劉拂曉，王寧，趙地, 2，李靜，孟海藍，李紫薇, ，于永樂，董雅琴，尼博

(1.青島農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，山東青島 266109; 2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018; 3.青島市黃島區(qū)市場監(jiān)督管理局，山東青島 266500; 4.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032)

A型塞尼卡病毒(Senecavirus A, SVA)，舊稱塞尼卡谷病毒(Seneca Valley virus, SVV)，屬于小RNA病毒科(Picornaviridae)、塞尼卡病毒屬(Senecavirus)成員。SVA目前是塞尼卡病毒屬的唯一成員[1]。該病毒最初作為人胚胎視網(wǎng)膜細胞的污染物被發(fā)現(xiàn)，2007年首次在加拿大的豬場發(fā)現(xiàn)該病毒感染的豬群[2]。該病毒可導致豬的口吻部、蹄冠部出現(xiàn)水皰樣病變，其臨床癥狀與其他水皰型疫病(如口蹄疫、豬水皰病)所引起的癥狀難以區(qū)分。除此之外，SVA可導致流行性新生仔豬暫時性死亡。目前，SVA感染已在全球多個國家有所報道，如美國[3]、巴西[4]、泰國[5]等。我國于2015年在廣東省發(fā)現(xiàn)該病，目前全國已有多個省份暴發(fā)了該病，給養(yǎng)豬業(yè)造成較大的經(jīng)濟損失[6]。

SVA顆粒呈二十面體對稱，直徑大約27 nm。病毒衣殼由三個主要結構蛋白VP1、VP2和VP3鑲嵌拼接而成，另一個結構蛋白VP4則位于病毒粒子內(nèi)部。病毒基因組為單股正鏈RNA，5′端不含有帽子結構，3′端含有多聚A序列。整個基因組本質(zhì)上是一條mRNA，由5′非編碼區(qū)(5′ untranslated region, 5′ UTR)、多聚蛋白的開放閱讀框(open reading frame, ORF)及3′非編碼區(qū)(3′ untranslated region, 3′ UTR)構成。5′ UTR含有內(nèi)部核糖體進入位點(internal ribosome entry site, IRES)，使得病毒蛋白的翻譯不依賴于帽子結構。本課題組前期已證明，IRES內(nèi)部含有對病毒復制必需的假結(pseudoknot)結構[7-8]，而且假結與起始密碼子AUG之間的距離較為保守[9]。多聚蛋白的ORF呈典型的“L-VP4-VP2-VP3-VP1-2A-2B-2C-3A-3B-3C-3D”分布[10]。SVA的3′ UTR較短，除了多聚A尾巴，不足70個核苷酸(nucleotide, nt)，該區(qū)域目前的研究較少。Hales等[11]預測該區(qū)域含有一個潛在的吻環(huán)(kissing loop)結構。吻環(huán)是一類特殊的RNA結構，本質(zhì)上屬于一種RNA假結結構，由兩個臨近頸環(huán)結構的末端RNA環(huán)通過“吻合”作用形成。Hales等[11]的報道預測該結構可能與病毒的復制等分子機制相關，但未進行試驗證實。

小RNA病毒的分子機制可借助于病毒的微型基因組(minigenome)進行初步研究。通?？蓪⒉《镜亩嗑鄣鞍譕RF替換成熒光素酶或綠色熒光蛋白ORF，進而將其cDNA克隆至合適的質(zhì)粒，從而構建病毒的微型基因組質(zhì)粒。通過分析熒光素酶活性，從而可以初步判斷5′或(和)3′ UTR的分子修飾對病毒多聚蛋白表達的影響。本研究通過構建吻環(huán)形成基序(motif)突變的SVA(CH-LX-01-2016株[12])微型基因組，研究了所有吻環(huán)結構的突變基序?qū)anoLuc?熒光素酶(NanoLuc?luciferase, NLuc)表達的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞及質(zhì)粒

表達T7 RNA聚合酶的BSR-T7/5細胞，中國動物衛(wèi)生與流行病學中心惠贈；SVA CH-LX-01-2016株(GenBank，KX751945.1)野生型(wild-type, wt)微型基因組(M-0)，青島農(nóng)業(yè)大學預防獸醫(yī)學實驗室構建并保存[8]；螢火蟲熒光素酶(firefly luciferase, FLuc)表達質(zhì)粒(plasmid of FLuc, pFLuc)，山東大學張友明教授惠贈。

1.2 主要試劑

DpnI、PrimeSTAR Max Premix，寶日醫(yī)生物技術有限公司(TAKARA)公司；TOP10感受態(tài)細胞，上海昂羽生物技術有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；Opti-MEMTM減血清培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、Lipofectine 2000轉(zhuǎn)染試劑，賽默飛世爾科技公司；VivaCell胎牛血清，上海逍鵬生物科技有限公司；G418，北京索萊寶科技有限公司；Renilla-LumiTMLuciferase Assay Kit、Firefly Luciferase Reporter Gene Assay Kit，上海碧云天生物技術有限公司。

1.3 3′ UTR二級結構及吻環(huán)預測

通過在線服務器UNAFold Web Server (http://www.unafold.org/)預測SVA CH-LX-01-2016株3′ UTR RNA二級結構。其3′ UTR的吻環(huán)結構參考SVV-001株的預測結果[11]。

1.4 突變型微型基因組的構建

設計7對突變引物(表1)，通過定點突變(site-directed mutagenesis, SDM)方法對野生型微型基因組M-0進行改造，共構建7個突變型微型基因組，使其吻環(huán)形成基序獲得所有可能的突變組合，即3個單核苷酸突變、2個雙核苷酸突變和1個三核苷酸突變。以M-0為模板，分別使用7對SDM引物進行高保真PCR反應。高保真酶為PrimeSTAR Max Premix，反應條件設定為：98 ℃ (10 s)、58 ℃ (5 s)、72 ℃ (38 s)，共30次熱循環(huán)。PCR反應產(chǎn)物進行DpnI酶切反應以降解M-0模板。酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細胞，涂布含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37 ℃過夜培養(yǎng)。次日，挑取單菌落至氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后送派森諾公司進行突變位點的測序。測序正確的質(zhì)粒，采用質(zhì)粒小量提取試劑盒進行提取，并測濃度。所有提取的質(zhì)粒及M-0進行瓊脂糖凝膠電泳分析。

表1 用于構建突變型微型基因組的SDM引物

1.5 微型基因組及pFLuc共轉(zhuǎn)染

將BSR-T7/5細胞接種24孔細胞培養(yǎng)板，置于37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞密度至70%時，將構建的7個微型基因組分別與pFLuc共轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細胞。首先取一無菌EP管配制轉(zhuǎn)染復合液，包含170 μL Opti-MEMTM減血清培養(yǎng)基、1 500 ng微型基因組、1 500 ng pFLuc及6 μL Lipofectine 2000轉(zhuǎn)染試劑。然后將復合液室溫靜置15 min后，加至細胞孔中，每個樣品分別轉(zhuǎn)染3個孔，每孔60 μL，置于37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。最后，移棄轉(zhuǎn)染液上清，每孔補加500 μL含4%胎牛血清的DMEM，置于37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.6 雙熒光素酶報告分析

微型基因組及pFLuc共轉(zhuǎn)染的24孔板在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后將其取出，凍融2次，低速離心收獲上清，轉(zhuǎn)至白色不透明96孔板，利用全波長酶標儀進行雙熒光素酶報告分析。使用Renilla-LumiTMLuciferase Assay Kit和Firefly Luciferase Reporter Gene Assay Kit分別測定NLuc和FLuc熒光值。NLuc熒光值對應微型基因組，F(xiàn)Luc熒光值為內(nèi)參值。所有熒光值都減掉背景值，以消除背景熒光干擾。采用GraphPad Prism軟件(8.0版)將NLuc熒光值、FLuc熒光值及二者的比值分別繪制柱狀圖，并進行雙尾Student’st檢驗分析。

2 結果與分析

2.1 3′ UTR二級結構及吻環(huán)預測

SVA CH-LX-01-2016株基因組結構及3′ UTR序列如圖1所示。

圖1 SVA基因組結構及3′ UTR序列

通過在線服務器UNAFold Web Server (http://www.unafold.org/)預測該毒株3′ UTR的RNA二級結構如圖2A，其包括兩個相鄰的頸環(huán)結構，兩個末端環(huán)通過潛在的三堿基對(U-A、U-A、C-G)“吻合”途徑形成吻環(huán)結構(圖2B)。

圖2 SVA 3′ UTR二級結構(A)及潛在的吻環(huán)結構(B)

2.2 突變型微型基因組的構建

野生型微型基因組質(zhì)粒結構如圖3所示。該微型基因組骨架為pUC57質(zhì)粒，上游受T7啟動子(pT7)調(diào)控，下游受T7終止子(T7t)調(diào)控。BSR-T7/5細胞可表達T7 RNA聚合酶，微型基因組在胞內(nèi)可以轉(zhuǎn)錄mRNA，進而通過IRES啟動NLuc的表達。

圖3 野生型SVA微型基因組質(zhì)粒結構

通過SDM，對吻環(huán)形成基序進行定點突變，總共獲得7個突變型微型基因組(M-1至M-7)，其突變位點如圖4綠色字母所示。

圖4 SVA微型基因組突變位點(綠色字母所示)

通過Sanger測序?qū)-1至M-7進行分析，如圖5所示，突變位點對應的峰圖以相應字母標記。

圖5 SVA微型基因組Sanger測序(字母所示突變位點)

經(jīng)測序鑒定正確的質(zhì)粒進行瓊脂糖凝膠電泳，如圖6所示。

圖6 SVA微型基因組質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳

2.3 雙熒光素酶報告分析

7個突變型微型基因組分別與pFLuc共轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細胞后進行雙熒光素酶報告分析。NLuc和FLuc表達情況分別見圖7A和7B，二者比值見圖7C。圖7表明，7個突變型微型基因組皆可表達NLuc。與對照組(M-0)相比，雖然M-4和M-7組表現(xiàn)出統(tǒng)計學極顯著差異(p值小于0.01)(圖7C)，但實際NLuc發(fā)光值并未顯著降低至較低水平(圖7A)，說明吻環(huán)基序的所有單一或組合突變，并未破壞蛋白表達。

圖7 雙熒光素酶報告分析

3 討論

SVA屬于小RNA病毒屬成員，其基因組是一條單股、正鏈、線性的RNA，長約7 300 nt，兩端為UTR[13]。5′ UTR長約670 nt，3′ UTR則不足70 nt。小RNA病毒的3′ UTR雖然序列較短，但某些關鍵基序可能影響病毒的復制。例如，腸道病毒是一類常見的小RNA病毒，其3′ UTR含有復雜的RNA二級結構[14]，如6堿基配對的典型吻環(huán)結構[15-17]，這種結構對病毒的復制而言是必需的。如果這種6堿基配對結構出現(xiàn)錯配，繼而導致吻環(huán)結構破壞，那么可能導致溫度敏感型或致死性子代病毒的出現(xiàn)。因此，3′ UTR吻環(huán)結構可能決定著某些小RNA病毒的復制特性。

另有研究表明，小RNA病毒基因組復制過程中，線性基因組會出現(xiàn)環(huán)化現(xiàn)象，宿主蛋白在環(huán)化過程中充當“蛋白橋”的作用[18]，“蛋白橋”兩端的“橋頭”蛋白分別連接基因組的5′和3′末端。因此，雖然3′ UTR遠離5′ UTR，但前者的二級或高級結構發(fā)生改變，則可能導致“蛋白橋”的連接作用失活，從而導致病毒基因組復制或(和)多聚蛋白表達失敗。另外，如果3′ UTR含有類似吻環(huán)結構的順勢作用元件，那么其突變后可能直接影響與反式作用因子的結合，從而潛在干擾病毒的增殖。雖然SVA 3′ UTR RNA結構影響病毒復制或蛋白表達的研究鮮有報道，但Hales等[11]預測該區(qū)域含有一個吻環(huán)結構，其可能與病毒的復制等分子機制相關，但未進行試驗證實。因此，這促使我們通過微型基因組初步對該結構進行了研究。

NLuc是一種新發(fā)現(xiàn)的熒光素酶[19]，其ORF僅有516 nt。由于NLuc ORF替換了6 546 nt的多聚蛋白ORF，SVA微型基因組方便了病毒分子機制的研究。本研究通過SDM構建了7個不同突變型微型基因組，這些微型基因組包括了所有單一和復合點突變。通過雙熒光素酶報告分析，本研究試圖探究預測的吻環(huán)結構如果被破壞，是否影響上游5′ UTR啟動蛋白表達。結果表明，盡管雙尾Student’st檢驗證明M0分別與M4和M7存在極顯著差異(圖7C)，p值分別為0.008和0.003，但實質(zhì)上所有突變型質(zhì)粒并未將NLuc的表達量降低到一個較低水平(圖7A)。換言之，吻環(huán)結構的破壞，并未破壞5′ UTR啟動蛋白表達的能力。根據(jù)本研究的結論，推測存在兩種可能：(1)SVA的3′ UTR不存在吻環(huán)結構；(2)即使存在吻環(huán)結構，該結構對病毒的復制是非必須的。究竟存在哪一種可能性，有待進一步研究證實。