郭田田，王家麒，賈瀟瀟，LAZCANO SILVEIRA Rayko，HUI SHOFARO Jessica,王鳳舞，馬澤芳，惠覓宙

(青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東青島 266109)

目前，對透明質(zhì)酸的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生理功能的研究已經(jīng)較為充分，其在醫(yī)藥和臨床上的應用也日益廣泛。大量研究表明，透明質(zhì)酸的部分生物活性與其分子量的大小有密切關(guān)系[1]。近年來，透明質(zhì)酸片段廣泛的應用前景已經(jīng)引起了國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注[2-20]，逐漸成為透明質(zhì)酸研究的熱點。因此大規(guī)模生產(chǎn)透明質(zhì)酸片段是進一步研究的前提，意義重大，值得深入研究。

分子量大小不同的透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸片段與人體多種受體相互作用，包括淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體(Lymphatic Vessel Endothelial Hyaluronic Acid Receptor 1，LYVE-1)、CD44、透明質(zhì)酸介導運動性受體(Hyaluronanmediated Motility Receptor，RHAMM)、免疫球蛋白樣凝集素(Sialic Acid-binding Immunoglobulin-type Lectins 9，SIGLEC-9)、Toll樣受體2(Toll-like Receptor 2，TLR2)、透明質(zhì)酸內(nèi)吞受體(Hyaluronan Receptor for Endocytosis，HARE)、細胞遷移誘導與透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白(Cell Migration-inducing and Hyaluronanbinding Protein，CEMIP)和跨膜蛋白2(Transmembrane Protein 2，TMEM2)。透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸片段參與調(diào)節(jié)白細胞(包括中性粒細胞、巨噬細胞、DC細胞、T細胞、B 細胞)遷移[21-22]和白細胞(包括中性粒細胞、巨噬細胞、DC細胞、T細胞、B細胞和小膠質(zhì)細胞)炎癥因子分泌[23-24]。作為受體之一的CD44是一種分布廣泛的跨膜糖蛋白，介導細胞與細胞之間、細胞與細胞外基質(zhì)之間的吸附作用，其肽鏈的N端可以和HA結(jié)合。紅細胞作為血液循環(huán)中最多的細胞群體，自身具有識別和結(jié)合抗原物質(zhì)、參與免疫反應的作用，失去細胞核的成熟紅細胞表面依舊保持CD44蛋白的高表達[25]。CD44在機體正常生理和病理生理的狀態(tài)下，絕不僅僅是單純的存在[26-29]。

因此，本研究利用重組人透明質(zhì)酸酶PH20，制備了一種人體組織滲透性好的平均分子量35 kDa的透明質(zhì)酸片段HA35注射液，并以HA35注射液和不同分子量透明質(zhì)酸片段為研究對象，探索兩者與人和不同種屬動物紅細胞之間的相互作用，為HA35注射液在臨床應用方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要試劑

中國倉鼠卵巢細胞CHO-S和pMH3表達載體質(zhì)粒由紹興惠薈生物科技有限公司提供；注射級平均分子量1 600 kDa透明質(zhì)酸原料、普通平均分子量300 kDa透明質(zhì)酸原料和平均分子量24 kDa透明質(zhì)酸片段購自華熙福瑞達生物醫(yī)藥有限公司；平均分子量60 kDa透明質(zhì)酸片段購自麗陽生物科技有限公司；anti-human CD44 antibody、anti-dog antibody、anti-mouse CD44 antibody、non-specific rabbit IgG、non-specific dog IgG、non-specific mouse IgG購自Abcam公司(英國)；瓊脂糖(Agarose)購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 主要儀器

酶解反應器(杭州安普生物工程有限公司)、滲透壓摩爾濃度測定儀(天河醫(yī)療儀器有限公司)、激流式動物細胞反應器(杭州安普生物工程有限公司)；重組人透明質(zhì)酸酶PH20純化用QFF層析柱、Phenyl HP疏水層析柱、CHT I型陶瓷羥基磷灰石層析柱、SP HP陽離子交換層析柱由軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所提供；黑背景2016型顯微鏡(哈爾濱康邦黑背景光學儀器有限公司)；電泳儀(美國Bio-Rad公司)；恒溫搖床(天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司)。

1.1.3 血樣

人靜脈血：健康志愿者共12人，年齡(24±4)歲，靜脈采血經(jīng)長春嘉和外科醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準和本人同意。

動物靜脈血：比格犬、BALB/c小鼠、內(nèi)蒙古山羊、內(nèi)蒙古黃牛、迷你豬、美洲羊駝、蒙古馬、紅顏白水貂、恒河猴和田園貓的靜脈血由青島農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)院提供。動物靜脈采血經(jīng)青島農(nóng)業(yè)大學動物倫理委員會批準。

1.2 人重組透明質(zhì)酸酶PH20的生產(chǎn)

以RISHTON等[30]中記載的方法為基礎(chǔ)，將人工合成重組人透明質(zhì)酸酶PH20的cDNA插入富含GC的pMH3載體，構(gòu)建pMH3-PH20表達載體；再將pMH3-PH20表達載體轉(zhuǎn)入CHO-S細胞系，篩選高表達PH20的CHO-S細胞系，并在激流式動物細胞反應器進行放大和大規(guī)模培養(yǎng)；將含有PH20的豐收液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后經(jīng)QFF層析柱、Phenyl HP疏水層析柱、CHT I型陶瓷羥基磷灰石層析柱和SP HP陽離子交換層析柱4步純化，再經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后制成純度大于98.5%的無菌的有糖化的重組人透明質(zhì)酸酶PH20[31-32]。

1.3 低分子量透明質(zhì)酸片段的制備

1.3.1 使用重組人透明質(zhì)酸酶PH20制備

取1支離心管加入10 mL超純水，分多次加入1 600 kDa透明質(zhì)酸原料200 mg，反復震蕩混勻，直至透明質(zhì)酸全部溶于水；按表1加入MgCl2、NaCl調(diào)節(jié)滲透壓，反復混勻；加入人PH20(27 000 U/mL)至終濃度為20 000 U/g。置于37 ℃搖床，于處理后8 min、16 min、24 min、32 min、40 min、48 min、56 min、64 min取降解產(chǎn)物1 mL于離心管中，取完的樣品標記后迅速置于-20 ℃冰箱。

表1 人重組透明質(zhì)酸酶PH20酶解透明質(zhì)酸原料的反應體系

1.3.2 使用牛睪丸透明質(zhì)酸酶PH20制備

取1支離心管加入10 mL超純水，分多次加入1 600 kDa透明質(zhì)酸原料200 mg，反復震蕩混勻，直至透明質(zhì)酸全部溶于水；按表2加入MgCl2、NaCl調(diào)節(jié)滲透壓，反復混勻；加入牛PH20(1 500 U/mL)至終濃度為20 000 U/g；置于37 ℃搖床，于處理后1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h取降解產(chǎn)物1 mL于離心管中，取完的樣品標記后迅速置于-20 ℃冰箱。

表2 牛睪丸透明質(zhì)酸酶PH20酶解透明質(zhì)酸原料的反應體系

1.3.3 瓊脂糖凝膠電泳法測定透明質(zhì)酸片段的分子量

將全部樣品置于95 ℃的水浴鍋內(nèi)加熱45 min，使殘留透明質(zhì)酸酶失活，將加熱完成的全部樣品置于4 ℃冰箱。取0.3 g瓊脂糖溶于30 mL TBE溶液中，微波爐中加熱沸騰3次以上，稍冷卻倒入插有制膠梳的制膠板中，待膠冷卻凝固。取15 μL標準品加入45 μL超純水制備標準品溶液，取5 μL待測樣品加入15 μL超純水制備樣品溶液，標準品和樣品終濃度均為5 mg/mL。標準品和樣品分別與上樣buffer按4∶1比例混勻。將制備好的凝膠板置于含1×TBE的電泳槽中，每個膠孔里按順序各加入20 μL的標準品和樣品，人PH20降解樣品電泳20 min，牛PH20降解樣品電泳1 h，電壓均為80 V。

1.3.4 GPC-MALLS法測定HA35的分子量及分子量分布

采用GPC-MALLS在線檢測方法分析樣品的分子量。(1)色譜條件：儀器，高效液相色譜儀(配示差檢測器)；Shodex SB-804 HQ凝膠柱(Φ8 mm×300 mm)；流動相，0.02%疊氮鈉水溶液；流速，1 mL/min；進樣量，100 μL；溫度，40 ℃；檢測器，示差檢測器、十八角激光散射檢測器。(2)樣品相對分子質(zhì)量測定：稱取適量樣品，用流動相溶解配成1 mg/mL樣品溶液，用0.22 μm濾器過濾后進樣，進行高效液相分析。(3)分子質(zhì)量分布檢測采用示差檢測器和激光檢測器，分別記錄供試品質(zhì)量濃度和供試品在不同角度的光散射強度，折光指數(shù)增加量(dn/dc)值為0.138，通過數(shù)據(jù)處理軟件ASTRA獲取供試樣品的分子質(zhì)量分布圖。

1.4 紅細胞錢串狀凝集研究

使用表3中不同分子量的透明質(zhì)酸與人、小鼠、比格犬、羊、牛、豬、羊駝、馬、水貂、猴和貓的靜脈血混合至終濃度分別為12 mg/mL、6 mg/mL、3 mg/mL、1.5 mg/mL、0.75 mg/mL、0.375 mg/mL。制備紅細胞涂片，顯微鏡下觀察不同分子量的HA引發(fā)的紅細胞錢串狀聚集情況，得出其誘發(fā)人、小鼠、比格犬、羊、牛、豬、羊駝、馬、水貂、猴和貓的紅細胞錢串狀聚集的最低濃度。

表3 不同分子量的透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸片段

1.5 紅細胞錢串狀凝集的CD44阻斷研究

使用分子量為35 kDa的HA35分別與人、小鼠、比格犬的靜脈血混合至終濃度為1.5 mg/mL，制備紅細胞涂片，顯微鏡下觀察和驗證HA35引發(fā)的紅細胞錢串狀聚集。進一步使用CD44抗體、非特異性IgG抗體、人PH20(27 000 U/mL)與人、小鼠、比格犬的靜脈血混合，終濃度分別為CD44抗體10 μg/mL、IgG抗體10 μg/mL、人PH20 1 927 U/mL。37 ℃孵育25 min，再加入HA35至濃度1.5 mg/mL。制備紅細胞涂片，顯微鏡下觀察紅細胞錢串狀聚集程度。

1.6 紅細胞沉降試驗

HA35與新鮮采集的人、比格犬、小鼠靜脈血混合至終濃度分別為1.5 mg/mL、1.1 mg/mL、0.75 mg/mL，吸取400 μL混合血液至血沉管中，靜置25 min，記錄血沉管中血紅細胞的沉降率。

2 結(jié)果與分析

2.1 低分子量透明質(zhì)酸片段的分子量測定

2.1.1 瓊脂糖凝膠電泳法檢測HA35的分子量

圖1結(jié)果顯示瓊脂糖凝膠電泳的全部條帶都處于同一水平位置，表明20 000 U/g的人重組透明質(zhì)酸酶PH20酶切效果非常強，作用8 min就已經(jīng)產(chǎn)生了酶切，而且切割制備的35 kDa透明質(zhì)酸片段HA35分子量差異非常小。

圖2結(jié)果顯示瓊脂糖凝膠電泳條帶參差不齊，第4、5、6條帶明顯比第1、2、3條帶遠，說明牛透明質(zhì)酸酶PH20切割制備的HA35分子量隨時間延長變小。

條帶1: 8 min；條帶2: 16 min；條帶3: 24 min；條帶4: 32 min；條帶5: 40 min；條帶6: 48 min；條帶7: 56 min；條帶8: 64 min；條帶9: 10 kDa透明質(zhì)酸標準品；條帶10: 50 kDa透明質(zhì)酸標準品

圖1和圖2相比，圖2中第1、2、3條帶和圖1中條帶位置相同，說明相同濃度下，人PH20切割8 min和牛PH20切割1 h產(chǎn)生的透明質(zhì)酸片段分子量相同，表明相同條件下，人重組透明質(zhì)酸酶PH20比牛睪丸透明質(zhì)酸酶PH20切割效果更快更好。

條帶1: 1 h；條帶2: 2 h；條帶3: 3 h；條帶4: 4 h；條帶5: 5 h；條帶6: 6 h；條帶7: 10 kDa透明質(zhì)酸標準品；條帶8: 50 kDa透明質(zhì)酸標準品

2.1.2 GPC-MALLS法測定HA35的分子量及分子量分布

選取6次人PH20制備的不同批次HA35樣品，使用GPC-MALLS測定平均分子量。如表4所示，結(jié)果表明6個HA35樣品的平均分子量為(35±8)kDa，其批間變異系數(shù)CV=22%。

表4 GPC-MALLS測定的6個HA35樣品的平均分子量

分子量分布結(jié)果如表5所示，(92.75±2.42)%的HA35分布在10～70 kDa之間，其分布范圍相對較小，表明生產(chǎn)方法比較穩(wěn)定可靠。

表5 GPC-MALLS測定的6個HA35樣品的分子量分布

2.2 紅細胞錢串狀凝集及CD44阻斷結(jié)果

如圖3、圖4、圖5所示，HA35與人、犬、小鼠紅細胞作用發(fā)生錢串狀聚集(圖3A、圖4A、圖5A)，加入CD44抗體即可解除這種作用(圖3B、圖4B、圖5B)，而加入Ig抗體并不能解除這種作用(圖3C、圖4C、圖5C)。CD44蛋白是紅細胞表面表達量最多的免疫分子，也是HA的主要受體。因此，以上結(jié)果表明HA35可誘發(fā)人和動物的紅細胞錢串狀聚集，并且該現(xiàn)象是由紅細胞表面的受體CD44介導的。

圖3 HA35誘導人紅細胞錢串狀聚集

圖4 HA35誘導比格犬紅細胞錢串狀聚集

圖5 HA35誘導小鼠紅細胞錢串狀聚集

2.3 HA35和不同分子量透明質(zhì)酸片段誘發(fā)紅細胞聚集與分子量的關(guān)系

不同分子量透明質(zhì)酸片段(包括HA35)誘發(fā)人、比格犬、BALB/c鼠、迷你豬、田園貓、美洲羊駝、蒙古馬、紅顏白水貂的紅細胞錢串狀聚集的最低濃度與其分子量大小呈負相關(guān)關(guān)系(圖6，表6～13)。例如，明顯誘發(fā)紅細胞錢串狀凝集的平均分子量24 kDa的透明質(zhì)酸片段的最低濃度是6 mg/mL，明顯誘發(fā)紅細胞錢串狀凝集的平均分子量35 kDa的透明質(zhì)酸片段的最低濃度是1.5 mg/mL，而明顯誘發(fā)紅細胞錢串狀凝集的平均分子量60 kDa的透明質(zhì)酸片段的最低濃度是0.375 mg/mL。這一負相關(guān)關(guān)系可被用來檢測低分子量透明質(zhì)酸片段(包括HA35)的分子量，經(jīng)驗證此方法靈敏可靠。

圖6 誘發(fā)人、比格犬、小鼠、豬、貓、羊駝、馬、水貂紅細胞錢串狀聚集的透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸片段的最低濃度和分子量之間的負相關(guān)曲線

表6 不同透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸片段誘發(fā)人紅細胞錢串狀聚集的終濃度

表7 不同透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸片段誘發(fā)比格犬紅細胞錢串狀聚集的終濃度

表8 不同透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸片段誘發(fā)小鼠紅細胞錢串狀聚集的終濃度

表9 不同透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸片段誘發(fā)豬紅細胞錢串狀聚集的終濃度

表10 不同透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸片段誘發(fā)貓紅細胞錢串狀聚集的終濃度

表11 不同透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸片段誘發(fā)羊駝紅細胞錢串狀聚集的終濃度

表12 不同透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸片段誘發(fā)馬紅細胞錢串狀聚集的終濃度

表13 不同透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸片段誘發(fā)水貂紅細胞錢串狀聚集的終濃度

2.4 低分子量透明質(zhì)酸片段誘發(fā)紅細胞聚集的種屬特異性

本研究另選取羊、牛、恒河猴作為研究對象，以研究低分子量透明質(zhì)酸片段(包括HA35)在不同種屬動物中誘發(fā)紅細胞聚集是否存在差異。結(jié)果顯示低分子量透明質(zhì)酸片段不誘發(fā)羊、牛、恒河猴紅細胞聚集(表14～表16)，提示低分子量透明質(zhì)酸片段(包括HA35)對人和不同動物的生理作用和使用劑量不同。

表14 不同透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸片段誘發(fā)羊紅細胞錢串狀聚集的終濃度

表15 不同透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸片段誘發(fā)牛紅細胞錢串狀聚集的終濃度

表16 不同透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸片段誘發(fā)猴紅細胞錢串狀聚集的終濃度

2.5 低分子量透明質(zhì)酸片段影響紅細胞沉降

通過使用人、比格犬、小鼠的靜脈血與HA35混合進行紅細胞沉降試驗，發(fā)現(xiàn)HA35誘發(fā)紅細胞沉降率增加，且一定濃度下分子量不同引發(fā)沉降率增加程度不同(表17～表19)。HA35不但誘發(fā)人和動物紅細胞錢串狀聚集，而且還誘發(fā)紅細胞沉降率增加，這個結(jié)果提示低分子量透明質(zhì)酸片段誘發(fā)紅細胞沉降率改變直接和間接影響紅細胞和白細胞血液流變學，進而產(chǎn)生對白細胞滲出的生物效應。利用低分子量透明質(zhì)酸片段分子量不同引發(fā)沉降率增加程度不同，來檢測制備的HA35不同批次間的分子量變異，從而進行生產(chǎn)質(zhì)量控制。

表17 HA35對人紅細胞沉降率的影響

表18 HA35對比格犬紅細胞沉降率的影響

表19 HA35對小鼠紅細胞沉降率的影響

3 討論

中國倉鼠卵巢細胞(CHO)生產(chǎn)的有糖化的純度大于98.5%的重組人透明質(zhì)酸酶PH20被用來皮下輸液、免疫球蛋白皮下給藥和治療性抗體皮下給藥[20,26]，和牛睪丸提取的透明質(zhì)酸酶PH20相比，人PH20注射前不需皮膚敏感試驗，靜脈注射不誘發(fā)人中和抗體產(chǎn)生[26]。

本文分別使用人工合成重組人透明質(zhì)酸酶PH20和牛睪丸透明質(zhì)酸酶PH20降解高分子透明質(zhì)酸注射級原料，制備了平均分子量為35 kDa的HA35(圖1，圖2)，并使用瓊脂糖凝膠電泳和十八角度激光方法(GPC-MALLS)測定透明質(zhì)酸片段的平均分子量和分子量分布范圍(圖1，圖2，表2，表3，表4)。使用重組人透明質(zhì)酸酶PH20降解高分子透明質(zhì)酸HA制備的HA35和高分子HA相比，黏度降低，組織滲透性增強；使用重組人透明質(zhì)酸PH20降解制備的HA35和物理(加熱或超聲)、化學(酸或堿或活性氧)方法制備的低分子透明質(zhì)酸片段相比，HA35沒有非切割部位的結(jié)構(gòu)理化損傷；使用重組人透明質(zhì)酸PH20降解制備的HA35和有免疫原性動物、昆蟲提取的或沒有糖化的微生物生產(chǎn)的透明質(zhì)酸酶制備的低分子透明質(zhì)酸片段相比，加熱使殘留重組人透明質(zhì)酸酶PH20失活后使用不引發(fā)過敏反應，注射前不需皮膚敏感試驗。

本研究首次發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸片段HA35與其他平均分子量不同的透明質(zhì)酸片段誘發(fā)人和多種試驗動物的血紅細胞錢串狀聚集，這種誘發(fā)紅細胞錢串狀聚集的透明質(zhì)酸片段的最小濃度與其分子量呈負相關(guān)(圖3，圖4，圖5，圖6)，為低分子量透明質(zhì)酸片段的分子量測定提供了新的細胞學方法，而且這種細胞學方法靈敏度高、重復性好。

CD44蛋白是一組分布廣泛的膜整合蛋白，是紅細胞表面表達量最多的免疫分子，介導細胞與細胞間及細胞與細胞外基質(zhì)間的相互作用，進一步研究發(fā)現(xiàn)，這種透明質(zhì)酸片段誘發(fā)紅細胞錢串狀聚集由透明質(zhì)酸受體CD44介導(圖3，圖4，圖5)，提示透明質(zhì)酸片段HA35通過紅細胞表面透明質(zhì)酸受體CD44參與機體功能調(diào)節(jié)[33]。

另外，本研究意外發(fā)現(xiàn)低分子量透明質(zhì)酸片段誘發(fā)內(nèi)蒙古山羊、內(nèi)蒙古黃牛和恒河猴、人、比格犬、BALB/c小鼠、迷你豬、田園貓、美洲羊駝、蒙古馬、紅顏白水貂紅細胞錢串狀凝集的現(xiàn)象完全不同(表6～表16)，存在種屬特異性。通過以上結(jié)果我們推論透明質(zhì)酸片段HA35對不同種屬生物體的治療作用和使用劑量可能不同，為透明質(zhì)酸片段HA35的進一步臨床研究提供了新的線索。

相關(guān)文獻表明HA通過與紅細胞受體CD44和白細胞受體SIGLEC-9相互作用間接影響白細胞的交通和白細胞激活[26-28]，低濃度的透明質(zhì)酸片段HA35和其他分子量不同的透明質(zhì)酸片段不但誘發(fā)人和動物紅細胞錢串狀聚集，而且還誘發(fā)紅細胞沉降率增加(表17～表19)。因此，我們推論以上與紅細胞相關(guān)的變化直接或間接影響紅細胞和白細胞血液流變學，可能與中性粒細胞在血管表面形成軸流和吸附有關(guān)，進而產(chǎn)生白細胞吸附血管壁滲出的生物效應[34-35]。目前，本研究利用不同分子量的透明質(zhì)酸片段誘發(fā)紅細胞沉降率改變來檢測平均分子量35 kDa的透明質(zhì)酸片段HA35產(chǎn)品生產(chǎn)批次間的分子量變異系數(shù)或產(chǎn)品質(zhì)量控制情況。

綜上所述，使用人工合成重組人透明質(zhì)酸酶PH20制備的35 kDa的透明質(zhì)酸片段HA35具有更好的組織滲透性、無理化損傷和過敏反應，并發(fā)現(xiàn)了HA35與人和不同動物的紅細胞的相互作用和種屬特異性，為HA35的進一步研究和應用奠定了理論基礎(chǔ)。