王紅運(yùn),劉禹夫，于曉明，楊祥波，曲一格，張振宇，王曉航*

（1 吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，吉林 吉林 132101；2 吉林省種子管理總站，長(zhǎng)春 130000）

香菇隸屬于真菌界 （Fungi）、 擔(dān)子菌門（Basidiomycota），學(xué)名Lentinula edodes，是世界久負(fù)盛名的珍貴食用菌［1］。 香菇味道好，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高［2］。 同時(shí)還可作藥用：有扶正補(bǔ)虛，健脾開胃，祛風(fēng)透疹，化痰理氣，解毒，抗癌等功效。別名又為香蕈。 目前香菇的研究多為香菇多糖對(duì)人體心血管的影響， 香菇中微量元素的分析等等， 還未有太多關(guān)于香菇分子生物學(xué)方面的研究［3］。 所以對(duì)香菇進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化研究尤為重要。本研究選用的為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)香菇進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法能在自然條件下趨化性的將TDNA 插入到植物基因組中，它轉(zhuǎn)化率高，單拷貝比例高， 且轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定。 是近年來常用的轉(zhuǎn)化方法。 OsICE1 基因是水稻中的一種冷調(diào)控關(guān)鍵蛋白， 在多個(gè)文獻(xiàn)中對(duì)于OsICE1 的抗冷性多有研究，具有比較穩(wěn)定且作用明顯的抗寒功能，在水稻受到低溫時(shí)進(jìn)行表達(dá)， 可以使水稻在一定程度上耐冷［4］。由此選用OsICE1 基因?qū)ο愎骄z體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化［5］，使得到帶有OsICE1 基因的香菇菌絲體， 為實(shí)現(xiàn)香菇在寒冷條件大面積種植提供了重要依據(jù)與材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 香菇菌株由周玉麟食用菌研究所購入； 大腸桿菌DH5α 感受態(tài)、 根癌農(nóng)桿菌EHA105 感受態(tài)保存在吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室， 日本晴水稻種子，pCsV1300 質(zhì)粒保存于吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室， 質(zhì)粒圖譜見圖1。

圖1 pCsV1300 載體的T－DNA

1.1.2 主要試劑 質(zhì)粒提取試劑盒由生工股份有限公司購入，PCR、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購于全式金公司。

1.2 構(gòu)建抗寒基因OsICE1 的基因表達(dá)載體

1.2.1 水稻發(fā)芽 首先挑選飽滿的日本晴水稻種子， 把其放入處理好的培養(yǎng)皿中， 用生汞進(jìn)行消毒，消毒15 min，把消毒后的種子在紗布上進(jìn)行沖洗，把沖洗后的種子重新放回培養(yǎng)皿中，把培養(yǎng)皿上下兩層分別平鋪已經(jīng)用超純水沾濕的濾紙，把消毒后的種子放在下層濾紙上， 再把上層帶有沾濕濾紙的培養(yǎng)皿蓋住， 放入25 ℃無光的條件下進(jìn)行培養(yǎng)［6］。 注意時(shí)常觀察濾紙上的水分，始終保持濾紙濕潤(rùn)， 培養(yǎng)5 d 出現(xiàn)水稻根和芽。

1.2.2 水稻RNA 提取 對(duì)1.2.1 中培養(yǎng)的水稻種子的芽進(jìn)行RNA 提取： 選用1.2.1 中的水稻芽0.2 g，用Trizol 法進(jìn)行提取。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄體系 純化RNA 以去除基因組DNA［7］， 操作按全式金公司的TransScript One-Step gRNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 說明書進(jìn)行。 其體系見表1。

表1 反轉(zhuǎn)錄體系

條件為：PCR 42 ℃孵育30 min。 85 ℃加熱5 s 失活TransScript RT／RI Enzyme Mix 和gDNA Remover。

1.2.4 OsICE1 目的基因的克隆 用primer 軟件設(shè)計(jì)出的引物如下。

OsICE1 的引物序列：

OsICE1-clone-F: 5' ATGCTGCCGCGGTTTCA 3'OsICE1-clone-R: 5' CTAGATCATGGTATGGAAC CCG 3'

OsICE1-clone-XbaI-F:5' TGCTCTAGAATGCTGC CGCGGTTTCA 3'

OsICE1-clone-EcoRI-R: 5' CCGGAATTCCTAGAT CATGGTATGGAACCCG 3'

由吉林省庫美生物科技有限公司合成。

PCR 擴(kuò)增制備水稻全基因， 操作如下：PCR反應(yīng)體系見表2。

表2 PCR 反應(yīng)體系

PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性20 s，58 ℃退火32 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)30 次；72 ℃延伸5 min。 1%瓊脂糖凝膠電泳。

PCR 擴(kuò)增OsICE1 片段。 上一步擴(kuò)增出來的水稻cDNA 全長(zhǎng)作為模板， 用OsICE1-clone-XbaI-F，OsICE1-clone-EcoRI-R，引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件同上面一樣。

1.2.5 PCR 產(chǎn)物回收 將1.2.4 擴(kuò)增出來的產(chǎn)物用Coolaber 公司的試劑盒對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行回收，獲取所需要的目的基因片段。

1.2.6 雙酶切 pCsV1300 質(zhì)粒， 用EcoRI，XBaI進(jìn)行酶切,反應(yīng)體系見表3。

表3 酶切反應(yīng)體系

在滅菌的0.2 mL 離心管中配制如下溶液（50 μL）：

37 ℃反應(yīng)15 min， 所得產(chǎn)物保存于-4 ℃冰箱備用。 電泳。

選1.2.5 中回收的目的基因OsICE1 片段，用EcoRI，XBaI 進(jìn)行酶切，反應(yīng)體系見表4。

表4 酶切反應(yīng)體系

37 ℃反應(yīng)15 min， 所得產(chǎn)物保存于-4 ℃冰箱備用。 電泳。

1.2.7 DNA 連接 將1.2.6 中的兩次酶切產(chǎn)物作為模板，用DNA 連接酶進(jìn)行連接，體系見表5。

表5 酶連接反應(yīng)體系

在滅菌的0.2 mL 離心管中配制如下溶液（15 μL）：

1.3 構(gòu)建含有OsICE1 基因的DH5α

1.3.1 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α。

1.3.2 轉(zhuǎn)化子的篩選及鑒定 選取單菌落接種到含有AMP 的液體培養(yǎng)基中［8］，進(jìn)行培養(yǎng)，鑒定。

1.4 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化培養(yǎng)

1.4.1 農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化 農(nóng)桿菌EHA105 （含質(zhì)粒pCsV1300） 劃線于含有 （20 mg／L Rif，50 mg／L Kan）的LB 平板上,28 ℃培養(yǎng)2 d；單菌落在液體培養(yǎng)基中以28 ℃，200 r／min 培養(yǎng)2 d，用打孔器從培養(yǎng)6 d 左右的PDA 平板取菌絲塊［9］，浸入農(nóng)桿菌菌液中，侵染20 min。置于含有200 μmol／L AS 的共培養(yǎng)基上，25 ℃共培養(yǎng)2 d。 將培養(yǎng)后的菌絲塊轉(zhuǎn)接到篩選培養(yǎng)基中 （10 mg／L 潮霉素）篩選轉(zhuǎn)化子， 培養(yǎng)2 周后取菌塊周圍新長(zhǎng)出的菌絲進(jìn)行復(fù)篩（12 mg／L 潮霉素培養(yǎng)基）。

1.4.2 抗寒性能試驗(yàn)測(cè)試 把復(fù)篩過的菌絲進(jìn)行試管培養(yǎng)， 在黑暗、pH 為適宜的情況下， 分別在10 ℃、25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)， 分別在12 h、48 h、72 h 進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA 完整性分析

對(duì)發(fā)芽5 d 水稻進(jìn)行冷脅迫（4 ℃）1 h，提取芽組織的RNA［10］。 結(jié)果如圖2 顯示，獲得RNA 中28S 條帶顯著亮于18S，5S RNA 條帶最弱， 說明提取的水稻RNA 具有較好的完整性。圖2 的三條泳道均為發(fā)芽5 天后進(jìn)行冷脅迫的水稻芽的RNA。

圖2 發(fā)芽5 d 提取的水稻RNA

2.2 OsICE1 基因的獲得

通過對(duì)水稻全基因組進(jìn)行體外擴(kuò)增［11］，并用特定引物進(jìn)行PCR 后得到OsICE1 基因目的片段，它克隆獲得到2 個(gè)陽性，如圖3，1、3 泳道為獲得的陽性克隆，測(cè)序結(jié)果顯示為1627bp。

圖3 水稻芽中OsICE1 基因的克隆

2.3 pCsV1300－OsICE1 表達(dá)載體的構(gòu)建

pCsV1300 經(jīng)過XBaI 與EcoRI 酶切后是9755bp 片 段 長(zhǎng)，OsICE1 基 因 為1627bp 片 段 長(zhǎng)。如圖4 所示， 可以清楚地看到在2 條泳道上的兩條DNA 條帶。

圖4 pCsV1300－OsICE1 表達(dá)載體

2.4 轉(zhuǎn)基因香菇菌絲的鑒定

從 轉(zhuǎn) 基 因 香 菇 菌 絲 體 中 提 取DNA［12］，用OsICE1-clone-F，OsICE1-clone-R 引物對(duì)提取出來的香菇DNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增， 電泳圖如圖5 所示。圖中第2 條泳道為陰性對(duì)照，第3、4 條泳道為用OsICE1-clone-F，OsICE1-clone-R 引 物PCR得到的產(chǎn)物，其大小在2000bp 左右。

圖5 轉(zhuǎn)基因香菇菌絲的鑒定

2.5 抗寒性試驗(yàn)的測(cè)試

香菇菌絲在25 ℃為最適生長(zhǎng)溫度， 試驗(yàn)主要做出了帶有OsICE1 基因表達(dá)載體的香菇菌絲體與不帶有OsICE1 基因表達(dá)載體的香菇菌絲體［13］，把他們分別放入了10 ℃和最適溫度25 ℃。 可以看出，在25 ℃的溫度，其余條件都相同的情況下他們長(zhǎng)勢(shì)大致相同。 而在10 ℃的溫度，其余條件都相同的情況下， 帶有OsICE1 基因表達(dá)載體的香菇菌絲體長(zhǎng)勢(shì)要比不帶有OsICE1 基因表達(dá)載體的香菇菌絲體長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)， 但是明顯比25 ℃情況下的菌絲長(zhǎng)勢(shì)弱。 由此可見，帶有OsICE1 基因的香菇菌絲體可以在一定程度上抗寒， 比正常的香菇菌絲體長(zhǎng)勢(shì)好。

3 結(jié)論

香菇是一種重要的食用菌， 溫度是影響香菇菌絲生長(zhǎng)的重要因素， 每年有大面積的香菇遭受到寒冷溫度的威脅，導(dǎo)致其產(chǎn)量下降［14］。 OsICE1是水稻中的一種冷調(diào)控關(guān)鍵蛋白， 在水稻抗寒種質(zhì)創(chuàng)制中具有重要作用。 通過對(duì)水稻耐冷基因OsICE1 的克隆， 構(gòu)建了pCsV1300-OsICE1 表達(dá)載體。完成了對(duì)香菇菌絲體的轉(zhuǎn)化?？购栽囼?yàn)的測(cè)試可以看出，在10 ℃的溫度，其余條件都相同的情況下， 有OsICE1 基因的香菇菌絲體比不帶有OsICE1 基因的香菇菌絲體長(zhǎng)勢(shì)好。 由此可見，水稻耐冷基因OsICE1 的克隆與轉(zhuǎn)基因香菇菌絲體的創(chuàng)制的可行性［15］。