王鵬輝 ，張琳杰 ，崔超毅 ，趙 振，陸信武，殷敏毅

1 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院血管外科，上海 200011

2 上海交通大學(xué)血管病診治中心，上海 200011

深靜脈血栓形成（deep vein thrombosis，DVT）是深靜脈系統(tǒng)內(nèi)的血液異常凝結(jié)，通常發(fā)生在上肢或者下肢[1]。DVT 的主要并發(fā)癥包括肺栓塞（pulmonary embolism，PE）和血栓形成后綜合征（post-thrombotic syndrome，PTS）[2]，其中PTS 是DVT 最常見的中長(zhǎng)期并發(fā)癥。目前，PTS 的治療方法主要包括彈力襪壓迫療法、抗凝、溶栓和支架成形術(shù)等，上述方法雖有一定療效，但均存在不足之處，如彈力襪的療效尚存在爭(zhēng)議[3]、支架成形術(shù)存在一定再閉塞發(fā)生率等。因此，深入研究PTS 發(fā)病機(jī)制，探尋預(yù)防和治療PTS 的靶標(biāo)，對(duì)于阻止和緩解PTS 的發(fā)生發(fā)展有著重要的臨床價(jià)值。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，血栓阻塞靜脈管腔和血栓破壞靜脈瓣膜引起的靜脈高壓是血栓形成后引起PTS 的主要發(fā)生機(jī)制[4]。但DVT 后即使經(jīng)過早期規(guī)范化抗凝治療仍有近一半的患者發(fā)展為PTS[5-7]。近期研究也表明，血栓形成8 d 后即便完全移除血栓，也不能減少PTS 的發(fā)生[8]。近年來(lái)，血栓后靜脈管壁炎癥[9]和纖維化重塑[10]逐漸成為PTS 發(fā)生的機(jī)制研究焦點(diǎn)之一，纖維化的靜脈血管缺乏正常靜脈管壁的彈性和舒縮功能，靜脈回流功能受損進(jìn)而導(dǎo)致靜脈高壓使PTS 發(fā)生[11]。但靜脈管壁炎癥的主要病理機(jī)制和炎癥細(xì)胞來(lái)源，目前尚無(wú)定論。血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）作為血管中膜的主要細(xì)胞組成部分，是一類高度分化的、主要負(fù)責(zé)血管收縮與舒張的細(xì)胞類型。在生理狀態(tài)下，VSMC 保持收縮表型，發(fā)揮其收縮功能以調(diào)節(jié)血壓和維持血管張力[12]。而在血管損傷、炎癥等病理狀態(tài)下，VSMC 可轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、巨噬泡沫細(xì)胞等多種細(xì)胞表型，驅(qū)動(dòng)血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程[13]。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）作為主要由巨噬細(xì)胞分泌的炎癥調(diào)節(jié)因子，可以通過TNF-α/TNF-R p55軸加速小鼠靜脈血栓的消退[14]，但其在PTS 靜脈管壁VSMC 表型轉(zhuǎn)化中的作用還知之甚少。本研究旨在探討血栓后靜脈管壁中TNF-α 調(diào)節(jié)VSMC 向炎癥細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變的作用及相關(guān)機(jī)制，以期為臨床上防治PTS 提供新思路，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2020年6—12月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院收治的16例血栓性淺靜脈炎患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）下肢淺靜脈曲張合并淺靜脈炎，可表現(xiàn)為患肢淺靜脈區(qū)局部紅腫、疼痛，行走時(shí)加重，可觸及痛性索狀硬條或串珠樣結(jié)節(jié)；（2）首次淺靜脈炎發(fā)作，且淺靜脈炎發(fā)生時(shí)間大于2周；（3）超聲示靜脈管腔內(nèi)可見回聲略增強(qiáng)的血栓影，靜脈管壁呈現(xiàn)1處或者多處增厚現(xiàn)象，部分血栓再通的部位出現(xiàn)不規(guī)則的、細(xì)小的分支狀血流。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并全身結(jié)締組織病，如馬方綜合征等；（2）外傷性淺靜脈炎；（3）局部曲張淺靜脈全程血栓，缺乏未受血栓累及的曲張淺靜脈作為對(duì)照；（4）既往反復(fù)血栓性淺靜脈炎發(fā)作。靜脈樣本小心去除管腔內(nèi)血栓（血凝）塊及管壁外膜組織，隨后用手術(shù)刀片輕刮管腔內(nèi)側(cè)2～3次去除管腔內(nèi)皮細(xì)胞，以獲取較為均一的靜脈管壁中膜樣本。靜脈管壁樣本液氮保存，以備后續(xù)試驗(yàn)使用。16例患者中，以血栓累及下肢淺靜脈中膜部分作為試驗(yàn)組，鄰近未受血栓累及的正常淺靜脈中膜部分作為對(duì)照組，將16例血栓性淺靜脈炎患者中的6例進(jìn)行基因芯片分析，剩余10例患者進(jìn)行巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志物的檢測(cè)。從上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心獲得清潔級(jí)雄性SD大鼠22只，4～6周齡，體重（200±50）g，將下腔靜脈血栓造模成功的SD大鼠隨機(jī)分為血栓組（n＝12）和實(shí)驗(yàn)組（n＝10）。所有患者均簽署知情同意書并獲得上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。本研究已獲得上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批。

1.2 主要試劑

TNF-α購(gòu)于美國(guó)Peprotech公司，氯化鈣（CaCl2）購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司，磷酸酶抑制劑（β-glycerophosphate）購(gòu)于Merck，L-Ascorbic Acid購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司，胰島素（insulin）購(gòu)于上海源培生物科技有限公司，地塞米松（dexamethasone，DXMS）購(gòu)于麥克林公司，胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)于Sigma公司，達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM）培養(yǎng)基購(gòu)于上海源培生物科技有限公司，0.5%胰酶購(gòu)于Gibco 公司，青/鏈霉素購(gòu)于Gibco 公司，Trizol購(gòu)于美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于全式金公司，SYBR Green試劑盒購(gòu)于Thermo 公司。

1.3 方法

1.3.1 人靜脈管壁樣本試驗(yàn)

（1）應(yīng)用Agilent基因芯片技術(shù)，從基因水平分析試驗(yàn)組和對(duì)照組淺靜脈標(biāo)本中差異基因的表達(dá)。篩選t檢驗(yàn)中上調(diào)或下調(diào)倍數(shù)變化值≥1.5且P≤0.05的差異基因，熱圖顯示與巨噬細(xì)胞表型和功能相關(guān)的差異基因表達(dá)。（2）逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測(cè)人靜脈管壁巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志物mRNA的表達(dá)：使用Trizol法抽提人靜脈管壁樣本RNA，靜脈管壁樣本剪碎后，加入Trizol冰上研磨并裂解，添加氯仿后振蕩搖勻并離心。移取上清后用等量異丙醇沉淀RNA，再分別使用75%和100%乙醇洗滌，晾干后加入去RNA酶的水，待RNA完全溶解后測(cè)量RNA濃度。每個(gè)樣本按1 μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，通過RT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增。人目的基因的特異性引物序列見表1。

表1 人RT-PCR引物序列

1.3.2 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

（1）細(xì)胞培養(yǎng)：人臍靜脈平滑肌細(xì)胞（human umbilical vein smooth muscle cell，HUVSMC）使用完全培養(yǎng)基（含5% FBS、1%青/鏈霉素）于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)HUVSMC，待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%后，按1 ∶3的比例進(jìn)行傳代擴(kuò)增。HUVSMC 以7.5×104個(gè)/孔的密度接種在12孔板上，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。（2）分組及處理：HUVSMC貼壁后，將完全培養(yǎng)基換成分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基[含CaCl2（4 mm）、β-glycerophosphate（5 mm）、L-Ascorbic Acid（50 μg/ml）、insulin（1 μm），dexamethasone（0.1 μm）、5% FBS]。TNF-α（20 ng/ml）作用24 h以模擬炎癥應(yīng)激模型，隨后分為兩組。對(duì)照組只在分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基下培養(yǎng)，試驗(yàn)組添加TNF-α（20 ng/ml）繼續(xù)刺激，每24 小時(shí)換液，處理3～4 d 后提取細(xì)胞RNA。（3）RT-PCR 檢測(cè)HUVSMC 巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志物的表達(dá)：使用Trizol 裂解HUVSMC 并提取RNA，具體步驟詳見1.3.1。

1.3.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

（1）大鼠下腔靜脈血栓模型建立及分組：大鼠下腔靜脈造模方法參考文獻(xiàn)[15]，適應(yīng)性喂養(yǎng)大鼠2周后，腹腔注射0.6%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，常規(guī)剪毛、消毒、鋪巾。剪開皮膚、淺筋膜，顯露下腔動(dòng)、靜脈后，分別游離下腔靜脈主干長(zhǎng)約1 cm，以6-0絲線于靜脈起始處結(jié)扎，并蚊式血管鉗鉗夾結(jié)扎處?kù)o脈3次，造成機(jī)械性損傷，沖洗并縫合傷口。待大鼠完全蘇醒后，轉(zhuǎn)移至鼠籠內(nèi)正常喂養(yǎng)。下腔靜脈血栓造模成功的SD 大鼠隨機(jī)分為血栓組（n＝12）和實(shí)驗(yàn)組（n＝10）。造模成功14 d后，使用0.6%戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，再次打開大鼠腹腔。游離下腔靜脈結(jié)扎線遠(yuǎn)心端及后腹膜間的腔隙后，于該腔隙內(nèi)給藥（血栓組僅注射水凝膠，實(shí)驗(yàn)組注射含TNF-α 的水凝膠），待2～4 min 凝膠凝固后即可關(guān)腹。待水凝膠局部作用血管24～48 h后，在緊鄰下腔靜脈結(jié)扎線近心端和右側(cè)分支分出部位近心端之間取材。（2）RT-PCR 檢測(cè)大鼠下腔靜脈管壁巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志物mRNA 的表達(dá)：大鼠下腔靜脈管壁剪碎后，加入Trizol 在冰上研磨并充分裂解，提取RNA，具體步驟詳見1.3.1，目的基因引物序列見表2。

表2 大鼠RT-PCR引物序列

1.4 觀察指標(biāo)

比較人血栓段靜脈管壁與正常段靜脈管壁巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志物（CD68、LGALS3）的mRNA 表達(dá)水平。測(cè)定并比較TNF-α培養(yǎng)后HUVSMC 的表型標(biāo)志物（ACTA2、TAGLN、COL1A1）和巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志物（CD68、LGALS3、TNF）的mRNA表達(dá)水平。最后比較大鼠下腔靜脈血栓組與實(shí)驗(yàn)組靜脈管壁內(nèi)VSMC表型標(biāo)志物（Acta2、Tagln和Col1a1）和巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志物（Cd68、Lgals3和Tnf）的mRNA 表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用Graphpad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人靜脈管壁中膜巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志物mRNA 表達(dá)的比較

基因芯片差異基因熱圖結(jié)果顯示，試驗(yàn)組靜脈管壁中膜內(nèi)巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志物CD68、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體接觸復(fù)合物調(diào)控因子1（endoplasmic reticulum-mitochondria encounter structure regulator 1，EMR1）、LGALS3中mRNA表達(dá)均高于對(duì)照組（圖1）。收集10例患者血栓性和非血栓性淺靜脈炎的靜脈管壁樣本，選擇芯片數(shù)據(jù)中表達(dá)量相對(duì)較高的CD68、LGALS3基因進(jìn)一步驗(yàn)證，RT-PCR 結(jié)果顯示，試驗(yàn)組人靜脈管壁中膜巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志物CD68mRNA 表達(dá)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組LGALS3mRNA表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表3）。

圖1 人靜脈管壁中膜巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志物mRNA的表達(dá)情況

表3 人靜脈管壁CD68、LAGALS3的mRNA表達(dá)比較（）

表3 人靜脈管壁CD68、LAGALS3的mRNA表達(dá)比較（）

2.2 經(jīng)TNF-α 刺激HUVSMC 后細(xì)胞表型標(biāo)志物mRNA表達(dá)的比較

TNF-α刺激HUVSMC 3～4 d后，試驗(yàn)組收縮表型ACTA2、TAGLN和合成表型標(biāo)志物COL1A1mRNA均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中收縮表型標(biāo)志物的變化更為明顯。RT-PCR結(jié)果顯示，TNF-α作用HUVSMC后，試驗(yàn)組巨噬細(xì)胞表型相關(guān)標(biāo)志物CD68、LGALS3和炎癥因子標(biāo)志物TNFmRNA 均明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表4）

表4 經(jīng)TNF-α刺激HUVSMC后細(xì)胞表型標(biāo)志物mRNA表達(dá)的比較（）

表4 經(jīng)TNF-α刺激HUVSMC后細(xì)胞表型標(biāo)志物mRNA表達(dá)的比較（）

2.3 大鼠經(jīng)TNF-α 處理下腔靜脈血栓形成后靜脈管壁VSMC 表型標(biāo)志物mRNA 表達(dá)的比較

TNF-α 處理下腔靜脈血栓形成靜脈管壁24 h后，實(shí)驗(yàn)組大鼠靜脈管壁VSMC 表型標(biāo)志物中TAGLNmRNA明顯低于血栓組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而兩組大鼠Acta2、Col1a1mRNA 比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表5）。TNF-α 處理下腔靜脈血栓形成靜脈管壁24 h后，實(shí)驗(yàn)組大鼠巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志物分子Cd68、Lgals3、TnfmRNA均明顯高于血栓組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；TNF-α處理下腔靜脈血栓形成靜脈管壁48 h后，實(shí)驗(yàn)組大鼠巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志物分子Cd68、Lgals3mRNA均明顯低于血栓組，而TnfmRNA明顯高于血栓組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表6）。

表5 大鼠經(jīng)TNF-α處理下腔靜脈血栓形成靜脈管壁VSMC表型標(biāo)志物mRNA表達(dá)的比較（）

表5 大鼠經(jīng)TNF-α處理下腔靜脈血栓形成靜脈管壁VSMC表型標(biāo)志物mRNA表達(dá)的比較（）

表6 大鼠經(jīng)TNF-α處理下腔靜脈血栓形成靜脈管壁巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志物mRNA表達(dá)的比較（）

表6 大鼠經(jīng)TNF-α處理下腔靜脈血栓形成靜脈管壁巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志物mRNA表達(dá)的比較（）

3 討論

VSMC作為血管中膜主要的細(xì)胞組分，可以去分化成具有成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞及巨噬細(xì)胞樣特征的細(xì)胞[16]。在VSMC去分化為巨噬細(xì)胞樣表型的過程中，VSMC不僅可以獲得吞噬的特性，而且能參與同血管組織原位或招募來(lái)的免疫細(xì)胞的相互作用，在血管組織穩(wěn)態(tài)中起重要作用[17]。此外，也有研究表明，巨噬細(xì)胞樣VSMC也可表現(xiàn)出非典型吞噬細(xì)胞的特征，導(dǎo)致血管局部出現(xiàn)慢性、非消退性的炎癥狀態(tài)。該過程主要與吞噬細(xì)胞的招募和大量細(xì)胞因子釋放引起的免疫活性細(xì)胞遷移密切相關(guān)[18]?，F(xiàn)有的研究主要集中在動(dòng)脈粥樣硬化等動(dòng)脈相關(guān)的慢性炎性疾病，但炎癥調(diào)節(jié)VSMC 表型在靜脈管壁重塑中的研究還很少。

炎癥是導(dǎo)致血栓后靜脈高壓并誘發(fā)PTS后管壁重塑的重要原因[9]，在血管損傷修復(fù)的過程中，炎癥因子TNF-α可以參與調(diào)節(jié)VSMC 表型轉(zhuǎn)化[19]，如促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和分泌[20]，增加VSMC 增殖、遷移能力；誘導(dǎo)VSMC 從收縮表型向成骨/成軟骨細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化[21]，增加血管鈣鹽沉積，造成管壁順應(yīng)性下降和功能改變。本研究發(fā)現(xiàn)，伴隨血栓段靜脈管壁內(nèi)VSMC 收縮表型標(biāo)志物表達(dá)的下調(diào)，TNF-α在靜脈中膜VSMC 內(nèi)表達(dá)明顯增加。據(jù)此推測(cè)，TNF-α可能通過調(diào)節(jié)血栓后靜脈管壁內(nèi)VSMC收縮表型向巨噬細(xì)胞樣表型分化，加劇了靜脈管壁的損傷，影響靜脈功能的恢復(fù)。

本研究首先從臨床血栓性淺靜脈炎靜脈管壁樣本入手，發(fā)現(xiàn)與巨噬細(xì)胞表型相關(guān)標(biāo)志物CD68的表達(dá)水平出現(xiàn)明顯上調(diào)，提示血栓后靜脈管壁炎癥反應(yīng)增強(qiáng)。體外結(jié)果表明，TNF-α 作用HUVSMC后，平滑肌細(xì)胞內(nèi)收縮及合成表型標(biāo)志物表達(dá)均下降，但以收縮表型下降更為明顯。與此同時(shí)，TNF-α 作用下平滑肌細(xì)胞內(nèi)巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志物CD68、LGALS3mRNA的表達(dá)增加，提示炎癥因子TNF-α 可能是導(dǎo)致VSMC 出現(xiàn)去分化表現(xiàn)并向巨噬細(xì)胞樣表型轉(zhuǎn)變的重要因素。本研究結(jié)果顯示，試驗(yàn)組炎癥因子TNF-α 的表達(dá)顯著增強(qiáng)，初步提示，此狀態(tài)下的VSMC 擁有巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子的能力。炎癥反應(yīng)作為靜脈血栓形成和消退的核心環(huán)節(jié)，在DVT 早期加劇血栓形成，而在中晚期有促進(jìn)血栓機(jī)化再通的作用，并在血栓形成后相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)持續(xù)存在[22]。為了更好地模擬PTS 發(fā)生時(shí)持續(xù)存在的慢性炎癥病理狀態(tài)，本研究體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中先用TNF-α 統(tǒng)一處理HUVSMC 24 h，再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。有關(guān)研究結(jié)果顯示，大鼠下腔靜脈結(jié)扎第7天血栓開始出現(xiàn)部分溶解和機(jī)化再通，靜脈血栓進(jìn)入慢性期[15]。因此，本研究選擇進(jìn)入慢性消融期，即下腔靜脈結(jié)扎第14天的大鼠下腔靜脈血栓模型進(jìn)行水凝膠載藥局部處理血管展開研究。本研究結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組，TNF-α 處理下腔靜脈血栓形成后，實(shí)驗(yàn)組靜脈管壁收縮型標(biāo)志物TaglnmRNA 顯著下降，巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志物mRNA 表達(dá)明顯增強(qiáng)，VSMC 向巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變。提示，TNF-α 可能是調(diào)節(jié)血栓后靜脈管壁VSMC 向巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的重要因子之一。然而本研究也存在一定的不足之處，納入患者數(shù)量相對(duì)較少，體內(nèi)試驗(yàn)、體外實(shí)驗(yàn)僅檢測(cè)了mRNA 水平的改變。后續(xù)將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，并在體外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分繼續(xù)探索蛋白水平上的變化，使研究結(jié)論更具信服力。

綜上所述，血栓后靜脈管壁VSMC 可在TNF-α 刺激下向巨噬細(xì)胞樣表型轉(zhuǎn)化，且該巨噬細(xì)胞樣VSMC 擁有分泌TNF-α 的能力，并可能成為管壁炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞來(lái)源，加重炎癥反應(yīng)，為PTS 的防治干預(yù)靶點(diǎn)提供新策略。