鄒 曉，鄭程遠(yuǎn)，*，孫敬明，張曉山，王 平

（1.齊齊哈爾大學(xué)，黑龍江齊齊哈爾 161000；2.黑龍江北大倉集團(tuán)有限公司，黑龍江齊齊哈爾 161000）

隨著現(xiàn)代化牧場(chǎng)飛速發(fā)展，繁殖與營(yíng)養(yǎng)成為集約化奶牛場(chǎng)的主角，子宮類疾病因關(guān)乎奶牛繁殖性能而廣受學(xué)者關(guān)注。奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞作為子宮組織的重要組成細(xì)胞，是研究子宮類疾病的基礎(chǔ)[1-4]。MicroRNA（miRNA）是一類新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性非編碼轉(zhuǎn)錄后調(diào)控sRNA，可作用于靶基因mRNA，抑制或增強(qiáng)靶基因miRNA的翻譯，進(jìn)而引起相應(yīng)靶蛋白的變化[4-8]。目前，通過模擬生物體內(nèi)內(nèi)源性miRNA化學(xué)合成模擬物片段，轉(zhuǎn)染至體外細(xì)胞以達(dá)到增強(qiáng)或抑制miRNA表達(dá)的方法，成為檢測(cè)其功能和識(shí)別miRNA靶基因的重要手段[9-11]。在常見的轉(zhuǎn)染方法中，陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染因其具有操作簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)染率高、低毒、無免疫原性、質(zhì)粒免受核酸酶降解等優(yōu)點(diǎn)得到了廣泛應(yīng)用[12]。影響轉(zhuǎn)染效率的因素很多，其中原代細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率低是一項(xiàng)難題；轉(zhuǎn)染效率直接決定了后續(xù)生物學(xué)功能的研究結(jié)果。

本研究以奶牛子宮內(nèi)膜原代上皮細(xì)胞為研究對(duì)象，探討不同轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染時(shí)間對(duì)miRNA模擬物轉(zhuǎn)染效果的影響，篩選最適合的轉(zhuǎn)染條件，并通過Q-PCR法評(píng)估最適條件下miRNA模擬物的試劑轉(zhuǎn)染效果，以期為后續(xù)同類研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Lipofectamine RNAiMAX、Lipofectamine 2000、Trizol（Invitrogen）；miRNA-RNA mimics、NC miRNA mimics（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）。

PrimeScript?RT Reagent Kit、SYBR?Premix Ex Taq?Ⅱ（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）；氯仿、異丙醇、無水乙醇（生工生物工程股份有限公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基（賽默飛世爾科技公司）；血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）；DEPC水、青鏈霉素混合液（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 主要儀器

熒光定量分析儀（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）、ND-1000紫外分光光度儀（賽默飛世爾科技公司）、倒置顯微鏡（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）、CO2培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

復(fù)蘇先前凍存的奶牛子宮內(nèi)膜原代上皮細(xì)胞，采用不含抗生素含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為1×107個(gè)/孔，于37℃5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

向250μL無血清、無抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基中加入5μL miRNA-185 mimics，輕輕混勻。分別用250μL無血清、無抗生素的培養(yǎng)基稀釋5μL Lipofectamine RNAiMAX與Lipofectamine 2000試劑，輕輕混勻，室溫靜置5 min。將先前預(yù)混好的miRNA-185 mimics分別與稀釋好的Lipofectamine試劑混合均勻，室溫靜置20 min，形成miRNA-185 mimics-Lipofectamin復(fù)合物。

分別在細(xì)胞接種12、18、24 h后，移除先前的培養(yǎng)基，并向每孔加入1.5 mL無血清無抗生素的培養(yǎng)基，加入miRNA-185 mimics-Lipofectamin復(fù)合物。轉(zhuǎn)染6 h后，完全培養(yǎng)基清洗細(xì)胞3次，每次3 min，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果，隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞及總細(xì)胞數(shù)。Image J軟件分析組間細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度，記錄試驗(yàn)結(jié)果。

依據(jù)最佳轉(zhuǎn)染條件，對(duì)細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-185 micscs作為試驗(yàn)組（標(biāo)記為E），轉(zhuǎn)染NC miRNA mimics作為對(duì)照組（標(biāo)記為NC），每組3個(gè)重復(fù)，轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞。

1.3.3 總RNA提取

收集后的細(xì)胞每管中加入1 mL Trizol，室溫裂解20 min后加入200μL的氯仿，振蕩混勻，室溫靜置10 min。12 000×g離心15 min，取上清加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10 min。

12 000×g離心10 min，棄去液體，向底部RNA沉掉加入1 mL 75%冰乙醇，輕輕混勻，7 500×g離心6 min。超凈臺(tái)內(nèi)室溫干燥10 min，加入20μL DEPC水。

1.3.4 RT及Q-PCR

試驗(yàn)依據(jù)TaKaRa PrimeScript?RT Reagent Kit說明書對(duì)各樣品總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以U6為內(nèi)參基因，對(duì)各樣品經(jīng)行Q-PCR檢測(cè)。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃4 min，94℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，72℃6 min，35個(gè)循環(huán)。引物序列見表1。

表1 反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR引物序列Tab.1 Sequences of the primers that were used in the RT and Q-PCR

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，采用單因素方差和LSD法比較不同轉(zhuǎn)染時(shí)間及轉(zhuǎn)染試劑對(duì)轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度的影響應(yīng)用，2（-Delta Delta C（T））分析Q-PCR結(jié)果。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，P＞0.05差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染結(jié)果（見圖1～圖3）

由圖1～圖3可知，各組間均可見綠色熒光信號(hào)，說明有miRNA-185 mimics轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，但轉(zhuǎn)染效果并不理想；且隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)染效率逐漸降低。對(duì)比自然光下的圖片發(fā)現(xiàn)，在接種后24 h進(jìn)行轉(zhuǎn)染，僅有少量miRNA-185 mimics轉(zhuǎn)入未純化完全的成纖維細(xì)胞中。

2.2 Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染結(jié)果（見圖4～圖6）

由圖6～圖8可知，各組間均可見強(qiáng)烈的熒光信號(hào)，說明存在大量的miRNA-185 mimics轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)且轉(zhuǎn)染效果很好，尤以細(xì)胞接種12 h后轉(zhuǎn)染效果最佳。

與Lipofectamine 2000試劑相同，使用Lipofectamine RNAiMAX作為轉(zhuǎn)染試劑時(shí)，隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)染效率逐漸降低。

2.3 轉(zhuǎn)染試劑對(duì)轉(zhuǎn)染效率、熒光強(qiáng)度的影響（見圖7、圖8）

由圖7可知，無論使用Lipofectamine 2000還是Lipofectamine RNAiMAX作為奶牛子宮內(nèi)膜原代上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染試劑，各組間12 h的轉(zhuǎn)染效率均極顯著高于18、24 h（P＜0.01），18 h的轉(zhuǎn)染效率均極 顯著高于24 h（P＜0.01）；Lipofectamine RNAiMAX各時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)染效率均極顯著高于Lipofectamine 2000（P＜0.01）。

由圖8可知，使用Lipofectamine 2000的各組熒光強(qiáng)度差異不顯著（P＞0.05）。使用Lipofectamine RNAiMAX作為奶牛子宮內(nèi)膜原代上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染試劑時(shí)，12 h的熒光強(qiáng)度均極顯著高于18、24 h（P＜0.01），24 h的熒光強(qiáng)度均極顯著高于18 h（P＜0.01）。Lipofectamine RNAiMAX各時(shí)間點(diǎn)的熒光強(qiáng)度均極顯著高于Lipofectamine 2000（P＜0.01）。結(jié)果表明，當(dāng)使用Lipofectamine 2000作為奶牛子宮內(nèi)膜原代上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染試劑時(shí)，無法達(dá)到很好的轉(zhuǎn)染效果。

綜上所述，在奶牛子宮內(nèi)膜原代上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-185 mimics時(shí)，Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染效果明顯優(yōu)于Lipofectamine 2000，且以接種細(xì)胞12 h后轉(zhuǎn)染效果最佳。

2.4 Q-PCR結(jié)果（見圖9）

為檢測(cè)優(yōu)化后的轉(zhuǎn)染條件其真實(shí)效果，利用Q-PCR法檢測(cè)最優(yōu)條件下miRNA-185的表達(dá)變化。由圖9可知，與NC相比，E組miRNA-185的表達(dá)量極顯著升高（P＜0.01）。

3 討論

MiRNA是1類重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，參與機(jī)體基因組30%以上的蛋白編碼過程。大量研究表明，miRNA可參與體內(nèi)細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育、凋亡等生物學(xué)活動(dòng)，進(jìn)而影響機(jī)體的生理或病理過程[6-11]。miRNA mimics是1段小雙鏈RNA分子，可通過化學(xué)手段合成，模擬細(xì)胞中內(nèi)源性成熟miRNA的高表達(dá)水平，進(jìn)而達(dá)到特異性增強(qiáng)內(nèi)源性miRNA的調(diào)控作用[13]。體外調(diào)控miRNA因化學(xué)合成方法兼具操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，可高效特異性地調(diào)控相關(guān)miRNA表達(dá)的效果，近年來被廣泛應(yīng)用于miRNA功能和下游靶基因位點(diǎn)等方面的研究。如Gutkoska[14]等將miR-203a-5p和miR-203-5p mimics轉(zhuǎn)入豬的細(xì)胞系，研究miRNA-203a在手足口病發(fā)病過程中的作用，并取得了重要突破。

奶牛子宮內(nèi)膜原代上皮細(xì)胞是研究奶牛生殖系統(tǒng)疾病分子機(jī)制常用的體外模型，奶牛子宮內(nèi)膜炎和胎衣不下與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的生理過程關(guān)系極為密切，通過miRNA在子宮內(nèi)膜原代上皮細(xì)胞內(nèi)對(duì)相關(guān)疾病的功能基因進(jìn)行研究具有重要意義。在應(yīng)用miRNA化學(xué)合成模擬物研究miRNA功能試驗(yàn)時(shí)，外源性miRNA模擬物對(duì)內(nèi)源性miRNA表達(dá)的影響取決于其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的多少，即轉(zhuǎn)染效率的高低。影響miRNA轉(zhuǎn)染效率的因素很多，不同的細(xì)胞對(duì)miRNA的攝取率不盡相同；因此，若要達(dá)到最佳的調(diào)控效果，對(duì)轉(zhuǎn)染條件的篩選至關(guān)重要。

本試驗(yàn)選取miRNA-185 mimics為代表，探究miRNA化學(xué)模擬物在奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)染試劑及轉(zhuǎn)染時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Lipofectamine RNAiMAX的轉(zhuǎn)染效果明顯優(yōu)于Lipofectamine 2000，與之前的學(xué)者大多采用Lipofectamine 2000得到的結(jié)果不同[15-16]。分析其原因，可能是由于大多數(shù)先前的研究大多選用細(xì)胞系而非原代細(xì)胞，與細(xì)胞系相比，原代細(xì)胞更難轉(zhuǎn)入小分子RNA；也可能是由于Lipofectamine RNAiMAX相比Lipofectamine 2000，是一款更新型的、適合小分子RNA轉(zhuǎn)入的試劑，能夠?qū)崿F(xiàn)更高的基因抑制效果，并可在10倍試劑濃度范圍內(nèi)維持細(xì)胞的上佳活力，可針對(duì)更加廣泛的細(xì)胞類型，但并未得到更好的推廣。

本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論Lipofectamine RNAiMAX還是Lipofectamine 2000，隨著細(xì)胞接種時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)染效率均逐漸下降，其中以細(xì)胞接種12 h后轉(zhuǎn)染的效果最好，但與梁戈玉等[16]的研究結(jié)果相反。該研究認(rèn)為細(xì)胞接種24 h后轉(zhuǎn)染效果最好，12 h的效果并不理想。這可能是由于物種及細(xì)胞本身特性不同所造成的。此外，無血清、無抗生素培養(yǎng)基的使用以及嚴(yán)格的用量標(biāo)準(zhǔn)均為高轉(zhuǎn)染效率提供了保證。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，奶牛子宮內(nèi)膜原代上皮細(xì)胞適合應(yīng)用脂質(zhì)體進(jìn)行miRNA化學(xué)合成模擬物的轉(zhuǎn)染，miRNA轉(zhuǎn)染效率的高低與轉(zhuǎn)染試劑及轉(zhuǎn)染時(shí)間相關(guān)；選用Lipofectamine RNAiMAX作轉(zhuǎn)染試劑，細(xì)胞接種12 h后轉(zhuǎn)染可達(dá)最佳的轉(zhuǎn)染效果，實(shí)際檢測(cè)表達(dá)量變化后，可應(yīng)用于后續(xù)試驗(yàn)。