陳嬌 呂蝶 陳紅利 張平

口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心四川大學華西口腔醫(yī)院，成都 610041

唾液腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是口腔頜面部最常見的涎腺上皮來源性惡性腫瘤之一，具有生長緩慢但侵襲性強，早期沿神經(jīng)、血管束向遠處擴展等特征；并伴有易復發(fā)、高轉移的生物學特性（5年肺轉移率高達50%）[1-3]。

細胞生物學和蛋白質功能主要受蛋白激酶和蛋白磷酸酶的磷酸化和去磷酸化調節(jié)[4]。蛋白激酶D（protein kinase D，PKD）是一類新的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，由于其結構域與鈣離子/鈣調蛋白依賴性激酶（Ca/calmodulin-dependent protein kinases or CaM kinases，CaMK）家族的同源性高于蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）家族，目前PKD 家族已經(jīng)被定義為CaMK 家族[5]。PKD 包含PKD1、PKD2 和PKD3 三個亞型。PKC 能特異性的誘導絲氨酸位點Ser744 和Ser748 的磷酸化。PKD Ser744/748 位點磷酸化后常伴隨Ser916 的磷酸化，該位點的磷酸化被認為是PKD 激酶完全活化的標志[6-7]。PKD 主要介導細胞外刺激信號至胞內傳遞過程，近年來，其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用受到廣泛關注。

癌癥的治療一直以來是世界性難題，抗腫瘤藥物的研發(fā)也在不停的進展之中。近年來，小分子抑制劑靶向癌癥作為一種新的治療手段正在成為腫瘤治療藥物研發(fā)與研究的一個熱點[8-9]。CRT0066101作為新近研發(fā)靶向PKD的小分子抑制劑，已被證實在胰腺癌、結直腸癌和轉移性乳腺癌的異種移植模型中具有治療效果，但目前在SACC 中的作用研究報道甚少[10-12]。本研究旨在觀察CRT0066101 對SACC 細胞遷移能力的影響，并探討其相關機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

p-PKD/PKC mu（Ser916）抗體、E-鈣黏著蛋白（E-cadherin，E-cad） 抗體、鋅指轉錄因子（Snail）抗體、β-actin 抗體（CST 公司，美國），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（PAN-Biotech GmbH 公司，德國），DMEM/high 培養(yǎng)基（Gibco 公司，美國），CRT0066101、MG132（APEx-Bio 公司，美國），佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）（北京索萊寶科技有限公司），結晶紫染液（上海碧云天生物技術有限公司），BCA 蛋白含量測定試劑盒（Thermo 公司，美國），電化學發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）試劑（Bio-Rad公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) SACC-LM 細胞由四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室提供。SACC-LM 細胞用含10%FBS、1%雙抗（青霉素/鏈霉素）的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。待細胞長至95%以上時，棄去培養(yǎng)基，加入預熱的PBS 洗滌2 次，吸干PBS，加入0.25%胰酶200～1 000 μL（具體量視細胞而定），放入37 ℃培養(yǎng)箱消化2～5 min（因細胞而定），顯微鏡下觀察細胞變圓，目測呈泥沙樣流動時，再加入2 mL 完全培養(yǎng)基終止，輕輕吹打混勻，取一定量至培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，補充完全培養(yǎng)基。

1.2.2 藥物處理 將CRT0066101 用二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）溶解稀釋成10 mmol·L-1母液，再用無血清DMEM-H 培養(yǎng)基稀釋，使用濃度為0、1、3、5 μmol·L-1，處理1 h；MG132 粉末用DMSO 稀 釋 成40 μmol·L-1母 液，再 用 無 血 清DMEM-H 培養(yǎng)基稀釋，使用濃度為10 μmol·L-1，分別處理0、0.5、3 h后，提取細胞總蛋白。

1.2.3 激光共聚焦檢測磷酸化PKD、E-cad 和N-鈣黏著蛋白（N-cadherin，N-cad）表達 1）細胞處理：取對數(shù)期生長的細胞胰酶消化，調整細胞濃度為每毫升3×105個，取100 μL 懸空滴到蓋玻片上，在培養(yǎng)箱靜置2 h 后，沿孔壁緩緩加入600 μL培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)使細胞密度達到70%～80%。2）固定：第2 天用鑷子小心取出蓋玻片放入1 孔板（注意區(qū)分細胞面與非細胞面），用預熱的PBS 輕輕洗滌2 次，加入4%多聚甲醛避光固定20 min。3）封閉：棄去多聚甲醛，加入PBS 清洗3×5 min，用含1%Triton-100 的5%BSA（用PBS 溶解）溶液室溫封閉30 min。4）一抗孵育：棄去封閉液，取載玻片加入用含1%Triton X-100 的1%BSA （用PBS 溶解）溶液稀釋的一抗，放入濕盒4 ℃過夜。5）二抗孵育：取載玻片用PBS 清洗3×5 min，加入用1%BSA（含1%Triton X-100）溶液稀釋的熒光二抗，避光37 ℃孵育1 h。6）細胞骨架染色：取載玻片避光條件下用PBS 清洗3×5 min。取載玻片加入30 μL 已稀釋的細胞骨架（肌動蛋白），放入濕盒室溫孵育30 min。7）4,6-二氨基-2-苯基吲哚[2-（4-amidinophenyl）-6-indolecarbamidine dihydrochloride，DAPI]染色：取載玻片避光條件下用PBS 清洗3×5 min。取30 μL 的DAPI 于干凈載玻片上，取載玻片吸干四周水分倒置于載玻片上，避光室溫靜置15 min。8）封片：在蓋玻片四周刷一層指甲油封片。用激光共聚焦觀察染色結果。

1.2.4 Transwell實驗 將SACC-LM細胞用5 μmol·L-1CRT0066101 處理1 h 作為實驗組，將SACC-LM 細胞用DMSO 處理1 h 作為對照組。取實驗組和對照組細胞，分別胰酶消化，離心去上清，細胞沉淀用無血清DMEM 高糖培養(yǎng)基重懸，細胞計數(shù)，調整細胞濃度為每毫升5×105個，取200 μL 加到小室上層，小室下層加入600 μL 完全DMEM 培養(yǎng)基，放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h 后，取出小室，在12孔板上層和下層中分別加入預熱PBS 200、800 μL，輕柔潤洗2 次。吸盡PBS 后，在小室上層和下層分別加入200、800 μL，4%多聚甲醛固定20 min，吸去上下層多聚甲醛，用棉簽輕輕擦去小室上層未穿過的細胞。上下層加入PBS 洗3 次，倒置小室晾干。小室放置12 孔板中，其上層、下層加入200、800 μL 的0.1%結晶紫溶液，染色15 min，用PBS 洗3 次，顯微鏡下采圖，計數(shù)顯微鏡下每個視野中遷移細胞數(shù)，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差表示，用Graph Pad Prism 6.0 繪制柱狀圖。

1.2.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測CDH1 和Snail 基因的表達 將SACC-LM 細胞用5 μmol·L-1CRT0066101 處 理1 h 作 為 實 驗 組，將SACC-LM 細胞用DMSO 處理1 h 作為對照組。取實驗組和對照組細胞，采用Trizol 法提取樣本總RNA，使用分光光度計（Implen 公司，德國）檢測總RNA 純度。使用逆轉錄試劑盒（TaKaRa）對總RNA 進行逆轉錄合成cDNA，取cDNA 為模版，應用TSINGKE Master Mix（SYBR greenⅠ）試劑進行qRT-PCR 檢測。引物序列由北京擎科生物科技有限公司設計合成。引物序列如下。Snail 上游引物序列：5’-GCTGCAGGACTCTAATCCAGA-3’，下游引物序列：3’-ATCTCCGGAGGTGGGATG-5’；CDH1 上游引物序列：5’-CGGACGATGATGTGAACACC-3’，下游引物序列：3’-TTGCTGTTGTGCTTAACCCC-5’；磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GA-PDH） 上 游引物序列：5’-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3’，下游引物序列：3’-ACTGGTGATGTACCAGATGT-5’。聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）條件：95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃32 s，循環(huán)45次；95 ℃15 s，60 ℃50 s，95 ℃20 s，循環(huán)1次。相對表達量用2-ΔΔCT表示。

1.2.6 蛋白質印跡（Western blot）法 收集不同處理的SACC細胞，加入提前配置好細胞裂解混合液[含0.1%的蛋白酶抑制劑，0.5%苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF），1% 磷酸酶抑制劑]放置于冰上充分裂解，然后4 ℃下12 000 r·min-1離心10 min，小心吸取上清至新的EP 管中，使用BCA 試劑盒測定蛋白濃度并處理蛋白制備樣本。配置十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis， SDS-PAGE） 電 泳， 聚 偏 氟 乙 烯（polyvinylidenefluoride，PVDF）膜轉膜，5%的脫脂牛奶（TBST 溶解）室溫封閉1 h。封閉結束后取出膜，用TBST 洗3×5 min（90 r·min-1）分別加入p-PKD/PKC mu （Ser916）、 E-cad、 N-cad、Snail、β-actin抗體，4 ℃搖床過夜孵育（90 r·min-1）。取出孵育過夜的膜，TBST清洗3×10 min（90 r·min-1）后，加入5%的脫脂牛奶稀釋的山羊抗兔二抗（1∶2 000）、羊抗鼠二抗（1∶2 000），室溫孵育2 h。孵育結束后，取出膜用TBST 清洗3×10 min（90 r·min-1）。用ECL 發(fā)光顯影液顯色，Chemidoc XRS 采集圖像。用Image G 軟件分析條帶灰度值，用Graph Pad Prism 6.0繪制蛋白相對含量柱狀圖。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用Graph Pad Prism 6.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示。多組間的數(shù)值比較采用one-way ANOVA，兩兩比較用t檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度CRT0066101可抑制細胞PKD活化

PKD1 可被PMA、G 蛋白偶聯(lián)受體（G protein coupled receptor，GPCR）等多種細胞因子激活，本研究將SACC-LM 細胞先用200 nmol·L-1PMA 作用40 min，再用0、1、3、5 μmol·L-1CRT0066101處理1 h，Western blot實驗結果表示，CRT0066101能以劑量依賴性方式抑制SACC-LM 細胞中PMA誘導的PKD Ser916自磷酸化（圖1）。接著，將SACC-LM 細胞用0、3、5 μmol·L-1CRT0066101 處理1 h，結果可見，CRT0066101 明顯抑制PKD Ser-916自磷酸化，且呈劑量依賴性降低，在5 μmol·L-1達到最強抑制效果（圖2）。免疫熒光顯示CRT-0066101 抑制SACC-LM 細胞PKD Ser916 自磷酸化（圖3）。以上結果提示CRT0066101 能有效抑制SACC-LM細胞中的PKD磷酸化活化。

圖1 CRT006101對SACC細胞PKD活性的影響Fig 1 Effect of CRT006101 on PKD activity of SACC cell line

圖2 Western blot 檢測不同濃度CRT006101 作用后SACC 細胞PKD磷酸化活化蛋白的表達Fig 2 Expression of p-Ser916 treated with different doses of CRT006101 was detected by Western blot

圖3 免疫熒光檢測CRT006101作用后SACC細胞PKD磷酸化活化蛋白的表達Fig 3 Immunofluorescence detection of p-Ser916 protein expression treated with CRT006101 in SACC cells

2.2 CRT0066101 對SACC-LM 細胞遷移能力的影響

Transwell實驗表明，培養(yǎng)18 h后，CRT00661-01處理組和對照組細胞遷移數(shù)分別為43.25±5.977、510.00±22.290，2 組間差異具有統(tǒng)計學意義（t=20.23，P＜0.000 1）（圖4）。該結果表明CRT0066-101能明顯抑制SACC-LM細胞的遷移能力。

圖4 CRT006101 對SACC-LM 細胞遷移能力的影響 倒置顯微鏡 ×200Fig 4 Effect of CRT006101 on migration ability of SACC-LM cell line inverted microscope ×200

2.3 CRT0066101對SACC-LM 上皮細胞-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關蛋白的影響

將SACC-LM 細 胞 用0、1、3、5 μmol·L-1CRT0066101 處理1 h，Western blot 實驗結果顯示，實驗組較對照組N-cad 和Snail 蛋白表達量降低，E-cad 表達量升高（圖5）。免疫熒光顯示CRT-0066101 處 理 后，SACC-LM 細 胞N-cad 表 達 降 低，E-cad 表達升高（圖6）。以上結果說明CRT-0066101能降低N-cad和Snail蛋白表達量，增加Ecad表達。

圖5 Western blot檢測N-cad、E-cad、Snail蛋白表達Fig 5 Expression of N-cad,E-cad,Snail detected by Western blot

圖6 免疫熒光檢測CRT006101作用后SACC細胞N-cad和E-cad蛋白的表達Fig 6 Immunofluorescence detection of N-cad and E-cad protein expression treated with CRT006101 in SACC cells

2.4 CRT0066101 對SACC-LM 細 胞CDH1 和Snail mRNA表達的影響

qRT-PCR 結 果 顯 示，5 μmol·L-1CRT0066101處理組的CDH1 表達量（1.279±0.254）高于對照組的表達量（1.000±0.166）（P＜0.05），Snail 表達量（0.986±0.242） 與 對 照 組 的 表 達 量（1.000±0.275） 差 異 無 統(tǒng) 計 學 意 義（圖7）。 說 明CRT0066101 能增加 CDH1 基因的表達，CRT0066101 處理細胞的Snail 基因的mRNA 表達量無明顯差異，而蛋白量減少，表明CRT0066101不影響Snail 基因的轉錄。

圖7 qRT-PCR檢測SACC-LM細胞中CDH1 和Snail mRNA的表達Fig 7 qRT-PCR analysis of CDH1 and Snail mRNA expression in SACC-LM cells

2.5 CRT0066101 對SACC-LM 細胞Snail 蛋白降解的調節(jié)機制

將5 μmol·L-1CRT0066101 處理組和對照組細胞分別用蛋白酶體抑制劑MG132（10 μmol·L-1）處理0、0.5、3 h。Western blot 實驗結果顯示，對照組細胞在MG132 的作用下，Snail 蛋白的表達逐漸升高，而CRT0066101 處理組Snail 蛋白表達逐漸恢復正常水平（圖8）。結果提示CRT0066101能調控蛋白酶體介導的Snail蛋白降解。

圖8 Western blot檢測Snail蛋白表達Fig 8 Expression of Snail detected by Western blot

3 討論

SACC 約占唾液腺惡性腫瘤的24%，是口腔頜面部最具特征的惡性腫瘤，具有較強的浸潤性和遠處轉移力[1-3]。雖然近年來國內外學者[13-14]在SACC治療領域取得了較大的進展，但仍有相當一部分患者會出現(xiàn)復發(fā)和轉移。究其原因與缺乏有效治療手段、常規(guī)化療藥物療效不理想有密切關系。因此，探究與SACC發(fā)生及進展機制相關的生物學標志物，探索新的藥物作用靶點，提高SACC患者對化療藥物的敏感性，改善患者長期存活率和生活質量，對SACC臨床診斷和治療具有重要的價值。

研究[15-16]證實，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）在SACC 中的表達高于正常涎腺組織，提示其在SACC 的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。另外，EFGR 在SACC血管床的生成中可能發(fā)揮著重要的作用，并有利于腫瘤沿著血管侵襲生成和發(fā)生遠處轉移，同時是化學治療藥物抗性的重要基礎[17]。PKD 作為EGFR 下游信號傳導蛋白，如果從基因水平抑制PKD 表達和磷酸化活化，阻斷表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF） 信號傳導通路，抑制腫瘤的生長，為臨床開發(fā)使用PKD 抑制劑提供了理論基礎[18]。新近開發(fā)了幾種新的靶向PKD1 的小分子抑制劑， 包括CRT0066101、CRT5、CID755673 和kb-NB-142-70[10,19]。這 些 化合物在體外細胞實驗中均顯示出抑制PKD 活性的作用，而在體內實驗中，目前只有CRT0066101在動物模型中給藥成功，且沒有脫靶效應。此外，用CRT0066101 處理的小鼠在胰腺癌、結直腸癌和轉移性乳腺癌的異種移植模型中沒有顯示出任何痛苦跡象（說明沒有不良反應），且沒有發(fā)現(xiàn)對正常組織結構功能有不良反應（即對導管功能的影響）[20-21]，為本研究使用CRT-0066101 靶向SACC 治療提供強有力的支持。本研究發(fā)現(xiàn)CRT0066101 能有效抑制SACC-LM 細胞中PKD 的活性，且呈濃度依賴性。本研究探討了PKD 磷酸化對SACC 細胞遷移能力的影響，研究發(fā)現(xiàn)CRT0066101 在腫瘤細胞遷移中起到抑制細胞遷移的作用。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個長期的多因素參與的多步驟過程。在這一過程中，EMT 在腫瘤進展中具有重要意義[22]。近年來研究[14]證實，EMT 能促進SACC的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉移，增加腫瘤對化療藥物的抗性，并且與SACC 預后不良密切相關。EMT發(fā)生的主要分子特征為上皮細胞標志物E-cad丟失的同時間質細胞標志物N-cad等表達水平的上調，其中，E-cad 是細胞緊密連接的中心復合物，其表達的降低或缺失與腫瘤的分化、分期、侵襲、轉移以及預后密切相關[23-24]。因此，E-cad 是一種典型的腫瘤侵襲抑制分子，是EMT 最主要的標志物之一。E-cad 失調的重要機制之一是其編碼基因CDH1 在轉錄水平受到Snail、ZEB1、ZEB2、Twist、Slug 等轉錄因子的影響，它們和CDH1 基因的啟動子結合，抑制E-cad 轉錄[23,25]。Snail為EMT 調控，屬于轉錄抑制子中的Snail 超家族，通過與近E-cad 編碼基因啟動子區(qū)域的E-boxes 結合抑制Ecad 表達，誘發(fā)EMT[25-26]。本研究發(fā)現(xiàn)，用CRT-0066101抑制SACC細胞中PKD 磷酸化活化，發(fā)現(xiàn)SACC 細胞E-cad 表達上調，N-cad 表達下調。與對照組細胞相比，CRT0066101處理細胞的Snail基因的mRNA 表達量無明顯差異，而蛋白量減少，表明CRT0066101 不影響Sanil 基因的轉錄。Snail在細胞內是一種高度不穩(wěn)定性蛋白，主要由泛素蛋白酶體系統(tǒng)調節(jié)其泛素化降解。用蛋白酶體抑制劑MG132處理細胞，發(fā)現(xiàn)對照組細胞Snail蛋白的表達逐漸升高，實驗組細胞的Snail 蛋白表達逐漸恢復至正常水平，表明CRT0066101 對Snail 蛋白的降解調節(jié)是依賴于蛋白酶體途徑的。提示CRT0066101 可能調節(jié)Snail 蛋白酶體降解，促進E-cad表達，有效抑制SACC進展中EMT的發(fā)生。

綜上所述，CRT0066101 作為新近開發(fā)的靶向PKD 的特異性小分子抑制劑，可有效抑制SACC細胞遷移能力，其機制可能與調節(jié)Snail 蛋白酶體降解，促進E-cad表達有關。提示靶向PKD的小分子抑制劑可以有效治療轉移性SACC，為SACC 治療提供了新的策略。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突