張來斌 馬光皇 劉語涵 賀鵬鵬 肖海兵 楊明祿

摘要：分析棗癭蚊圖爾病毒（DjTV-2a）衣殼蛋白的理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)及抗原表位。從UniProt數(shù)據(jù)庫中得到DjTV-2a衣殼蛋白的氨基酸序列，利用Expasy、TMHMM、DNAStar、SignalP 5.0、TMHMM、NetPhos 3.1、NET CGlyc 1.0、SOPMA、SWISS-MODEL等生物信息學(xué)軟件，預(yù)測(cè)DjTV-2a衣殼蛋白的理化性質(zhì)、氨基酸組成、親疏水性、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)、磷酸化位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和抗原表位等。結(jié)果表明，DjTV-2a衣殼蛋白是由449個(gè)氨基酸構(gòu)成的親水蛋白，分子式為C 2 337H 3 607N 601O 689S 15，分子量為51.6 ku，理論等電點(diǎn)為5.98;主要二級(jí)結(jié)構(gòu)是無規(guī)則卷曲，存在82個(gè)磷酸化位點(diǎn)和1個(gè)糖基化位點(diǎn)，無信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu);該蛋白有21個(gè)B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位和10個(gè)T細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位。DjTV-2a衣殼蛋白屬親水蛋白，具有多個(gè)抗原表位，預(yù)測(cè)其具有免疫原性，是可用作建立血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)的潛在抗原。

關(guān)鍵詞：棗癭蚊;圖爾病毒;衣殼蛋白;生物信息學(xué);抗原表位

中圖分類號(hào)：S433.89;S186 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）09-0033-04

棗癭蚊屬雙翅目癭蚊科，是棗樹等果樹的重要害蟲之一。棗樹在發(fā)芽過程中，棗癭蚊吸吮葉汁，破壞幼芽和新葉，最終導(dǎo)致果實(shí)產(chǎn)量減少[1-2]。隨著新疆大面積推廣和發(fā)展矮化密植棗園的生產(chǎn)方式以及不合理使用農(nóng)藥導(dǎo)致傳統(tǒng)棗園的生態(tài)條件發(fā)生了改變，致使棗癭蚊的危害日益加重。因此，必須對(duì)其進(jìn)行有效防治[3]。

圖爾病毒屬是囊泡病毒科的第2個(gè)屬，目前僅記錄了2個(gè)毒株，美雙緣姬蜂圖爾病毒（Diadromus pulchellus toursvirus 1，DpTV-1a）和棗癭蚊圖爾病毒（Dasineura jujubifolia toursvirus 2，DjTV-2a）[4-5]。2018年，首次在棗癭蚊體內(nèi)發(fā)現(xiàn)圖爾病毒[6]，這為棗癭蚊的防控提供了新思路。DjTV-2a 是大型的單鏈DNA病毒，這種病毒的衣殼是由病毒衣殼蛋白亞基形成的寡聚體，也稱殼體[6-7]。衣殼包裹著DjTV-2a的遺傳物質(zhì)，具有免疫原性的作用，在DjTV-2a的侵染和運(yùn)動(dòng)中起著重要作用[7]。本研究對(duì)棗癭蚊圖爾病毒衣殼蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期為進(jìn)一步研究致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為開發(fā)DjTV-2a血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

登錄UniProt（https：//sparql.uniprot.org/）網(wǎng)站并查找DjTV-2a的登錄信息，得到該病毒衣殼蛋白氨基酸序列，登錄號(hào)為A0A6G6ZQ66。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 理化性質(zhì)分析

使用Expasy（https：//www.expasy.org/）中的ProtParam預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，如分子式、氨基酸數(shù)量、分子量、理論等電點(diǎn)和不穩(wěn)定系數(shù);使用Expasy（https：//www.expasy.org/）中的ProtScale預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的親水性[8]。

1.2.2 信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域分析

使用SignalP 5.0軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的信號(hào)肽;使用TMHMM軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)[9]。

1.2.3 磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)分析

使用NetPhos 3.1軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn);使用NET CGlyc 1.0軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetCGlyc/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的糖基化位點(diǎn)[10]。

1.2.4 二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

使用SOPMA軟件（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu);使用SWISS-MODEL軟件（https：//swissmodel.expasy.org）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)[11]。

1.2.5 抗原表位預(yù)測(cè)

使用DNAStar中的Protean軟件，利用Jameson-Wolf法和AMPHI法預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的B細(xì)胞抗原位點(diǎn)和T細(xì)胞抗原位點(diǎn)[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 DjTV-2a衣殼蛋白理化性質(zhì)分析

ProtParam軟件分析結(jié)果表明，DjTV-2a衣殼蛋白的分子量為51.6 ku，分子式為 C 2 337H 3 607N 601O 689S 15，原子總數(shù)為7 249，理論等電點(diǎn)（pI）為5.98，脂肪系數(shù)為85.66。DjTV-2a衣殼蛋白由449個(gè)氨基酸構(gòu)成（表1），其中帶負(fù)電荷的氨基酸殘基（Asp+Glu）有53個(gè)，帶正電荷的氨基酸殘基（Arg+Lys）有49個(gè)。不穩(wěn)定指數(shù)為47.40，親水性平均系數(shù)為-0.319，屬不穩(wěn)定的親水蛋白（圖1）。

2.2 DjTV-2a衣殼蛋白信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域分析

使用SignalP 5.0軟件和TMHMM軟件對(duì)該蛋白進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)DjTV-2a衣殼蛋白無信號(hào)肽（圖2），無信號(hào)識(shí)別功能，且無跨膜結(jié)構(gòu)域（圖3），預(yù)測(cè)其為非分泌蛋白。

2.3 DjTV-2a衣殼蛋白磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)分析

使用NetPhos 3.1軟件和NET CGlyc 1.0軟件對(duì)該蛋白進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)DjTV-2a衣殼蛋白具有33個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，31個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，18個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)（圖4），且在370位點(diǎn)存在1個(gè)糖基化位點(diǎn)。A994FED6-A6C1-432E-85EC-58668DDCE5D0

2.4 DjTV-2a衣殼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

使用SOPMA軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)DjTV-2a衣殼蛋白有100個(gè)α-螺旋（Hh），占22.27%;109個(gè)β-折疊（Ee），占24.28%;18個(gè) β-轉(zhuǎn)角（Tt），占4.01%;222個(gè)無規(guī)則卷曲（Cc），占49.44%（圖5）。使用SWISS-MODEL軟件建立DjTV-2a衣殼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，序列一致性為32.71%，全局模型質(zhì)量評(píng)估（GMQE）和QMEAN評(píng)分分別為0.65、0.63（圖6）。

2.5 DjTV-2a衣殼蛋白抗原表位預(yù)測(cè)

使用DNAStar中的Protean軟件預(yù)測(cè)DjTV-2a衣殼蛋白的抗原表位。以Jameson-Wolf法，結(jié)合親水性、柔韌性和可及性，綜合分析預(yù)測(cè)DjTV-2a衣殼蛋白的優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞抗原表位有21個(gè)，分別位于5～23、24～42、45～55、60～71、78～87、99～106、107～111、134～140、149～166、171～182、189～197、203～220、224～228、237～252、259～270、280～298、311～318、322～332、336～385、390～399、413～426位氨基酸殘基或附近;利用AMPHI法和Rothbard-Taylor法預(yù)測(cè)DjTV-2a衣殼蛋白的T細(xì)胞抗原表位有10個(gè)，分別位于22～31、44～53、93～97、113～127、134～138、146～149、300～302、339～342、357～372、394～406位氨基酸殘基或附近（圖7）。綜合分析可知，DjTV-2a衣殼蛋白存在多個(gè)潛在的優(yōu)勢(shì)抗原表位。

3 討論與結(jié)論

生物信息學(xué)在生命科學(xué)研究中發(fā)揮了重要作用，被廣泛用于預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和抗原表位等[13]。對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析，可為蛋白質(zhì)的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)并提供理論支撐，減少試驗(yàn)的盲目性和失敗率。

本研究利用生物信息軟件分析預(yù)測(cè)了DjTV-2a衣殼蛋白的理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)以及蛋白抗原表位。DjTV-2a衣殼蛋白由449個(gè)氨基酸構(gòu)成，理論等電點(diǎn)為5.98，不穩(wěn)定指數(shù)為47.40，是不穩(wěn)定的親水蛋白。DjTV-2a衣殼蛋白存在82個(gè)磷酸化位點(diǎn)和1個(gè)糖基化位點(diǎn)，推測(cè)蛋白受磷酸化調(diào)控和糖基化修飾，有助于形成抗原。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和抗原表位有很大聯(lián)系，DjTV-2a衣殼蛋白主要二級(jí)結(jié)構(gòu)為無規(guī)則卷曲，其次為β-折疊和 α-螺旋，所以存在較多的抗原表位。因?yàn)榘被岬囊患?jí)結(jié)構(gòu)是DNAStar的分析根本， 所以對(duì)參數(shù)的分析結(jié)果并不完全準(zhǔn)確[14]。因此，必須與其他抗原性較大的蛋白進(jìn)行比較或合成表位多肽驗(yàn)證結(jié)果正確性[15-16]。綜合分析蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)，可以推測(cè)DjTV-2a衣殼蛋白有21個(gè)B細(xì)胞抗原表位、10個(gè)T細(xì)胞抗原表位，該蛋白是容易識(shí)別的潛在優(yōu)勢(shì)抗原，為后續(xù)基于血清學(xué)檢測(cè)DjTV-2a提供了理論依據(jù)。

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