD88 Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody SC65-04;美國Thermo Fisher Scientific公司,生產(chǎn)批號:560431)、干擾素調(diào)節(jié)因子7(interferon regulatory factor 7,IRF7)抗體(Alexa Fluor 488 Mouse anti-IRF-7;美國BD公司,生產(chǎn)批號:558707),空白管不加抗體,4℃避光孵育30 min。(3)CD68抗體的濃度是0.5 mg/mL,加入量為5 μL;TLR2抗體的濃度是1.0 mg/mL,加入量為5 μL;TLR4抗體的濃度是0.5 mg/mL,加入量為5 μL;TLR9抗體的濃度是2.0 mg/mL,加入量為20 μL;TBK1抗體的濃度是1.0 mg/mL,加入量為20 μL;γ干擾素抗體的濃度是0.25 mg/mL,加入量為5 μL;IL-6抗體的濃度是0.25 mg/mL,加入量為5 μL;MyD88抗體的濃度是1 mg/mL,加入量為2 μL;IRF7抗體的濃度是1.0 mg/mL,加入量為20 μL。加入相應(yīng)的抗體后應(yīng)用CytoFLEX流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司,型號:CytoFLEX2)上機檢測。相關(guān)蛋白的表達量以平均熒光強度(mean fluorescent intensity,MFI)表示。

        1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用Excel 2013與SPSS 23.0軟件包建立數(shù)據(jù)庫并進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例數(shù)和百分率(%)表示,組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法;正態(tài)分布的計量資料以(x±s)表示,組間比較采用兩獨立樣本t檢驗;偏態(tài)分布的計量資料以[M(P25,P75)]表示,組間比較采用Wilcoxon符號秩和檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié) 果

        2.1 兩組患者基本信息的比較 兩組患者的性別、吸毒情況、合并肺炎的比例、合并肺結(jié)核的比例、口腔念珠菌感染率、合并慢性肝炎(HBV或HCV)的比例、巨細胞病毒感染率、皰疹病毒感染率、合并腦膜炎的比例比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05),而單純HIV感染組患者的年齡大于合并T.marneffei感染組(P<0.05),提示兩組年齡不具備可比性,這可能是因為納入的樣本量太小。合并T.marneffei感染組的CD4+T淋巴細胞計數(shù)低于單純HIV感染組(P<0.05);合并T.marneffei感染組的HIV病毒載量高于單純HIV感染組,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

        表1 兩組研究對象的基本信息的比較

        2.2 兩組患者單核巨噬細胞中TLR2、TLR4、TLR9蛋白表達水平的比較 合并T.marneffei感染組患者單核巨噬細胞中TLR4蛋白的表達水平高于單純HIV感染組患者(P<0.05);而兩組患者單核巨噬細胞中TLR2和TLR9蛋白的表達水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表2。

        表2 兩組單核巨噬細胞中TLR2、TLR4、TLR9蛋白表達水平的比較(MFI)

        2.3 兩組患者單核巨噬細胞中MyD88、TBK1、IRF7、IL-6、γ干擾素蛋白表達水平的比較 合并T.marneffei感染組患者單核巨噬細胞中TLR4信號通路中間因子MyD88、TBK1、IRF7蛋白及下游炎癥因子IL-6、γ干擾素蛋白的表達水平均高于單純HIV感染組患者(均P<0.05)。見表3。

        表3 兩組單核巨噬細胞中MyD88、TBK1、IRF7、IL-6、γ干擾素蛋白表達水平的比較(MFI)

        2.4 兩組不同CD4+T淋巴細胞計數(shù)患者單核巨噬細胞中TLR4、TBK1、MyD88、IRF7、IL-6、γ干擾素蛋白表達水平的比較 合并T.marneffei感染組中有14例患者的CD4+T淋巴細胞計數(shù)<200個/μL且均<100個/μL;單純HIV感染組中有16例患者的CD4+T淋巴細胞計數(shù)<200個/μL,其中9例患者的CD4+T淋巴細胞計數(shù)<100個/μL。在CD4+T淋巴細胞計數(shù)<200個/μL的患者中和CD4+T淋巴細胞計數(shù)<100個/μL的患者中,合并T.marneffei感染組的TLR4蛋白表達水平,TLR4信號通路中間因子TBK1、MyD88、IRF7的蛋白表達水平均高于單純HIV感染組,且在CD4+T淋巴細胞計數(shù)<200個/μL的患者中,合并T.marneffei感染組的γ干擾素蛋白表達水平高于單純HIV感染組,在CD4+T淋巴細胞計數(shù)<100個/μL的患者中,合并T.marneffei感染組的IL-6蛋白表達水平高于單純HIV感染組(均P<0.05)。見表4、表5。

        表4 兩組CD4+T淋巴細胞計數(shù)<200個/μL患者單核巨噬細胞中TLR4、TBK1、MyD88、IRF7、IL-6、γ干擾素蛋白表達水平的比較(MFI)

        表5 兩組CD4+T淋巴細胞計數(shù)<100個/μL患者單核巨噬細胞中TLR4、TBK1、MyD88、IRF7、IL-6、γ干擾素蛋白表達水平的比較(MFI)

        3 討 論

        已有學(xué)者發(fā)現(xiàn),CD4+T淋巴細胞水平低的AIDS患者更容易發(fā)生機會性感染, 其中CD4+T淋巴細胞計數(shù)<200個/μL的AIDS患者更容易發(fā)生T.marneffei感染,而抗病毒治療不能顯著降低AIDS患者感染T.marneffei的風(fēng)險[6]。由此可見,AIDS患者發(fā)生T.marneffei感染等機會性感染的主要原因可能是CD4+T淋巴細胞計數(shù)降低,尤其當(dāng)CD4+T淋巴細胞計數(shù)<200個/μL時。本研究結(jié)果也顯示,合并T.marneffei感染組患者的CD4+T淋巴細胞計數(shù)低于單純HIV感染組(P<0.05),并且合并T.marneffei感染組患者的CD4+T淋巴細胞計數(shù)大部分小于100個/μL,這與Chen等[7]的研究結(jié)果相似,提示HIV合并T.marneffei感染患者的CD4+T淋巴細胞計數(shù)更低。

        研究顯示,TLR家族能增強宿主對致病性真菌的免疫應(yīng)答反應(yīng)[8],TLR4和CD14可作為宿主對新生隱球菌、白色念珠菌等真菌產(chǎn)生免疫應(yīng)答的受體[9]。本研究結(jié)果顯示,HIV合并T.marneffei感染患者單核巨噬細胞中TLR4蛋白表達水平明顯高于單純HIV感染的患者(P<0.05),這可能與T.marneffei感染單核巨噬細胞后激活細胞表面的TLR4受體而產(chǎn)生免疫應(yīng)答有關(guān)。

        MyD88是除TLR3之外的其余TLR信號通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)接分子,是TLR4信號通路中信號傳向下游必不可少的靶分子[10-11]。有研究顯示,免疫重建不良的HIV合并結(jié)核病患者的細胞因子失調(diào)是由TLR4/MyD88信號通路介導(dǎo)的[12],可見在免疫重建不良的患者中TLR4/MyD88信號通路介導(dǎo)機體免疫的過度激活。本研究結(jié)果也顯示HIV合并T.marneffei感染患者的MyD88蛋白表達水平高于單純HIV感染患者(P<0.05),原因可能是TLR4/MyD88信號通路在T.marneffei感染后過度激活,使下游炎癥因子IL-6釋放增加,從而增強機體對T.marneffei感染的免疫應(yīng)答,而持續(xù)的慢性免疫激活是引起免疫失衡的重要原因。當(dāng)病毒核酸或其中間代謝產(chǎn)物與模式識別受體結(jié)合,可募集相應(yīng)的接頭蛋白、線粒體抗病毒信號蛋白、干擾素基因刺激因子和β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白來活化TBK1,從而促進IRF3和IRF7磷酸化,進一步誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素合成[13]。而我們也發(fā)現(xiàn)HIV合并T.marneffei感染患者單核巨噬細胞中TBK1蛋白表達水平高于單純HIV感染者(P<0.05),提示HIV合并T.marneffei感染患者的TBK1處于過度激活狀態(tài),可引起單核巨噬細胞的持續(xù)激活,使得機體免疫失衡,從而引起機會性感染的發(fā)生。IRF7是抗病毒天然免疫中調(diào)控Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的主要因子,也是TLR通路的中間因子,當(dāng)TLR識別HIV-1后,腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6激活TBK1,同時IRF3、IRF7、NF-κB也被激活,啟動天然免疫通路[14-15]。本研究結(jié)果顯示,HIV合并T.marneffei感染患者單核巨噬細胞中IRF7蛋白表達水平高于單純HIV感染者(P<0.05),這提示IRF7可在過度激活狀態(tài)下促進機會性T.marneffei感染的發(fā)生,并促進AIDS的疾病進展。

        研究表明,IL-6水平與AIDS和AIDS相關(guān)免疫重建不良的發(fā)生率,以及AIDS相關(guān)的病死率呈正相關(guān)[16]。本研究結(jié)果也顯示在CD4+T淋巴細胞計數(shù)<100個/μL的患者中,HIV合并T.marneffei感染患者單核巨噬細胞中IL-6蛋白表達水平高于單純HIV感染者(P<0.05),由此推測IL-6可能與HIV合并T.marneffei感染有關(guān),IL-6 表達水平越高,HIV合并T.marneffei感染的概率可能越大。γ干擾素是單核巨噬細胞最重要的內(nèi)源性炎癥介質(zhì)之一,在促進單核巨噬細胞的激活和宿主防御中發(fā)揮重要作用[17]。本研究結(jié)果也顯示在CD4+T淋巴細胞計數(shù)<200個/μL的患者中,γ干擾素在HIV合并T.marneffei感染患者單核巨噬細胞中的表達水平較單純HIV感染患者更高(P<0.05),提示γ干擾素的表達水平可能與機體單核巨噬細胞抵抗T.marneffei感染的能力有關(guān)。

        由于本研究中兩組患者之間的CD4+T淋巴細胞計數(shù)差異較大,并且不同CD4+T淋巴細胞水平可能會影響不同TLR4及其信號通路相關(guān)因子的表達,因此我們分別對CD4+T淋巴細胞計數(shù)<200個/μL和CD4+T淋巴細胞計數(shù)<100個/μL這兩類患者的TLR2、TLR4、TLR9、TBK1、MyD88、IRF7、IL-6、γ干擾素的蛋白表達水平進行分析。本研究結(jié)果顯示,在CD4+T淋巴細胞計數(shù)低于100個/μL的患者中,兩組γ干擾素的表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),提示在免疫狀態(tài)更差的患者中,γ干擾素可能不會增強機體對T.marneffei的防御能力。而在CD4+T淋巴細胞<200個/μL的患者中,合并T.marneffei感染組γ干擾素的蛋白表達水平高于單純HIV感染組(P<0.05),提示γ干擾素可能有助于機體抵抗T.marneffei感染。同時,在CD4+T淋巴細胞<100個/μL的患者中,合并T.marneffei感染組IL-6的蛋白表達水平高于單純HIV感染組(P<0.05),提示IL-6表達的增加可能有助于免疫狀態(tài)更差的機體抵抗T.marneffei感染。本研究發(fā)現(xiàn),在CD4+T淋巴細胞<200個/μL的患者和CD4+T淋巴細胞計數(shù)<100個/μL的患者中,TLR2和TLR9的蛋白表達水平在合并T.marneffei感染組和單純HIV感染組中的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。本研究還發(fā)現(xiàn),CD4+T淋巴細胞計數(shù)<200個/μL的患者和CD4+T淋巴細胞計數(shù)<100個/μL的患者中,合并T.marneffei感染組的TLR4、TBK1、MyD88、IRF7的蛋白表達水平均高于單純HIV感染組(均P<0.05)。原因可能是T.marneffei通過激活單核巨噬細胞表面的TLR4受體,影響TLR4/MyD88和TLR4/TBK1信號通路,引起中間因子MyD88、TBK1、IRF7表達上調(diào),使免疫處于過度激活狀態(tài),導(dǎo)致機體免疫失衡,從而引起機會性感染的發(fā)生。

        綜上所述,TLR4及其信號通路相關(guān)因子在HIV合并T.marneffei感染患者單核巨噬細胞中異常表達,這可能是促進HIV合并T.marneffei感染、影響HIV的病程進展的因素之一。其通過以下兩個方面起作用:一方面是通過激活MyD88依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑,促進IL-6等炎癥因子的表達,從而參與單核巨噬細胞的炎癥免疫反應(yīng);另一方面,TLR4通過激活TBK1等激酶,導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子IRF7被激活并入核,并誘導(dǎo)γ干擾素的分泌,提示HIV患者在合并T.marneffei感染后開啟了免疫應(yīng)答反應(yīng),這為基于天然免疫模式識別受體開發(fā)新的藥物靶點和治療方案提供了依據(jù)。但本研究納入的樣本量過少,研究結(jié)論尚需擴大樣本量進一步研究驗證。

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