謝曉林,張德柱,馬 釗,李 娟,梁承遠(yuǎn)*,喬乖萍,惠 楠,王 珺,3

1.陜西盤龍藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司,西安 710021;2.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,西安 710021;3.青海省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院 青海省中藏藥現(xiàn)代化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西寧 810000

杜仲木香散出自明代董宿原所著《奇效良方》,其處方是“杜仲(炒去絲)4兩,木香4兩,官桂1兩”,是此3味藥經(jīng)過(guò)粉碎混合制成的復(fù)方中藥方劑[1]。方中杜仲補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、暖下元,腎充則骨強(qiáng),肝充則筋健[2-4];木香行氣止痛,通行三焦滯氣[5];官桂下行而補(bǔ)腎,溫陽(yáng)而通脈[6-7]。三藥合用,共奏溫陽(yáng)活血、行氣止痛之功,適用于寒濕內(nèi)阻、氣血不暢之腰痛。使用方法為“空心溫酒送服,每服二錢”[1]。杜仲木香散最早使用于明清時(shí)期,歷史悠久,因其組成較簡(jiǎn)單,主藥杜仲、木香為常用藥材,易獲得且安全范圍大,故被廣泛使用,具有良好的開(kāi)發(fā)前景。

中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是保障安全用藥的重要手段之一,是國(guó)家或者藥品行業(yè)對(duì)中藥材或中藥產(chǎn)品的質(zhì)量和相應(yīng)的檢驗(yàn)方法做出的技術(shù)規(guī)定[8-9],我國(guó)目前關(guān)于杜仲木香散的研究報(bào)道很少,現(xiàn)行藥典及部頒標(biāo)準(zhǔn)中均未收錄其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),限制了杜仲木香散的應(yīng)用。因此,本研究建立以杜仲、木香原藥材為對(duì)照的顯微鑒別方法。此外,用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)測(cè)定杜仲木香散中木香烴內(nèi)酯、京尼平苷酸的含量,將其作為檢測(cè)和控制該方劑的含量指標(biāo)。從而完整地表征該方劑的性質(zhì),完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),使該方劑的使用更加安全、可靠,也為后續(xù)基于該方劑的制劑產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

奧林巴斯BX43型生物顯微鏡(南京鼎誠(chéng)精密儀器有限公司);島津LC-16型高效液相色譜儀、FA1204C型電子天平、WT20000X型電子天平均購(gòu)自常州萬(wàn)泰天平儀器有限公司;YM-100S型超聲波清洗機(jī)(44 kHz,深圳市方奧微電子有限公司);RS-FS1401型多功能粉碎機(jī)(合肥榮事達(dá)小家電有限公司)。

1.2 試藥

木香烴內(nèi)酯對(duì)照品(批號(hào)111524-201911,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%)、京尼平苷酸對(duì)照品(批號(hào)111282-201805,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%),均來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院;甲醇、乙腈,均為色譜純,均購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司;磷酸(色譜純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);水為超純水;甲醇(天津市天力化學(xué)試劑有限公司);氯仿等試劑均為分析純。

木香(批號(hào):2020103～20201107、20201114～20201118)、杜仲(批號(hào):20200325～20190329、20200406～20200410)以及肉桂(批號(hào):20200303～20200307、20200406～20200410)藥材均購(gòu)自陜西中藥材萬(wàn)壽路藥材市場(chǎng),經(jīng)青海省藥檢所中藥室王珺鑒定木香為菊科植物木香(AucklandialappaDecne.)的干燥根,杜仲為杜仲科植物杜仲(Eucommiau1moidesOliv.)的干燥樹(shù)皮,肉桂為樟科植物肉桂(CinnamomumcassiaPresl)的干燥樹(shù)皮,符合2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》(以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》)一部項(xiàng)下對(duì)各味藥材基原的規(guī)定。

2 方法

2.1 顯微鑒別

中藥制劑顯微鑒別研究一般常用于鑒別由飲片粉末制成的制劑,如丸、散、片、膠囊中藥材的鑒別[10],具有簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn),是中藥鑒別的重要手段[11]。

通過(guò)對(duì)木香和杜仲原藥材以及制劑進(jìn)行顯微觀察,對(duì)比制劑中這2味藥材的顯微特征。

2.1.1原藥材顯微樣品的制備 取杜仲和木香中藥材粉末少許,置于載玻片上,滴加適量水合氯醛試液,蓋上蓋玻片,擦除蓋玻片周圍的藥液,即得。

2.1.2杜仲木香散粉末顯微樣品的制備 取杜仲木香散粉末少許,置于載玻片上,滴加適量水合氯醛試液后,蓋上蓋玻片,擦除蓋玻片周圍的藥液,即得。

2.2 含量測(cè)定

木香和杜仲原藥材均為2020年版《中國(guó)藥典》收載品種。《中國(guó)藥典》對(duì)木香含量測(cè)定指標(biāo)成分為木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯,以二者的總含量反映藥材是否符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[12]。但通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在杜仲木香散中,去氫木香內(nèi)酯含量低難以被檢出,故不在該方劑中建立單獨(dú)檢測(cè)去氫木香內(nèi)酯或同時(shí)檢測(cè)去氫木香內(nèi)酯和木香烴內(nèi)酯的方法;通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),該方劑中木香烴內(nèi)酯能被檢出,經(jīng)一系列方法學(xué)考察,最終確立用檢測(cè)木香烴內(nèi)酯(結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1)的HPLC法考察制劑的含量[13-15]。

《中國(guó)藥典》中規(guī)定杜仲的含量測(cè)定指標(biāo)成分為松脂醇二葡糖糖苷[12],但松脂醇二葡萄糖苷含量低且分離度較差,未能在方劑中建立其檢測(cè)方法。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)杜仲的另一種有效成分京尼平苷酸可被檢測(cè)出。經(jīng)一系列方法學(xué)考察,最終確立用檢測(cè)京尼平苷酸(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1)的HPLC法考察制劑中的杜仲含量[16-17]。

注:A.木香烴內(nèi)酯;B.京尼平甘酸。

2.2.1木香烴內(nèi)酯的含量測(cè)定

2.2.1.1色譜條件 色譜柱:Hypersil C18ODS(250 mm×4.6 mm,5 μm),以甲醇-水(65∶35)為流動(dòng)相;流速:0.8 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng):225 nm;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10 μL;理論板數(shù)按木香烴內(nèi)酯峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.2.1.2溶液的配制 供試品溶液的配制:精密稱取樣品3 g,置于具塞錐形瓶中,精密量取氯仿50 mL,密塞后稱定質(zhì)量,超聲(40 kHz,250 W)處理45 min,放冷,再次稱定質(zhì)量,用氯仿補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,過(guò)濾,取續(xù)濾液用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾,即得;陰性制劑樣品溶液的配制:按杜仲木香散處方比例縮小,稱取杜仲4 g,肉桂1 g,2味藥材混合制備含木香陰性樣品溶液,按供試品溶液的制備方法制成不含木香的陰性制劑樣品溶液;木香烴內(nèi)酯對(duì)照品溶液的配制:精密稱取木香烴內(nèi)酯對(duì)照品5.0 mg,置于10 mL量瓶中,加氯仿定容至刻度,制備質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1的木香烴內(nèi)酯對(duì)照品溶液,密封后置于4 ℃冰箱中避光保存。

2.2.2京尼平苷酸的含量測(cè)定

2.2.2.1色譜條件 色譜柱:Hypersil ODS C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)。以甲醇為流動(dòng)相A,以1 mL·L-1磷酸水溶液為流動(dòng)相B,梯度洗脫(0→10 min,5%→8%A;10→15 min,8%→10%A;15→20 min,10%→15%A;20→35 min,15%→20%A;35→40 min,20%→35%A)。流速:0.8 mL·min-1。檢測(cè)波長(zhǎng):230 nm。柱溫:30 ℃。進(jìn)樣量:10 μL。理論板數(shù)按京尼平苷酸峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

2.2.2.2溶液的配制 供試品溶液的配制:精密稱取樣品3 g,置于具塞錐形瓶中,精密加入體積分?jǐn)?shù)為30%的甲醇50 mL,密塞后稱定質(zhì)量,超聲(40 kHz,250 W)處理30 min,放冷,再稱定質(zhì)量,用體積分?jǐn)?shù)為30%的甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,過(guò)濾,續(xù)濾液用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾,即得;陰性制劑樣品溶液的配制:按杜仲木香散處方比例縮小,稱取木香4 g,肉桂1 g,2味藥材混合配制含杜仲陰性樣品溶液,按供試品溶液的配制方法制成不含杜仲的陰性制劑樣品溶液。京尼平苷酸對(duì)照品溶液的配制:精密稱取京尼平苷酸對(duì)照品5.0 mg,置于50 mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,制成質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1的京尼平苷酸對(duì)照品溶液,密封后置于4 ℃冰箱中避光保存。

3 結(jié)果與討論

3.1 顯微鑒別結(jié)果

3.1.1木香藥材 網(wǎng)紋導(dǎo)管多見(jiàn),也可見(jiàn)螺紋導(dǎo)管。菊糖極多。木栓細(xì)胞呈淡黃褐色,類似多角形,排列不甚整齊,大小差異不一。有時(shí)可見(jiàn)油室碎片,內(nèi)含分泌物。木纖維多成束,黃色,末端傾斜或細(xì)尖,呈長(zhǎng)梭形,非木化或微木化。紋孔細(xì)小,橫裂呈縫狀或相交人字形、十字形[18]。見(jiàn)圖2。

注:A-B.網(wǎng)紋導(dǎo)管;C.菊糖;D.木栓細(xì)胞;E.油室;F.木纖維。

3.1.2杜仲藥材 木栓細(xì)胞成群或單個(gè)散離,呈多角形,木化,胞腔內(nèi)含有橙紅色物質(zhì),斷面呈長(zhǎng)方形,且孔溝明顯。橡膠絲呈細(xì)長(zhǎng)條狀,稍彎曲或扭曲成團(tuán),表面略粗[19]。見(jiàn)圖3。

注:A.木栓細(xì)胞;B.橡膠絲。

3.1.3杜仲木香散 粉末為棕褐色,可見(jiàn)網(wǎng)紋導(dǎo)管、螺紋導(dǎo)管,菊糖可見(jiàn)且較易觀察(木香);還可見(jiàn)細(xì)長(zhǎng)的條狀橡膠絲以及成群或單個(gè)存在的木栓細(xì)胞(杜仲)。見(jiàn)圖4。由于制劑中杜仲和木香顯微特征明顯,故可將顯微鑒別作為杜仲木香散的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

注:1.螺紋導(dǎo)管;2.菊糖;3.網(wǎng)紋導(dǎo)管;4.木栓細(xì)胞;5.橡膠絲。

3.2 含量測(cè)定結(jié)果

3.2.1木香

3.2.1.1專屬性實(shí)驗(yàn) 分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性供試品溶液,按2.2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。木香烴內(nèi)酯對(duì)照品和供試品溶液中木香烴內(nèi)酯峰保留時(shí)間一致且峰形對(duì)稱,陰性樣品在相應(yīng)保留時(shí)間附近處無(wú)干擾峰出現(xiàn),表明該方法的專屬性良好。見(jiàn)圖5。

注:A.供試品溶液;B.對(duì)照品溶液;C.陰性樣品溶液;1.木香烴內(nèi)酯。

3.2.1.2線性關(guān)系實(shí)驗(yàn) 取2.2.1.2項(xiàng)下配制的木香烴內(nèi)酯對(duì)照品儲(chǔ)備液,加氯仿制成質(zhì)量濃度為10.00、20.00、50.00、60.00、100.00 μg·mL-1的系列對(duì)照品溶液,按照2.2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣進(jìn)行分析,記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)(y)、對(duì)應(yīng)的進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算回歸方程。木香烴內(nèi)酯的回歸方程為:y=17 000.46x+24 802.33,R2=0.998,線性范圍為10.00～100.00 μg·mL-1。

3.2.1.3精密度實(shí)驗(yàn) 取同一杜仲木香散供試品溶液,按2.2.1.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次,記錄色譜峰的峰面積,木香烴內(nèi)酯色譜峰面積的RSD值 (n=6)為2.06%,表明儀器的精密度良好。

3.2.1.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取杜仲木香散3 g,按照2.2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,并按照2.2.1.1項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析,記錄色譜峰面積。計(jì)算得木香烴內(nèi)酯色譜峰面積的RSD值為1.78%,表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.2.1.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批杜仲木香散3 g,按照2.2.1.2項(xiàng)下方法,平行制備6份樣品,按2.2.1.1項(xiàng)下色譜條件,進(jìn)樣分析,記錄木香烴內(nèi)酯的峰面積,杜仲木香散中木香烴內(nèi)酯的平均含量為0.351 mg·g-1,計(jì)算得峰面積的RSD值為1.60%,表明該方法的重復(fù)性良好。

3.2.1.6回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱定已知含量的同一批杜仲木香散樣品6份,每份1.5 g,其中木香烴內(nèi)酯的含量為0.351 mg·g-1,精密加入質(zhì)量濃度為600.00 μg·mL-1的對(duì)照品溶液1.00 mL,按照2.2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按2.2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,記錄色譜峰面積,見(jiàn)表1。杜仲木香散的平均回收率為99.79%,RSD值 (n=6)為2.49%,表明該方法的回收率良好。

表1 木香烴內(nèi)酯回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1.7檢測(cè)限和定量限 配制質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1的木香烴內(nèi)酯對(duì)照品溶液進(jìn)行逐步稀釋,當(dāng)木香烴內(nèi)酯的質(zhì)量濃度為0.50 μg·mL-1時(shí),進(jìn)樣分析,檢測(cè)信號(hào)約為噪音的10倍,得定量限為0.50 μg·mL-1。當(dāng)木香烴內(nèi)酯的質(zhì)量濃度為0.16 μg·mL-1時(shí),進(jìn)樣分析,檢測(cè)信號(hào)約為噪音的3倍,得檢測(cè)限為0.16 μg·mL-1。

3.2.1.8耐用性實(shí)驗(yàn) 考察該方法在使用不同色譜柱時(shí),在島津LC-16型高效液相色譜儀上的耐用性。比較3種不同品牌的硅膠鍵合C18柱[Hypersil ODS C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);NewmateTMC18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);Kromasil 100-5-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)]。取同一份杜仲木香散供試品溶液,分別于上述3種色譜柱上樣。見(jiàn)圖6。由圖6可見(jiàn),應(yīng)用3種不同品牌的色譜柱分離樣品中的木香烴內(nèi)酯時(shí),分離度均良好,表明該方法在使用不同的C18柱時(shí),耐用性良好。

2.對(duì)生物多樣性和特異性的認(rèn)識(shí)，以及對(duì)基因重組作為生物變異主要來(lái)源的認(rèn)識(shí)，為知識(shí)的靈活應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

注:A.Hypersil ODS C18柱;B.NewmateTM C18柱;C.Kromasil 100-5-C18柱;1.木香烴內(nèi)酯。

3.2.1.9杜仲木香散中木香烴內(nèi)酯的含量測(cè)定 取實(shí)驗(yàn)室自制的15批杜仲木香散樣品,按照2.2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,并按照2.2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣進(jìn)行木香烴內(nèi)酯含量的測(cè)定。見(jiàn)表3、圖9。木香烴內(nèi)酯含量在0.612～1.023 mg·g-1之間,平均含量為0.776 mg·g-1。按平均值下浮20%計(jì),規(guī)定本品中木香烴內(nèi)酯的含量不得少于0.621 mg·g-1。

3.2.2杜仲

3.2.2.1專屬性實(shí)驗(yàn) 分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性供試品溶液,按照2.2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。京尼平苷酸對(duì)照品和樣品中京尼平苷酸峰保留時(shí)間一致且峰形對(duì)稱,陰性樣品在相應(yīng)保留時(shí)間附近處無(wú)干擾峰出現(xiàn),表明該方法的專屬性良好。見(jiàn)圖7。

注:A.供試品溶液;B.對(duì)照品溶液;C.陰性樣品溶液;2.京尼平苷酸。

3.2.2.2線性關(guān)系實(shí)驗(yàn) 取2.2.2.2項(xiàng)下制備的京尼平苷酸對(duì)照品溶液,加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為10.00、20.00、30.00、40.00、60.00 μg·mL-1的系列京尼平苷酸對(duì)照品溶液,按照2.2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)(y)、對(duì)應(yīng)的進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算回歸方程。京尼平苷酸的回歸方程為:y=12 044.09x-7 745.54,R2=0.999,線性范圍為10.00～60.00 μg·mL-1。

3.2.2.3精密度實(shí)驗(yàn) 取同一杜仲木香散供試品溶液按2.2.2.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次,記錄色譜峰面積。計(jì)算得京尼平苷酸色譜峰面積的RSD值 (n=6)為1.08%,表明儀器的精密度良好。

3.2.2.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取杜仲木香散3 g,按照2.2.2.2項(xiàng)下方法配制供試品溶液,并按照2.2.2.1項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析,記錄色譜峰面積。計(jì)算得京尼平苷酸色譜峰面積的RSD值為1.53%,表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.2.2.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取杜仲木香散3 g,按照2.2.2.2項(xiàng)下方法,平行制備6份樣品,按照2.2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,記錄京尼平苷酸的峰面積,杜仲木香散中京尼平甘酸的平均含量為0.380 mg·g-1。計(jì)算得峰面積的RSD值為1.44%,表明該方法的重復(fù)性良好。

3.2.2.6回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱定已知含量的同一批杜仲木香散樣品6份,每份約1.5 g,其中京尼平苷酸的含量為0.380 mg·g-1,精密加入質(zhì)量濃度為600.00 μg·mL-1的對(duì)照品溶液1.0 mL,按照2.2.2.2項(xiàng)下方法配制供試品溶液,按照2.2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,記錄色譜峰面積。京尼平甘酸的平均回收率為100.68%,RSD值 (n=6)為1.69%,見(jiàn)表2。結(jié)果表明,該方法的回收率良好。

表2 京尼平苷酸回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.2.8耐用性實(shí)驗(yàn) 考察了應(yīng)用不同色譜柱[Kromasil 100-5-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);HiQ sil C18W柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);Hypersil ODS C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)]時(shí)該方法的耐用性。取同一份杜仲木香散供試品溶液,分別于上述3種色譜柱上進(jìn)樣。結(jié)果見(jiàn)圖8。由圖8可見(jiàn),3種不同品牌色譜柱分離樣品中的京尼平苷酸的分離度均良好,表明該方法在采用不同的C18柱時(shí),耐用性良好。

注:A.Kromasil 100-5-C18柱;B.Hypersil ODS C18柱;C.HiQ sil C18W柱;2.京尼平苷酸。

3.2.2.9杜仲木香散中京尼平苷酸的含量測(cè)定 取實(shí)驗(yàn)室自制的15批杜仲木香散樣品,按照2.2.2.2項(xiàng)下方法配制供試品溶液,并按照2.2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣進(jìn)行京尼平苷酸的含量測(cè)定。見(jiàn)表3、圖9。京尼平苷酸含量在0.278～0.493 mg·g-1之間,平均含量為0.361 mg·g-1。按平均值下浮20%計(jì),暫定本品京尼平苷酸含量不得少于0.289 mg·g-1。

注:A.木香供試品溶液;B.杜仲供試品溶液;1.木香烴內(nèi)酯;2.京尼平苷酸。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果

4 結(jié)論

藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是藥品檢驗(yàn)的準(zhǔn)繩,制定科學(xué)、合理的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是保障用藥安全的重要手段之一[20-22]。本研究通過(guò)對(duì)15批實(shí)驗(yàn)室自制杜仲木香散進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究,建立了杜仲和木香的定性鑒別(顯微鑒別)和定量控制方法,建立了木香烴內(nèi)酯和京尼平苷酸的含量測(cè)定方法,方法學(xué)考察良好,木香烴內(nèi)酯的含量范圍為0.612～1.023 mg·g-1,京尼平苷酸的含量范圍為0.278～0.493 mg·g-1。

按照本研究建立的藥品標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn),15批杜仲木香散均符合標(biāo)準(zhǔn),且質(zhì)量較穩(wěn)定。本文為杜仲木香散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立和劑型開(kāi)發(fā)奠定了一定的研究基礎(chǔ)。