雷栓虎 郭麗 管曉鸝 張霞 岳海源 周斌 劉京升 汪玉良

1.蘭州大學第二醫(yī)院，甘肅 蘭州 730030；2.甘肅省婦幼保健院，甘肅 蘭州 730050

骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是干細胞家族的重要成員，主要存在于生物體的骨髓中。BMSCs 分化能力較強[1］，不僅可分化為造血細胞，還可分化為成骨細胞[2］、神經(jīng)細胞[3］等。BMSCs 取材方便，容易培養(yǎng)純化，可以作為良好的種子細胞[4］，通過細胞移植在生物醫(yī)學工程領域發(fā)揮重要作用[5，6］，已有報道將BMSCs 用于治療多種疾病，例如骨發(fā)育不全癥、黏多糖癥等[7，8］。

骨折不愈合或延遲愈合在臨床中很常見，嚴重影響了患者的康復和生活。BMSCs 已經(jīng)證實在體內外誘導培養(yǎng)下可以分化為成骨細胞。本實驗設計將自體染色標記的BMSCs 移植于骨折部位，觀察其對骨痂形成的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雌性SD 大鼠，體重160～230g，6～8 周齡，SPF 級，購自蘭州大學實驗動物中心（動物質量合格證號：SCXK 甘2013-0002），動物保護協(xié)議經(jīng)《蘭州大學實驗動物使用倫理委員會》批準。

1.2 實驗試劑 5-溴脫氧尿嘧啶核（BrdU）（Sigma 公司）、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（Sigma 公司）、IX70 倒置相差顯微鏡（Olympus 公司）、0.9 mm 的克氏針和微量注射器（上海醫(yī)用公司）、游標卡尺（Mitutoyo corporation）、X 光機（型號：SIEⅧNS mX）、ABl04 一N 型電子秤（梅特勒公司），精確度0.01mg。

1.3 實驗方法

1.3.1 BMSCs 的原代分離與培養(yǎng)[9，10］。取SD 大鼠一只，頸椎脫臼法處死，將大鼠移入超凈工作臺內，無菌條件下取出雙側股骨和脛骨，用DMEM/F12 培養(yǎng)液沖洗股骨、脛骨骨髓，配制細胞懸液。按照細胞培養(yǎng)方法依次接種、培養(yǎng)、傳代。

1.3.2 BMSCs 的形態(tài)學觀察。鏡下觀察BMSCs 生長、增殖情況并記錄。

1.3.3 BMSCs 表面標志檢測。0.25%的胰蛋白酶和1mm MEDTA 在37℃中孵育第三代BMSCs 3 到4min，然后按照1×105個/mL 的濃度接種。PBS 洗滌細胞后加入鼠單克隆抗體（抗CD34、抗CD44、抗CD45）在4℃的暗室中孵育30 min，PBS 洗滌2 次，離心棄上清液，加入PBS 重懸，用流式細胞儀檢測目標細胞。

1.3.4 BrdU 的體外標記與檢測。取第三代BMSCs，以1×105個/mL 的濃度接種于96 孔板中，在細胞生長融合前48h，以濃度為10μmol/L 的BrdU 標記BMSCs，孵育至細胞融合，免疫組化染色。

1.3.5 DAPI 的體外標記與檢測。取第三代BMSCs，以1×105個/mL 的濃度接種于96 孔板中，在細胞生長融合前30min，以濃度為20μg/mL 的DAPI 標記BMSCs，孵育至細胞融合，測定DAPI。

1.3.6 MTT 法檢測細胞增殖力。加入20μL（5mg/mL）的MTT，在37℃下孵育4 小時后加入150μL 二甲基亞砜，輕輕晃動溶解細胞代謝產(chǎn)物，調零后檢測490 吸光度值。

1.3.7 動物模型的建立。SD 大鼠麻醉后仰臥位固定，左脛骨消毒，切開皮膚，在脛骨中斷逐層分離暴露，擺鋸橫行截斷脛骨中段，采用克氏針髓內固定骨折斷端，造模成功后逐層縫合關閉切口，術后石膏輔助固定。

1.3.8 實驗分組與BMSCs 標記移植。24 只SD 大鼠隨機分為三組（n=8），A 組為單純左脛骨骨折組，B 組為左脛骨骨折+DMEM 組，C 組為左脛骨骨折+BMSCs 移植組。術前兩周C 組取自體BMSCs，待模型建立兩天后，將BrdU 標記好的BMSCs 配成細胞懸液，密度為1×107/mL，在骨折斷端周圍2mm 處注入50μL 細胞懸液。同時B 組局部注射等量DMEM。術后分別于1、2、3、4 周于左脛骨骨折部位取材，石蠟包埋后切片，行免疫組化檢測。

1.3.9 脛骨DR。分別于術后1、2、3、4 周拍攝左側脛骨正、側位片，游標卡尺（精確度0.01mm）測量骨痂寬度。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0 軟件對數(shù)據(jù)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以±s 表示。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 BMSCs 的分離、培養(yǎng)和擴增 實驗中，細胞期初呈懸浮狀態(tài)，圓形，較為混雜，24h 后細胞開始貼壁，48h 換液后細胞形態(tài)呈多樣化，1 周后可見BMSCs 開始形成細胞克隆，呈梭形的鋪路石樣外觀。當細胞融合達到80%左右時，進行細胞傳代，傳至第三代時，細胞形態(tài)均勻、統(tǒng)一，呈長梭形。見圖1。

圖1 第三代BMSCs 形態(tài)學觀察（倒置相差顯微鏡×200）

2.2 流式細胞儀檢測BMSCs 免疫表型 培養(yǎng)至第三代的BMSCs 免疫表型分別為CD44 81.27%（圖2A）、CD34 2.32%（圖2B）、CD45 0.35%（圖2C）。結合BMSCs的生物學特性及免疫表型的表達結果，證明實驗中成功分離出了高純度的大鼠骨髓間充質干細胞[11，12］。

圖2 流式細胞儀檢測BMSCs 免疫表型

2.3 BrdU 染色標記BMSCs 取生長狀態(tài)良好的第三代BMSCs，在細胞生長融合前48 h，以濃度為10μmol/L的BrdU 染色細胞。結果可見超過95%的BMSCs 陽性表達（圖3）。相差顯微鏡下觀察BMSCs，細胞生長良好。

圖3 BrdU 染色標記BMSCs（倒置相差顯微鏡×200）

2.4 DAPI 染色標記BMSCs 取生長狀態(tài)良好的第三代BMSCs，在細胞生長融合前30min，以濃度為20μg/mL的DAPI 染色細胞，結果可見超過98%的BMSCs 陽性表達（圖4）。相差顯微鏡下觀察BMSCs，見細胞生長良好。

圖4 DAPI 染色標記BMSCs（倒置相差顯微鏡×200）

2.5 脛骨DR 骨痂測量 術后第1、2 周時A、B、C 三組骨折斷端骨痂較少，骨折線清晰可見（圖5），三組實驗動物骨痂寬度無明顯差異（P＞0．05）；在術后第3、4周時，A、B、C 三組骨折線逐漸模糊，斷端有較多骨痂包繞，但C 組骨折斷端骨痂明顯多于A、B 兩組，骨小梁豐富，骨折趨于愈合，骨痂寬度較A、B 兩組有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖6。

圖5 術后第三周三組DR 攝片

圖6 脛骨DR 骨痂測量

3 討論

骨髓間充質干細胞（BMSCs）是干細胞家族的重要成員之一，分離、純化的BMSCs 對生物組織工程及再生醫(yī)學具有重要意義。目前，BMSCs 分離、純化方法主要有密度梯度離心法[13］、貼壁細胞分離法[14］、流式細胞儀和免疫磁珠分離法（MACS）[15］。后兩種方法代價昂貴、操作復雜，難以廣泛開展，pittenger 報道的密度梯度離心法耗時較多，細胞損傷和污染發(fā)生率較高[16］，因而也較少使用。貼壁細胞分離法是根據(jù)干細胞黏附、貼壁的特性來剔除其他懸浮生長的雜細胞，該方法簡單、有效，多次傳代后可獲得純度較高的BMSCs。本次實驗中，我們選用該方法來分離和純化BMSCs，效果良好。

BMSCs 的鑒定方法主要是通過檢測細胞免疫表型并結合其生物形態(tài)的特征來確定。在本次實驗中，我們檢測到目標細胞CD44 表達陽性，而CD45 和CD34陰性，結合細胞形態(tài)呈均勻的長梭形，因此，實驗結果證明我們成功的分離、培養(yǎng)出了BMSCs[17］。

BrdU 是一種嘧啶類似物，其檢測準確性高，標記率高，安全簡便，BrdU 和靶細胞DNA 結合后經(jīng)過免疫組化染色可呈現(xiàn)綠色熒光。在本次實驗中，我們選用標記時間為48 小時，終濃度為10μmol/L 的BrdU 染色靶細胞，其有效標記率大于95%，同時MTT 檢測實驗組細胞生長狀態(tài)良好。實驗結果表明，利用BrdU 檢測跟蹤移植后細胞動態(tài)變化是一種很好的方法[18］。

DAPI 與目標細胞的雙鏈DNA 結合后能產(chǎn)生比其自身強20 多倍的熒光，DAPI 也可以和RNA 結合，但產(chǎn)生的熒光強度較弱。在本次實驗中，我們選用標記時間為30 分鐘，終濃度為20μg/mL 的DAPI 染色靶細胞，其有效標記率大于98%，同時MTT 檢測實驗組細胞生長狀態(tài)良好。實驗結果表明，DAPI 是一種簡單、方便的細胞標記方法，其標記效率高，而且無細胞毒性[18］。

骨折的愈合是一個非常復雜的過程，臨床實際工作中，骨折不愈合或延遲愈合很常見，這嚴重影響了患者的康復鍛煉和早日回歸社會。BMSCs 已經(jīng)證實在體內外誘導培養(yǎng)可以分化為成骨細胞。那么，將BMSCs移植在骨折處是否會促進骨折的愈合。因此，本實驗將自體染色標記的BMSCs 移植于骨折部位，觀察其對骨痂形成的影響。

骨折的愈合不僅需要良好的固定、制動，同時與周圍神經(jīng)也有密切的關系[19，20］，周圍神經(jīng)通過釋放某些神經(jīng)介質調節(jié)骨折的愈合過程。此外，骨折斷端的血運條件對其愈合也很關鍵，有研究發(fā)現(xiàn)[21］神經(jīng)肽物質CGRP 具有調節(jié)血管舒張，增加骨折斷端血運，加速骨折愈合的作用。

BMSCs 可以分化為多種細胞[22］，既往許多自體骨髓移植動物實驗結果表明：骨髓移植能促進骨愈合[23］。本實驗通過使用大鼠BMSCs 自體移植，探索其對骨折愈合的影響。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，在術后第1、2 周時（血腫炎癥機化期），實驗動物骨折斷端骨痂包繞較少，骨折線清晰可見，三組實驗動物骨痂寬度無明顯差異，在術后第3、4 周時（骨痂形成塑形期），A、B、C 三組實驗動物骨折線逐漸模糊，斷端開始逐漸有較多骨痂包繞，但C 組骨折斷端骨痂明顯多于A、B 兩組，骨小梁豐富，骨折趨于愈合，骨痂寬度較A、B 兩組有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。上述實驗結果表明：大鼠骨髓間充質干細胞（BMSCs）自體移植對骨折愈合有積極促進作用，其機制可能是BMSCs 在骨折處聚集，同時受到體內環(huán)境及各種因子誘導，改變了成骨細胞及破骨細胞之間的動態(tài)平衡，從而影響了骨折愈合的進程。但是，骨折愈合受諸多因素的影響，是一個極其復雜的過程，其具體修復機制還有待進一步研究。