張 奇，楊 軍，廖偉堅，李自金，鄭連春，何緒剛

( 1.華中農(nóng)業(yè)大學 水產(chǎn)學院，湖北 武漢 430070； 2.湖北省宜昌市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，湖北 宜昌 443000； 3.荊門市五龍飼料有限公司，湖北 荊門 448000 )

大口黑鱸(Micropterussalmoides)，屬鱸形目、鱸亞目、太陽魚科、黑鱸屬，是北美重要的淡水魚類之一[1]。20世紀70年代我國臺灣從原產(chǎn)地引進此魚，并于20世紀80年代引進廣東，現(xiàn)已推廣到全國各地，已成為我國重要的淡水養(yǎng)殖品種之一[2]。大口黑鱸屬肉食性魚類，飼喂方式上經(jīng)歷了投喂冰鮮雜魚和人工配合飼料兩個階段。投喂冰鮮雜魚的方式不僅容易造成水質(zhì)污染，而且還極易帶入病原細菌，故這種飼喂方式已被逐漸淘汰[3-5]。由于人工配合飼料的營養(yǎng)配方和加工工藝仍有不足，加之大口黑鱸具有易患脂肪肝[6]、且對碳水化合物利用效率較低[7]等固有特性，全程飼喂人工飼料易出現(xiàn)生長緩慢、肝臟腫大和組織壞死等不良狀況[8]。

為解決上述飼喂問題，生產(chǎn)中已開始廣泛使用各種非抗生素類功能性飼料添加劑。如單獨添加一定量的黃芪多糖[9]、杜仲[10]、膽汁酸[11]、L-肉堿[12]、酵母細胞壁[13]等物質(zhì)到飼料中，對水產(chǎn)動物的生長、免疫和抗氧化性能等有一定的促進作用。從經(jīng)濟效益和生物學效應的角度來看，單一型飼料添加劑作用有限，復合型飼料添加劑的研發(fā)是大勢所趨[14]，而復合型飼料添加劑對大口黑鱸養(yǎng)殖生產(chǎn)的效果尚未見報道。筆者評價了復合型飼料添加劑對大口黑鱸生長、生理生化和抗氧化性能等方面的效應，旨在為大口黑鱸養(yǎng)殖生產(chǎn)中合理使用功能性飼料添加劑提供科學依據(jù)和指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用大口黑鱸來自華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院實訓基地，選擇健康活躍、規(guī)格一致的1齡大口黑鱸270尾作為試驗用魚，平均體質(zhì)量為(50.42±6.42) g，平均體長為(11.09±0.30) cm。試驗基礎(chǔ)飼料、復合型飼料添加劑、功能飼料由荊門市五龍飼料有限公司提供?；A(chǔ)飼料主要組成：粗蛋白≥48.00%，粗脂肪≥6.00%，粗纖維≤4.00%，粗灰分≤16.00%；復合型飼料添加劑主要組成：黃芪多糖10.50%、杜仲20.00%、酵母細胞壁10.00%、膽汁酸25.00%、L-肉堿10.00%以及維生素(C、E、B6等)24.50%；功能飼料是在上述基礎(chǔ)飼料中添加了三黃粉50%、膽汁酸30%、L-肉堿20%的等蛋白、等脂類商品化功能飼料。

1.2 試驗設(shè)計

將270尾大口黑鱸進行為期2周的適應性飼養(yǎng)后，隨機分為空白對照組(基礎(chǔ)飼料)、試驗組(基礎(chǔ)飼料+0.01%復合型飼料添加劑)、陽性對照組(功能飼料)共3個處理組，每組3個平行，每個平行30尾，在室內(nèi)循環(huán)水系統(tǒng)養(yǎng)殖8周，養(yǎng)殖密度3尾/m3，投餌量為體質(zhì)量的1%～3%，每日8:00和17:00各喂1次，水源為曝氣自來水。試驗期間水溫(26.5±0.30) ℃，溶解氧質(zhì)量濃度高于6.40 mg/L，pH為7.56±0.15，氨氮質(zhì)量濃度低于1.00 mg/L，亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度低于0.30 mg/L，磷酸鹽質(zhì)量濃度低于0.80 mg/L。

1.3 樣品采集與分析

飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，每個平行隨機取5尾魚，用氨基甲酸乙酯(烏來糖)麻醉后，迅速測定體長和體質(zhì)量，然后用2.5 mL的注射器尾部靜脈取血，室溫靜置1 h后，在轉(zhuǎn)速3500 r/min(離心半徑8 cm)、4 ℃條件下離心30 min，分離血清，-80 ℃保存?zhèn)溆?。將每尾魚解剖后分離肝臟、脾臟，并稱質(zhì)量，取5 g肝臟于凍存管中，液氮速凍后置于冰箱-80 ℃保存，用于肝臟抗氧化指標測定，另取1 g肝臟置于多聚甲醛中用于蘇木精—伊紅染色，剩余肝臟部分以及背部肌肉，置于-20 ℃冰箱保存，用于肌肉基礎(chǔ)營養(yǎng)組分測定。

大口黑鱸全魚、肌肉和肝臟采用105 ℃烘干至恒等質(zhì)量的干燥法測定水分含量，馬福爐550 ℃灼燒法測灰分含量，凱氏定氮法測定粗蛋白含量，索氏抽提法測定粗脂肪含量。

血清生化指標總蛋白、白蛋白、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶采用全自動生化分析儀測定，試劑盒購自中生北控生物技術(shù)股份有限公司。肝臟抗氧化指標超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、丙二醛和總抗氧化能力采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定。

1.4 指標計算

wWGR=(m2-m1)/m1×100%

RSG=(lnm2-lnm1)/t×100%

IF=m3/(m2-m1)

CF=100mb/L3

wv=mv/mb×100%

wh=mh/mb×100%

ws=ms/mb×100%

RS=nt/n0×100%

式中，wWGR為體質(zhì)量增加率(%)，RSG為特定生長率(%/d)，IF為餌料系數(shù)，CF為肥滿度，wv為臟體比(%)，wh為肝體比(%)，ws為脾體比(%)，RS為成活率(%)，m1為魚體最初平均質(zhì)量(g)，m2為魚體最終平均質(zhì)量(g)，t為飼喂天數(shù)，m3為每尾魚平均攝食飼料總質(zhì)量(g)，nt為收獲數(shù)量(尾)，n0為放養(yǎng)數(shù)量(尾)，mh為每尾魚終末肝臟質(zhì)量(g)，mv為每尾魚終末內(nèi)臟質(zhì)量(g)，ms為每尾魚終末脾臟質(zhì)量(g)，mb為每尾魚終末體質(zhì)量(g)，L為每尾魚終末體長(cm)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗結(jié)果用平均數(shù)±標準差表示，采用SPSS 25.0軟件進行單因素方差分析，利用Duncan′s多重比較進行組間顯著差異分析，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 復合型飼料添加劑對大口黑鱸生長以及形體指標的影響

與空白對照組相比，試驗組體質(zhì)量增加率和特定生長率顯著升高(P<0.05)，餌料系數(shù)、肥滿度和成活率各試驗組間差異不顯著(P>0.05)，但試驗組餌料系數(shù)有降低趨勢。相比于空白對照組，試驗組和陽性對照組的肝體比顯著降低(P<0.05)；臟體比、脾體比各試驗組間差異不顯著(P>0.05)(表1)。

表1 復合型飼料添加劑對大口黑鱸生長性能的影響

2.2 復合型飼料添加劑對大口黑鱸全魚、肌肉和肝臟營養(yǎng)成分的影響

各試驗組全魚和肌肉組織的營養(yǎng)成分均差異不顯著(P>0.05)，但試驗組肝臟中粗脂肪含量顯著低于空白及陽性對照組(P<0.05)(圖1)。

圖1 復合型飼料添加劑對大口黑鱸魚體營養(yǎng)組分的影響

2.3 復合型飼料添加劑對大口黑鱸血液生化指標的影響

試驗組和陽性對照組谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性顯著低于空白對照組(P<0.05)，同時試驗組堿性磷酸酶活性顯著提高(P<0.05)；白蛋白和總蛋白質(zhì)量濃度在各處理組間差異不顯著(P>0.05)，但試驗組相對于空白及陽性對照組有上升趨勢(表2)。

表2 復合型飼料添加劑對大口黑鱸血液生化指標影響

2.4 復合型飼料添加劑對大口黑鱸肝臟抗氧化性的影響

與空白對照組相比，試驗組和陽性對照組中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性顯著提高(P<0.05)，總抗氧化能力有所上升但差異不顯著(P>0.05)；同時試驗組丙二醛質(zhì)量摩爾濃度相比于空白及陽性對照組顯著降低(P<0.05)(表3)。

表3 復合型飼料添加劑對大口黑鱸肝臟抗氧化指標影響

2.5 復合型飼料添加劑對大口黑鱸肝臟組織學影響

肝臟形態(tài)和組織蘇木精—伊紅染色結(jié)果(圖2)顯示，投喂8周后，空白對照組肝臟組織出現(xiàn)了明顯的黑色素巨噬細胞中心和組織炎癥；陽性對照組肝細胞可見核遷移和許多空泡形成；試驗組肝細胞形狀較規(guī)則，細胞結(jié)構(gòu)基本保持正常。從肝臟外觀形態(tài)上看，空白對照組肝臟顏色泛黃，這是典型的病變特征；相比之下，試驗組、陽性對照組肝臟顏色紅潤。

圖2 大口黑鱸肝臟組織學結(jié)構(gòu)及外觀形態(tài)(蘇木精—伊紅200×)

3 討 論

3.1 復合型飼料添加劑對大口黑鱸生長、形體指標以及營養(yǎng)成分的影響

大口黑鱸作為我國重要的淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟魚類，飼料中氧化魚油[15]、蛋白質(zhì)或脂肪含量不適宜[16]均會影響其生長。近年來針對以上問題，飼料添加劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的應用受到廣泛關(guān)注。在本試驗中，將復合型飼料添加劑添加到基礎(chǔ)飼料中，顯著提高了大口黑鱸體質(zhì)量增加率和特定生長率，表明復合型飼料添加劑對大口黑鱸生長具有積極作用。這可能因為復合型飼料添加劑中黃芪多糖、膽汁酸、L-肉堿等活性物質(zhì)能促進魚體蛋白質(zhì)的合成，提高脂肪利用率，從而提高了大口黑鱸的生長性能。此外，已有研究表明，黃芪多糖對齊口裂腹魚(Schizothoraxprenanti)[17]和大黃魚(Larimichthyscrocea)[18]的飼料轉(zhuǎn)化利用具有明顯改善效果；膽汁酸對于大菱鲆幼魚的餌料系數(shù)也具有顯著降低作用[11]。在本試驗中，添加復合型飼料添加劑對于大口黑鱸餌料系數(shù)無顯著影響，研究結(jié)果間的差異可能是試驗魚的種類、魚體發(fā)育階段、基礎(chǔ)飼料中脂肪和蛋白質(zhì)含量不同所致。臟體比、肝體比以及脾體比是評價魚體健康和品質(zhì)的重要指標。添加復合型飼料添加劑能顯著降低大口黑鱸肝體比，而且根據(jù)肝臟粗營養(yǎng)成分分析結(jié)果，復合型飼料添加劑也顯著降低了肝臟粗脂肪含量，這與復合型飼料添加劑中含有膽汁酸和L-肉堿有關(guān)。已有研究表明，L-肉堿在脂肪酸代謝中起重要的作用，它可以將長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運到線粒體中進行β氧化，加速了組織脂肪氧化[19]；而膽汁酸可以促進小腸中脂肪和脂溶性維生素的吸收以及維持肝臟中膽固醇穩(wěn)態(tài)[20]；L-肉堿或膽汁酸應用于草魚(Ctenopharyngodonidella)[21-22]和鯉(Cyprinuscarpio)[23]的研究也得到了一致的結(jié)果。因此，飼料中添加適量的復合型飼料添加劑可以有效改善魚體營養(yǎng)狀況，減少肝臟能量的沉積，降低組織脂肪含量。

3.2 復合型飼料添加劑對大口黑鱸血清生化指標和肝臟健康的影響

魚類的血液生化指標在一定程度上可以反映魚體的健康狀況。血清中總蛋白和白蛋白含量是評估動物體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝狀況的指標，間接反映其健康和免疫水平[24]。堿性磷酸酶不僅是機體重要的代謝調(diào)控酶，還可以增強機體對病原體的識別和吞噬能力，進而提高魚體的抗病能力[25]。有研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加適量的黃芪多糖[26]或膽汁酸[22]可以增加養(yǎng)殖魚類血清總蛋白和白蛋白的含量；本試驗結(jié)果有所不同，各組之間總蛋白和白蛋白含量并未出現(xiàn)顯著差異，這主要歸因于添加劑的種類和含量不同。復合型飼料添加劑使大口黑鱸血清堿性磷酸酶活性顯著升高，這可能與其中黃芪多糖、膽汁酸和杜仲等活性物質(zhì)有關(guān)。已有研究報道，黃芪多糖[26]、膽汁酸[27]、杜仲[10]等均可通過提高血清堿性磷酸酶活性改善養(yǎng)殖魚類的非特異性免疫功能。但是，具體是哪種或哪幾種組分對提高免疫力作用最大尚未知曉，需要進一步的研究驗證。谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶都是評估肝臟功能的重要指標，其活性顯著增強通常表示肝臟發(fā)生變性、損傷或壞死[28]。在本試驗中，添加復合型飼料添加劑顯著降低大口黑鱸血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性。這與在高淀粉飼料中添加膽汁酸能減輕大口黑鱸肝臟損傷[27]的研究結(jié)果一致。再結(jié)合肝臟外觀形態(tài)和組織學蘇木精—伊紅染色結(jié)果，添加復合型飼料添加劑后，大口黑鱸肝臟顏色紅潤，組織結(jié)構(gòu)中巨噬細胞中心和組織炎癥較投喂基礎(chǔ)飼料組具有明顯改善，表明復合型飼料添加劑對大口黑鱸肝臟健康有利，對肝臟病變有一定的預防和治療效果。

3.3 復合型飼料添加劑對大口黑鱸肝臟抗氧化能力的影響

抗氧化系統(tǒng)、溶菌酶、補體系統(tǒng)等是魚類非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分[29]，而機體抗氧化系統(tǒng)功能與總抗氧化力、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等指標密切相關(guān)，這些指標活性的高低直接反映機體對于應激代償能力和清除自由基能力的強弱[30]。丙二醛是脂質(zhì)過氧化反應的最終產(chǎn)物，其濃度間接反映機體細胞的損傷程度[31]。王煜恒等[9]研究表明，黃芪多糖能夠顯著提高雜交鱧(Channamaculate♀×C.argus♂)肝臟中超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性，同時能顯著抑制丙二醛的合成；明建華等[32]研究表明，添加L-肉堿可提高青魚(Mylopharyngodonpiceus)肝臟中超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性，降低丙二醛的濃度。本試驗的結(jié)果與之類似，添加復合型飼料添加劑能夠顯著提高大口黑鱸肝臟中超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性，同時顯著降低了丙二醛的濃度，總抗氧化能力雖然沒有明顯差異，但也呈現(xiàn)了升高趨勢。這可能與復合型飼料添加劑中的黃芪多糖、L-肉堿和膽汁酸能抑制活性氧自由基的產(chǎn)生[33]有關(guān)，同時杜仲也具有清除自由基的能力[10,34]。以上結(jié)果表明，復合型飼料添加劑能有效提高大口黑鱸抗氧化能力、增強肝功能、降低氧自由基對機體的損傷。

4 結(jié) 論

綜上所述，黃芪多糖、杜仲、酵母細胞壁、膽汁酸、L-肉堿等有機結(jié)合的復合型飼料添加劑，在基礎(chǔ)飼料中添加0.01%投喂，能有效促進大口黑鱸生長，顯著降低肝臟脂肪含量，并能提高肝臟抗氧化能力，對魚體健康有積極作用。