周 暉，韓滿強,2，湯保貴，伍栩民，杜書敏，譚瑞華，龔漢夫，林志豪，何益荀，鐘育麒，林桂騰

( 1.廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廣東省普通高校南海水產(chǎn)經(jīng)濟動物增養(yǎng)殖重點實驗室，廣東 湛江 524088； 2.湛江海思特水產(chǎn)科技有限公司，廣東 湛江 524088 )

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)原產(chǎn)于中、南美洲太平洋沿岸，是世界養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的三大優(yōu)良蝦種之一。根據(jù)《2019中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》[1]數(shù)據(jù)顯示，2018年我國凡納濱對蝦海水養(yǎng)殖產(chǎn)量為1.118×106t，同比增長3.4%。隨著凡納濱對蝦養(yǎng)殖區(qū)域和產(chǎn)量的不斷增加，暴露的問題也越來越多，如種質(zhì)退化、病害頻發(fā)、藥物濫用、環(huán)境惡化等[2]。疾病暴發(fā)一直是困擾我國對蝦產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的嚴重問題，各種病害頻發(fā)，使我國對蝦養(yǎng)殖業(yè)遭受了重創(chuàng)[2-3]。有研究表明[4]，在高密度養(yǎng)殖系統(tǒng)中，魚蝦只能利用人工飼料中20%～30%的營養(yǎng)物質(zhì)，其余70%～80%的物質(zhì)會以殘餌以及生物代謝物形式在系統(tǒng)中快速積累，產(chǎn)生大量有毒的氨氮、亞硝態(tài)氮，導(dǎo)致養(yǎng)殖水質(zhì)惡化，是病害暴發(fā)的重要原因。傳統(tǒng)清水養(yǎng)殖模式占用寶貴的水資源，還帶來了環(huán)境污染以及水產(chǎn)動物病害擴散等問題，已逐漸成為一種不可持續(xù)的養(yǎng)殖模式，因此研究者紛紛開始探索健康高效的對蝦養(yǎng)殖新模式，而生物絮團養(yǎng)殖模式就是主要研究方向之一[3]。

Avnimelech[5]系統(tǒng)地論述了生物絮團技術(shù)的原理，促進了生物絮團技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中的推廣運用；Crab等[6]指出，生物絮團不僅可去除養(yǎng)殖水體中的氮，還可將這些氮轉(zhuǎn)化為養(yǎng)殖對象的天然食物，通過營養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)利用提高飼料營養(yǎng)的轉(zhuǎn)化效率；Burford等[7-9]的研究也證實，生物絮團作為食物為養(yǎng)殖對象的生長做出了貢獻；Kuhn等[10-12]報道了在凡納濱對蝦的飼料中可以用生物絮粉部分代替魚粉，并評估了飼料中來源于魚粉和生物絮粉的氮對凡納濱對蝦生長的相對貢獻[12]。生物絮團可以被養(yǎng)殖對象利用的這一特點，相較于其他水質(zhì)處理技術(shù)具有重要的優(yōu)勢。

近年來生物絮團技術(shù)運用于凡納濱對蝦養(yǎng)殖的研究報道很多。孫振等[11,13-14]報道了生物絮團對凡納濱對蝦生長和健康具有積極的影響；張亞卓等[15]研究了低鹽度魚蝦混養(yǎng)條件下，生物絮團的營養(yǎng)組分及凡納濱對蝦對生物絮團的攝食效率；張哲等[16]則研究了不同碳源對凡納濱對蝦育苗水體中生物絮團結(jié)構(gòu)、營養(yǎng)成分、細菌群落及水質(zhì)的影響；王超等[17]發(fā)現(xiàn)，生物絮團技術(shù)在凡納濱對蝦零水交換養(yǎng)殖系統(tǒng)中應(yīng)用后，在75%投餌水平下，生物絮團養(yǎng)殖的凡納濱對蝦基本保持正常的生理健康水平，且養(yǎng)殖產(chǎn)量不受影響；Lara等[18]研究表明，凡納濱對蝦在生物絮團系統(tǒng)中養(yǎng)殖可以節(jié)約25%的配合飼料。但在低溫季節(jié)采用生物絮團模式養(yǎng)殖凡納濱對蝦的效果尚未見報道。筆者在秋冬季低溫養(yǎng)殖條件下，評估在投餌水平為70%時，生物絮團養(yǎng)殖的凡納濱對蝦的生長和飼料利用情況，并測試生物絮團技術(shù)是否有助于維持養(yǎng)殖系統(tǒng)較高的水溫，為生物絮團技術(shù)的推廣運用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗對蝦

試驗用凡納濱對蝦由湛江海思特水產(chǎn)科技有限公司提供，在實驗室暫養(yǎng)4周，以使其適應(yīng)實驗室養(yǎng)殖條件，并收集養(yǎng)殖尾水用于生物絮團培養(yǎng)。養(yǎng)殖試驗設(shè)置絮團組和清水組，每組3個70 cm×50 cm×60 cm試驗桶，每桶隨機投放凡納濱對蝦[(3.17±0.37) g]18尾。

1.2 生物絮團培養(yǎng)

收集暫養(yǎng)期間的凡納濱對蝦養(yǎng)殖尾水作為氮源，紅糖作為碳源，加入復(fù)合芽孢桿菌(Bacillusspp.)制劑(珠江水產(chǎn)研究所水產(chǎn)藥物試驗廠)培養(yǎng)生物絮團。設(shè)定養(yǎng)殖水體碳氮比為20∶1，參照文獻[5]的公式計算碳源添加量。

1.3 對蝦養(yǎng)殖試驗管理

試驗飼料選用對蝦飼料[正大飼料(湛江)有限公司)]。每日8:30、12:30和17:30投喂飼料，清水組凡納濱對蝦飽食投喂。為準確計算攝食量和飼料轉(zhuǎn)化效率等參數(shù)，需要在投喂時注意觀察凡納濱對蝦攝食狀態(tài)，盡可能減少殘餌。絮團組添加預(yù)先培養(yǎng)好的生物絮團濃縮液，使絮團桶的初始絮團含量達到1 mL/L。綜合Burford等[7,9,17]研究結(jié)果，將絮團組的投喂量設(shè)定為清水組的70%，每次投喂時均根據(jù)清水組凡納濱對蝦攝食量調(diào)整絮團組投喂量。

暫養(yǎng)及養(yǎng)殖用海水均來源于對蝦養(yǎng)殖場周邊海區(qū)，通過添加曝氣自來水將鹽度調(diào)節(jié)到10(對蝦來源養(yǎng)殖池的海水鹽度)，儲存在實驗室循環(huán)水系統(tǒng)中。清水組的3個桶每日清污換水約10%，絮團組不換水，養(yǎng)殖期間水體保持充氣狀態(tài)，維持水體溶解氧水平>5 mg/L。絮團組在養(yǎng)殖過程中添加紅糖作為額外碳源，添加量按照文獻[5]的公式計算，在每日下午投喂結(jié)束時用海水溶解后添加。復(fù)合芽孢桿菌制劑按使用說明每2 d添加1次，每次每桶添加粉劑10.5 g。養(yǎng)殖試驗自2019年11月22日至2020年1月4日，養(yǎng)殖期42 d。試驗期間保持自然光照周期，每次投喂前記錄水溫。

1.4 試驗樣品采集

試驗開始時測定每尾凡納濱對蝦的初始體質(zhì)量，隨機分組后對各組凡納濱對蝦的初始體質(zhì)量進行統(tǒng)計分析和多重比較，各組凡納濱對蝦初始體質(zhì)量無顯著差異。試驗結(jié)束后，采集各桶所有凡納濱對蝦個體，測量體質(zhì)量。試驗期間，每日中午用英霍夫錐形管測定絮團組各桶的絮團含量，并于試驗結(jié)束后采集各桶絮團。凡納濱對蝦肌肉在烘箱中105 ℃烘干至恒等質(zhì)量以測定水分含量，凡納濱對蝦肌肉、飼料和絮團的粗蛋白采用凱氏定氮法測量，粗脂肪采用氯仿—甲醇抽提法測量，灰分采用550 ℃馬福爐灰化法測量[19]。

1.5 生長參數(shù)計算

質(zhì)量增加率(wWGR，%)、特定生長率(RSG，%/d)、飼料轉(zhuǎn)化率(RFC，%)、蛋白質(zhì)效率(RPE，%)、平均日攝食率(RADF，%)等生長參數(shù)計算公式參考文獻[20-21]，并根據(jù)本試驗設(shè)計調(diào)整參數(shù)。

wWGR=(mt-m0)/m0×100%

(1)

RSG=(lnmt-lnm0)/t×100%

(2)

RFC=(mn-m0×18)/mi×100%

(3)

RPE=(mn-m0×18)/mp×100%

(4)

RADF=mf/[St×m0×(1+RSG×t)]

(5)

式中，mt為平均每尾蝦終末體質(zhì)量(濕質(zhì)量，g)，m0為試驗凡納濱對蝦初始平均體質(zhì)量(濕質(zhì)量，g)，mn為每個桶收獲的試驗蝦總質(zhì)量(濕質(zhì)量)；t為飼喂天數(shù)(d)；mi為每桶試驗蝦攝食飼料總量(風(fēng)干質(zhì)量，g)；mp為平均每尾蝦攝食飼料蛋白質(zhì)的質(zhì)量(風(fēng)干質(zhì)量，g)，18為每個桶初始試驗凡納濱對蝦數(shù)量(尾)；mf為每個桶的凡納濱對蝦在t日投喂總量(風(fēng)干質(zhì)量，g)，St為t日桶內(nèi)凡納濱對蝦數(shù)量(尾)。

1.6 試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，在多個樣本的觀察值服從正態(tài)分布及各組間方差平齊的情況下用單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著。若樣品數(shù)據(jù)方差不平齊，則用非參數(shù)統(tǒng)計中的Kruskal-Wallis檢驗。溫度與對蝦平均日攝食率的關(guān)系采用Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 養(yǎng)殖水溫變化

清水組凡納濱對蝦42 d養(yǎng)殖期間的水溫變化見圖1。由圖1可見，養(yǎng)殖期間水溫波動范圍17.2～23.5 ℃。養(yǎng)殖水體溫度自試驗開始第1天的22.3 ℃逐漸波動降至第13天的17.2 ℃，此后又逐漸波動上升，在第25天恢復(fù)到22 ℃，并維持在22～23 ℃直到試驗結(jié)束。自試驗的第13天開始增加測定絮團組水溫，波動范圍 16.7～23.9 ℃。統(tǒng)計分析結(jié)果表明，31～42 d時絮團組的平均水溫為(23.2±0.4) ℃，顯著高于清水組的平均水溫(22.6±0.5) ℃(P<0.05)。

圖1 凡納濱對蝦42 d養(yǎng)殖期間的水溫

2.2 絮團組絮團含量變化

絮團組絮團含量在試驗開始后1～3 d 下降，此后逐漸上升；受降溫影響，19～21 d絮團含量也出現(xiàn)下降，此后波動上升并在第28天達到最高值(3.6 mL/L)，隨后又逐漸下降，并在最后7 d穩(wěn)定在約1.6 mL/L(圖2)。

圖2 42 d養(yǎng)殖期間絮團組絮團含量變化

在本試驗養(yǎng)殖過程中，觀察到絮團組的生物絮團呈黃褐色，沉降性能良好，沉淀15 min后上清液清澈透明，絮團與水體分界清晰；鏡檢絮團(圖3)可見大量菌膠團，以絲狀菌為骨架，非絲狀菌填充其中，結(jié)構(gòu)密實；同時可以觀察到原生動物、輪蟲、枝角類和橈足類等生物。

圖3 生物絮團

2.3 平均日攝食率變化

在42 d養(yǎng)殖期間，清水組飽食投喂，觀察凡納濱對蝦在秋冬季水溫波動狀態(tài)下攝食率的變化情況。

凡納濱對蝦在整個試驗期間的日攝食率為1.31%～2.66%，平均日攝食率為(1.87±0.30)%。試驗開始后10～20 d的降溫過程(溫度17.2～20 ℃)導(dǎo)致凡納濱對蝦平均日攝食率有所下降[(1.75±0.25)%]，但與試驗其余日期(溫度20.4～23.5 ℃)的平均日攝食率[(1.91±0.30)%]差異不顯著(P>0.05)(圖4、圖5)。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果也表明，在本試驗中溫度與凡納濱對蝦平均日攝食率并無顯著性差異(P>0.05)。

圖4 42 d養(yǎng)殖期間凡納濱對蝦的平均日攝食率散點圖

圖5 42 d養(yǎng)殖期間凡納濱對蝦平均日攝食率與溫度的散點圖

2.4 絮團組和清水組凡納濱對蝦生長和飼料利用情況

分別測定試驗飼料和試驗結(jié)束時絮團的成分，結(jié)果見表1。

表1 飼料和生物絮團成分(干質(zhì)量) %

絮團組凡納濱對蝦的終末體質(zhì)量、質(zhì)量增加率和特定生長率與清水組無顯著差異，而絮團組凡納濱對蝦的飼料轉(zhuǎn)化效率和蛋白質(zhì)效率顯著高于清水組(表2)。

表2 絮團組和清水組凡納濱對蝦生長和飼料利用情況

2.5 絮團組和清水組凡納濱對蝦肌肉成分比較

絮團組和清水組凡納濱對蝦的肌肉成分無顯著差異(表3)。

表3 絮團組和清水組凡納濱對蝦肌肉成分(濕質(zhì)量) %

3 討 論

3.1 生物絮團的培養(yǎng)

在養(yǎng)殖水體中培養(yǎng)生物絮團，目標是使有益菌群在細菌群落中占據(jù)優(yōu)勢，從而抑制對蝦致病菌或者潛在致病菌，并清除養(yǎng)殖水體中的有害物質(zhì)和有機污染物[6]。芽孢桿菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖中最具代表性的常用益生菌[22]，能廣泛適應(yīng)各種養(yǎng)殖環(huán)境，可以通過脫氮作用與反硝化作用降低水體中的氨氮和亞硝態(tài)氮的含量。有研究發(fā)現(xiàn)，在對蝦養(yǎng)殖水體中添加芽孢桿菌，不僅可以凈化水質(zhì)，優(yōu)化水體中微生物群落結(jié)構(gòu)[23]，提高對蝦的餌料利用率，還能增強對蝦自身的免疫活力[24]。但是在一般養(yǎng)殖環(huán)境中芽孢桿菌等有益菌往往不占優(yōu)勢，需要定向培養(yǎng)或直接添加[25]。在本試驗養(yǎng)殖過程中，通過向養(yǎng)殖體系中定期添加復(fù)合芽孢桿菌制劑，以維持其在絮團系統(tǒng)中的優(yōu)勢度。

培養(yǎng)芽孢桿菌等益生菌還需要保證水體環(huán)境中有足夠的碳、氮營養(yǎng)供應(yīng)。Avnimelech[5]論述了水體中碳氮比對生物絮團形成的調(diào)控機制。微生物碳氮比約為4～5，在干燥情況下碳水化合物的含碳量一般為50%，以此計算可知微生物利用1份氮素需要同時利用8～10份碳水化合物。由于養(yǎng)殖水體中含有大量殘餌和糞便，碳氮比通常低于10；要使水體中碳氮比達到10以上，就需要持續(xù)向水體中添加適當?shù)奶荚?，從而使有益菌進一步增殖并形成穩(wěn)定的生物絮團，成為養(yǎng)殖水體的優(yōu)勢菌群[5]。碳源的選取應(yīng)優(yōu)先考慮來源與成本，通常選用葡萄糖、蔗糖、淀粉等不污染環(huán)境的食品原料，以及麥麩、玉米粉等農(nóng)副原料等[26]。蔗糖是實驗室培養(yǎng)生物絮團的常用碳源，易于被益生菌利用吸收，使益生菌快速增殖并在水體中形成穩(wěn)定的生物絮團[16]。本試驗中，通過直接添加紅糖(蔗糖)調(diào)節(jié)水體的碳氮比，添加量根據(jù)Avnimelech[5]公式計算確定。

在本試驗養(yǎng)殖過程中觀察到的生物絮團與田道賀等[27]所描述的硝化型生物絮團類似。秦海鵬等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在10～30的鹽度內(nèi)，養(yǎng)殖水體的鹽度越高生物絮團生長越快，并且在養(yǎng)殖過程中各組水體的絮團含量均會呈現(xiàn)先升后降的趨勢。筆者選用的養(yǎng)殖鹽度為10，在試驗過程中絮團含量也表現(xiàn)出先升后降的變化規(guī)律。試驗結(jié)束時收集的生物絮團粗蛋白含量為(6.99±0.63)%(表1)，遠低于其他凡納濱對蝦絮團養(yǎng)殖研究的數(shù)值(25%～35%)[15-16]，這可能是因為本試驗中絮團組的投餌量僅為清水組的70%，源于飼料的蛋白轉(zhuǎn)化為生物絮團蛋白的量較少。雖然絮團形成條件(碳源、氮源和微生物等)和絮團粒徑的差異等眾多因素均會影響生物絮團粗蛋白含量[15-16, 29-30]，但本試驗絮團中較低的粗蛋白含量也表明絮團組凡納濱對蝦充分利用了源于飼料的粗蛋白。

3.2 絮團組和清水組水溫比較

生物絮團養(yǎng)殖模式對水溫的影響尚未見研究報道。在本試驗中，從養(yǎng)殖水溫最低的第13天開始，分別測定了絮團組和清水組的水體溫度變化。雖然在13～30 d中，兩組水溫?zé)o顯著差異，但在31～42 d，絮團組水溫顯著高于清水組，這可能是因為隨著溫度的逐漸上升，絮團組中活躍的生化反應(yīng)和更高含量的懸浮物有助于維持較高的水體溫度。不過本試驗結(jié)果也表明，絮團組水溫上升的效應(yīng)只有在水溫高于22 ℃后才逐漸顯現(xiàn)?？紤]到絮團組還有無需換水的優(yōu)勢，生物絮團模式相對于傳統(tǒng)清水養(yǎng)殖模式更適于低溫季節(jié)凡納濱對蝦養(yǎng)殖，與溫室大棚相結(jié)合可更有效地維持養(yǎng)殖水體溫度。

3.3 凡納濱對蝦日攝食率的變化

陳昌生等[20]研究發(fā)現(xiàn)，凡納濱對蝦存活、攝食及生長的適宜水溫為18～35 ℃，最適水溫為30～33 ℃，水溫18 ℃以下時，攝食量減少。在整個養(yǎng)殖周期中，清水組水溫低于18 ℃的時間有6 d，但最低溫度只是17.2 ℃，與18 ℃無明顯差異，因此凡納濱對蝦在整個試驗期間的日攝食率受溫度影響有一定波動，但差異不顯著。養(yǎng)殖期間，清水組的平均水溫(21.3±2.0) ℃，凡納濱對蝦的平均日攝食率(1.87±0.30)%，低于陳昌生等[20]研究結(jié)果(21 ℃、2.35%)，這可能是因為本試驗中所使用凡納濱對蝦個體相對較大的緣故。

3.4 絮團組和清水組凡納濱對蝦體成分比較

Chan-Vivas等[31]研究發(fā)現(xiàn)，生物絮團養(yǎng)殖的對蝦由于在養(yǎng)殖過程中運動較多，其肌肉更加緊致，口感更好；在對本試驗生物絮團養(yǎng)殖的凡納濱對蝦進行采樣時也發(fā)現(xiàn)，其肌肉的確更加緊致。不過并未發(fā)現(xiàn)絮團組和清水組凡納濱對蝦體成分存在顯著差異，葛海倫等[32]在生物絮團養(yǎng)殖對羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)體成分的研究中也發(fā)現(xiàn)了同樣現(xiàn)象。這可能是因為絮團組和清水組凡納濱對蝦的蛋白和脂肪均來源于相同飼料，因此生物絮團養(yǎng)殖模式下凡納濱對蝦的體成分并未產(chǎn)生顯著影響。

3.5 絮團組和清水組凡納濱對蝦生長和飼料利用效率比較

在本試驗中，凡納濱對蝦生長緩慢，飼料轉(zhuǎn)化效率不高，這主要是因為養(yǎng)殖期間水溫較低，抑制了對蝦的攝食和生長[20]。清水組凡納濱對蝦的飼料轉(zhuǎn)化效率為27.97%，略高于陳昌生等[20]的研究結(jié)果(21 ℃、26.87%)。眾多研究結(jié)果已表明，對蝦可以通過利用生物絮團中的營養(yǎng)物質(zhì)，從而提高飼料利用效率。申玉春等[33]利用13C作為天然示蹤物，發(fā)現(xiàn)高位養(yǎng)殖池生態(tài)系統(tǒng)中的天然餌料能為凡納濱對蝦的生長提供能源物質(zhì)，且貢獻比率會隨人工飼料的投喂而降低；Burford等[7]使用15N示蹤技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，生物絮團系統(tǒng)中養(yǎng)殖的凡納濱對蝦的確攝食了富含15N的生物絮團，對蝦保留的蛋白質(zhì)中有18%～29%是由生物絮團提供；Gamboa-delgado等[12]將養(yǎng)殖結(jié)束后收集的生物絮團干粉作為替代蛋白源，以不同比例(0%、25%、50%、70%和100%)替代凡納濱對蝦飼料中的魚粉，進行了29 d的養(yǎng)殖試驗，發(fā)現(xiàn)替代25%魚粉時，凡納濱對蝦的生長速度無顯著變化；Cardona等[9]使用雙源單同位素混合模型，計算出生物絮團對細角濱對蝦(L.stylirostris)幼蝦碳和氮的生長貢獻率分別為39.8%和36.9%。在本試驗中，絮團組凡納濱對蝦的投喂率設(shè)定為清水組凡納濱對蝦的70%，42 d的養(yǎng)殖試驗結(jié)果表明，絮團組凡納濱對蝦的終末體質(zhì)量、質(zhì)量增加率和特定生長率與清水組無顯著差異，而飼料轉(zhuǎn)化效率和蛋白質(zhì)效率顯著高于清水組，與王超等[17-18]對凡納濱對蝦生物絮團養(yǎng)殖的研究結(jié)果相似。本試驗結(jié)果佐證了生物絮團技術(shù)的確可以提高飼料的利用效率，減少飼料的浪費這一結(jié)論。下一步的研究將設(shè)計凡納濱對蝦投餌量梯度試驗，確定在生物絮團養(yǎng)殖模式下，飼料轉(zhuǎn)化效率最高、養(yǎng)殖效益最好的投餌量，并采用穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)定量生物絮團在對蝦生長中的貢獻。

4 結(jié) 論

在平均水溫約21 ℃的低溫季節(jié)及鹽度10的實驗室養(yǎng)殖條件下，初始體質(zhì)量(3.17±0.37) g的凡納濱對蝦在生物絮團中養(yǎng)殖時，投餌量只有清水養(yǎng)殖的70%，特定生長率與在清水中養(yǎng)殖無顯著差異，飼料轉(zhuǎn)化效率顯著提高。