張 奇，楊 軍，廖偉堅(jiān)，李自金，鄭連春，何緒剛

( 1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，湖北 武漢 430070； 2.湖北省宜昌市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，湖北 宜昌 443000； 3.荊門市五龍飼料有限公司，湖北 荊門 448000 )

大口黑鱸(Micropterussalmoides)，屬鱸形目、鱸亞目、太陽(yáng)魚科、黑鱸屬，是北美重要的淡水魚類之一[1]。20世紀(jì)70年代我國(guó)臺(tái)灣從原產(chǎn)地引進(jìn)此魚，并于20世紀(jì)80年代引進(jìn)廣東，現(xiàn)已推廣到全國(guó)各地，已成為我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖品種之一[2]。大口黑鱸屬肉食性魚類，飼喂方式上經(jīng)歷了投喂冰鮮雜魚和人工配合飼料兩個(gè)階段。投喂冰鮮雜魚的方式不僅容易造成水質(zhì)污染，而且還極易帶入病原細(xì)菌，故這種飼喂方式已被逐漸淘汰[3-5]。由于人工配合飼料的營(yíng)養(yǎng)配方和加工工藝仍有不足，加之大口黑鱸具有易患脂肪肝[6]、且對(duì)碳水化合物利用效率較低[7]等固有特性，全程飼喂人工飼料易出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢、肝臟腫大和組織壞死等不良狀況[8]。

為解決上述飼喂問(wèn)題，生產(chǎn)中已開(kāi)始廣泛使用各種非抗生素類功能性飼料添加劑。如單獨(dú)添加一定量的黃芪多糖[9]、杜仲[10]、膽汁酸[11]、L-肉堿[12]、酵母細(xì)胞壁[13]等物質(zhì)到飼料中，對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)、免疫和抗氧化性能等有一定的促進(jìn)作用。從經(jīng)濟(jì)效益和生物學(xué)效應(yīng)的角度來(lái)看，單一型飼料添加劑作用有限，復(fù)合型飼料添加劑的研發(fā)是大勢(shì)所趨[14]，而復(fù)合型飼料添加劑對(duì)大口黑鱸養(yǎng)殖生產(chǎn)的效果尚未見(jiàn)報(bào)道。筆者評(píng)價(jià)了復(fù)合型飼料添加劑對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)、生理生化和抗氧化性能等方面的效應(yīng)，旨在為大口黑鱸養(yǎng)殖生產(chǎn)中合理使用功能性飼料添加劑提供科學(xué)依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用大口黑鱸來(lái)自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院實(shí)訓(xùn)基地，選擇健康活躍、規(guī)格一致的1齡大口黑鱸270尾作為試驗(yàn)用魚，平均體質(zhì)量為(50.42±6.42) g，平均體長(zhǎng)為(11.09±0.30) cm。試驗(yàn)基礎(chǔ)飼料、復(fù)合型飼料添加劑、功能飼料由荊門市五龍飼料有限公司提供?；A(chǔ)飼料主要組成：粗蛋白≥48.00%，粗脂肪≥6.00%，粗纖維≤4.00%，粗灰分≤16.00%；復(fù)合型飼料添加劑主要組成：黃芪多糖10.50%、杜仲20.00%、酵母細(xì)胞壁10.00%、膽汁酸25.00%、L-肉堿10.00%以及維生素(C、E、B6等)24.50%；功能飼料是在上述基礎(chǔ)飼料中添加了三黃粉50%、膽汁酸30%、L-肉堿20%的等蛋白、等脂類商品化功能飼料。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將270尾大口黑鱸進(jìn)行為期2周的適應(yīng)性飼養(yǎng)后，隨機(jī)分為空白對(duì)照組(基礎(chǔ)飼料)、試驗(yàn)組(基礎(chǔ)飼料+0.01%復(fù)合型飼料添加劑)、陽(yáng)性對(duì)照組(功能飼料)共3個(gè)處理組，每組3個(gè)平行，每個(gè)平行30尾，在室內(nèi)循環(huán)水系統(tǒng)養(yǎng)殖8周，養(yǎng)殖密度3尾/m3，投餌量為體質(zhì)量的1%～3%，每日8:00和17:00各喂1次，水源為曝氣自來(lái)水。試驗(yàn)期間水溫(26.5±0.30) ℃，溶解氧質(zhì)量濃度高于6.40 mg/L，pH為7.56±0.15，氨氮質(zhì)量濃度低于1.00 mg/L，亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度低于0.30 mg/L，磷酸鹽質(zhì)量濃度低于0.80 mg/L。

1.3 樣品采集與分析

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，每個(gè)平行隨機(jī)取5尾魚，用氨基甲酸乙酯(烏來(lái)糖)麻醉后，迅速測(cè)定體長(zhǎng)和體質(zhì)量，然后用2.5 mL的注射器尾部靜脈取血，室溫靜置1 h后，在轉(zhuǎn)速3500 r/min(離心半徑8 cm)、4 ℃條件下離心30 min，分離血清，-80 ℃保存?zhèn)溆?。將每尾魚解剖后分離肝臟、脾臟，并稱質(zhì)量，取5 g肝臟于凍存管中，液氮速凍后置于冰箱-80 ℃保存，用于肝臟抗氧化指標(biāo)測(cè)定，另取1 g肝臟置于多聚甲醛中用于蘇木精—伊紅染色，剩余肝臟部分以及背部肌肉，置于-20 ℃冰箱保存，用于肌肉基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)組分測(cè)定。

大口黑鱸全魚、肌肉和肝臟采用105 ℃烘干至恒等質(zhì)量的干燥法測(cè)定水分含量，馬福爐550 ℃灼燒法測(cè)灰分含量，凱氏定氮法測(cè)定粗蛋白含量，索氏抽提法測(cè)定粗脂肪含量。

血清生化指標(biāo)總蛋白、白蛋白、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定，試劑盒購(gòu)自中生北控生物技術(shù)股份有限公司。肝臟抗氧化指標(biāo)超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、丙二醛和總抗氧化能力采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定。

1.4 指標(biāo)計(jì)算

wWGR=(m2-m1)/m1×100%

RSG=(lnm2-lnm1)/t×100%

IF=m3/(m2-m1)

CF=100mb/L3

wv=mv/mb×100%

wh=mh/mb×100%

ws=ms/mb×100%

RS=nt/n0×100%

式中，wWGR為體質(zhì)量增加率(%)，RSG為特定生長(zhǎng)率(%/d)，IF為餌料系數(shù)，CF為肥滿度，wv為臟體比(%)，wh為肝體比(%)，ws為脾體比(%)，RS為成活率(%)，m1為魚體最初平均質(zhì)量(g)，m2為魚體最終平均質(zhì)量(g)，t為飼喂天數(shù)，m3為每尾魚平均攝食飼料總質(zhì)量(g)，nt為收獲數(shù)量(尾)，n0為放養(yǎng)數(shù)量(尾)，mh為每尾魚終末肝臟質(zhì)量(g)，mv為每尾魚終末內(nèi)臟質(zhì)量(g)，ms為每尾魚終末脾臟質(zhì)量(g)，mb為每尾魚終末體質(zhì)量(g)，L為每尾魚終末體長(zhǎng)(cm)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，利用Duncan′s多重比較進(jìn)行組間顯著差異分析，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 復(fù)合型飼料添加劑對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)以及形體指標(biāo)的影響

與空白對(duì)照組相比，試驗(yàn)組體質(zhì)量增加率和特定生長(zhǎng)率顯著升高(P<0.05)，餌料系數(shù)、肥滿度和成活率各試驗(yàn)組間差異不顯著(P>0.05)，但試驗(yàn)組餌料系數(shù)有降低趨勢(shì)。相比于空白對(duì)照組，試驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組的肝體比顯著降低(P<0.05)；臟體比、脾體比各試驗(yàn)組間差異不顯著(P>0.05)(表1)。

表1 復(fù)合型飼料添加劑對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)性能的影響

2.2 復(fù)合型飼料添加劑對(duì)大口黑鱸全魚、肌肉和肝臟營(yíng)養(yǎng)成分的影響

各試驗(yàn)組全魚和肌肉組織的營(yíng)養(yǎng)成分均差異不顯著(P>0.05)，但試驗(yàn)組肝臟中粗脂肪含量顯著低于空白及陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)(圖1)。

圖1 復(fù)合型飼料添加劑對(duì)大口黑鱸魚體營(yíng)養(yǎng)組分的影響

2.3 復(fù)合型飼料添加劑對(duì)大口黑鱸血液生化指標(biāo)的影響

試驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)，同時(shí)試驗(yàn)組堿性磷酸酶活性顯著提高(P<0.05)；白蛋白和總蛋白質(zhì)量濃度在各處理組間差異不顯著(P>0.05)，但試驗(yàn)組相對(duì)于空白及陽(yáng)性對(duì)照組有上升趨勢(shì)(表2)。

表2 復(fù)合型飼料添加劑對(duì)大口黑鱸血液生化指標(biāo)影響

2.4 復(fù)合型飼料添加劑對(duì)大口黑鱸肝臟抗氧化性的影響

與空白對(duì)照組相比，試驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組中超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶活性顯著提高(P<0.05)，總抗氧化能力有所上升但差異不顯著(P>0.05)；同時(shí)試驗(yàn)組丙二醛質(zhì)量摩爾濃度相比于空白及陽(yáng)性對(duì)照組顯著降低(P<0.05)(表3)。

表3 復(fù)合型飼料添加劑對(duì)大口黑鱸肝臟抗氧化指標(biāo)影響

2.5 復(fù)合型飼料添加劑對(duì)大口黑鱸肝臟組織學(xué)影響

肝臟形態(tài)和組織蘇木精—伊紅染色結(jié)果(圖2)顯示，投喂8周后，空白對(duì)照組肝臟組織出現(xiàn)了明顯的黑色素巨噬細(xì)胞中心和組織炎癥；陽(yáng)性對(duì)照組肝細(xì)胞可見(jiàn)核遷移和許多空泡形成；試驗(yàn)組肝細(xì)胞形狀較規(guī)則，細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本保持正常。從肝臟外觀形態(tài)上看，空白對(duì)照組肝臟顏色泛黃，這是典型的病變特征；相比之下，試驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組肝臟顏色紅潤(rùn)。

圖2 大口黑鱸肝臟組織學(xué)結(jié)構(gòu)及外觀形態(tài)(蘇木精—伊紅200×)

3 討 論

3.1 復(fù)合型飼料添加劑對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)、形體指標(biāo)以及營(yíng)養(yǎng)成分的影響

大口黑鱸作為我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類，飼料中氧化魚油[15]、蛋白質(zhì)或脂肪含量不適宜[16]均會(huì)影響其生長(zhǎng)。近年來(lái)針對(duì)以上問(wèn)題，飼料添加劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的應(yīng)用受到廣泛關(guān)注。在本試驗(yàn)中，將復(fù)合型飼料添加劑添加到基礎(chǔ)飼料中，顯著提高了大口黑鱸體質(zhì)量增加率和特定生長(zhǎng)率，表明復(fù)合型飼料添加劑對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)具有積極作用。這可能因?yàn)閺?fù)合型飼料添加劑中黃芪多糖、膽汁酸、L-肉堿等活性物質(zhì)能促進(jìn)魚體蛋白質(zhì)的合成，提高脂肪利用率，從而提高了大口黑鱸的生長(zhǎng)性能。此外，已有研究表明，黃芪多糖對(duì)齊口裂腹魚(Schizothoraxprenanti)[17]和大黃魚(Larimichthyscrocea)[18]的飼料轉(zhuǎn)化利用具有明顯改善效果；膽汁酸對(duì)于大菱鲆幼魚的餌料系數(shù)也具有顯著降低作用[11]。在本試驗(yàn)中，添加復(fù)合型飼料添加劑對(duì)于大口黑鱸餌料系數(shù)無(wú)顯著影響，研究結(jié)果間的差異可能是試驗(yàn)魚的種類、魚體發(fā)育階段、基礎(chǔ)飼料中脂肪和蛋白質(zhì)含量不同所致。臟體比、肝體比以及脾體比是評(píng)價(jià)魚體健康和品質(zhì)的重要指標(biāo)。添加復(fù)合型飼料添加劑能顯著降低大口黑鱸肝體比，而且根據(jù)肝臟粗營(yíng)養(yǎng)成分分析結(jié)果，復(fù)合型飼料添加劑也顯著降低了肝臟粗脂肪含量，這與復(fù)合型飼料添加劑中含有膽汁酸和L-肉堿有關(guān)。已有研究表明，L-肉堿在脂肪酸代謝中起重要的作用，它可以將長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體中進(jìn)行β氧化，加速了組織脂肪氧化[19]；而膽汁酸可以促進(jìn)小腸中脂肪和脂溶性維生素的吸收以及維持肝臟中膽固醇穩(wěn)態(tài)[20]；L-肉堿或膽汁酸應(yīng)用于草魚(Ctenopharyngodonidella)[21-22]和鯉(Cyprinuscarpio)[23]的研究也得到了一致的結(jié)果。因此，飼料中添加適量的復(fù)合型飼料添加劑可以有效改善魚體營(yíng)養(yǎng)狀況，減少肝臟能量的沉積，降低組織脂肪含量。

3.2 復(fù)合型飼料添加劑對(duì)大口黑鱸血清生化指標(biāo)和肝臟健康的影響

魚類的血液生化指標(biāo)在一定程度上可以反映魚體的健康狀況。血清中總蛋白和白蛋白含量是評(píng)估動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝狀況的指標(biāo)，間接反映其健康和免疫水平[24]。堿性磷酸酶不僅是機(jī)體重要的代謝調(diào)控酶，還可以增強(qiáng)機(jī)體對(duì)病原體的識(shí)別和吞噬能力，進(jìn)而提高魚體的抗病能力[25]。有研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加適量的黃芪多糖[26]或膽汁酸[22]可以增加養(yǎng)殖魚類血清總蛋白和白蛋白的含量；本試驗(yàn)結(jié)果有所不同，各組之間總蛋白和白蛋白含量并未出現(xiàn)顯著差異，這主要?dú)w因于添加劑的種類和含量不同。復(fù)合型飼料添加劑使大口黑鱸血清堿性磷酸酶活性顯著升高，這可能與其中黃芪多糖、膽汁酸和杜仲等活性物質(zhì)有關(guān)。已有研究報(bào)道，黃芪多糖[26]、膽汁酸[27]、杜仲[10]等均可通過(guò)提高血清堿性磷酸酶活性改善養(yǎng)殖魚類的非特異性免疫功能。但是，具體是哪種或哪幾種組分對(duì)提高免疫力作用最大尚未知曉，需要進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶都是評(píng)估肝臟功能的重要指標(biāo)，其活性顯著增強(qiáng)通常表示肝臟發(fā)生變性、損傷或壞死[28]。在本試驗(yàn)中，添加復(fù)合型飼料添加劑顯著降低大口黑鱸血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性。這與在高淀粉飼料中添加膽汁酸能減輕大口黑鱸肝臟損傷[27]的研究結(jié)果一致。再結(jié)合肝臟外觀形態(tài)和組織學(xué)蘇木精—伊紅染色結(jié)果，添加復(fù)合型飼料添加劑后，大口黑鱸肝臟顏色紅潤(rùn)，組織結(jié)構(gòu)中巨噬細(xì)胞中心和組織炎癥較投喂基礎(chǔ)飼料組具有明顯改善，表明復(fù)合型飼料添加劑對(duì)大口黑鱸肝臟健康有利，對(duì)肝臟病變有一定的預(yù)防和治療效果。

3.3 復(fù)合型飼料添加劑對(duì)大口黑鱸肝臟抗氧化能力的影響

抗氧化系統(tǒng)、溶菌酶、補(bǔ)體系統(tǒng)等是魚類非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分[29]，而機(jī)體抗氧化系統(tǒng)功能與總抗氧化力、超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶等指標(biāo)密切相關(guān)，這些指標(biāo)活性的高低直接反映機(jī)體對(duì)于應(yīng)激代償能力和清除自由基能力的強(qiáng)弱[30]。丙二醛是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，其濃度間接反映機(jī)體細(xì)胞的損傷程度[31]。王煜恒等[9]研究表明，黃芪多糖能夠顯著提高雜交鱧(Channamaculate♀×C.argus♂)肝臟中超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶的活性，同時(shí)能顯著抑制丙二醛的合成；明建華等[32]研究表明，添加L-肉堿可提高青魚(Mylopharyngodonpiceus)肝臟中超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶的活性，降低丙二醛的濃度。本試驗(yàn)的結(jié)果與之類似，添加復(fù)合型飼料添加劑能夠顯著提高大口黑鱸肝臟中超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶的活性，同時(shí)顯著降低了丙二醛的濃度，總抗氧化能力雖然沒(méi)有明顯差異，但也呈現(xiàn)了升高趨勢(shì)。這可能與復(fù)合型飼料添加劑中的黃芪多糖、L-肉堿和膽汁酸能抑制活性氧自由基的產(chǎn)生[33]有關(guān)，同時(shí)杜仲也具有清除自由基的能力[10,34]。以上結(jié)果表明，復(fù)合型飼料添加劑能有效提高大口黑鱸抗氧化能力、增強(qiáng)肝功能、降低氧自由基對(duì)機(jī)體的損傷。

4 結(jié) 論

綜上所述，黃芪多糖、杜仲、酵母細(xì)胞壁、膽汁酸、L-肉堿等有機(jī)結(jié)合的復(fù)合型飼料添加劑，在基礎(chǔ)飼料中添加0.01%投喂，能有效促進(jìn)大口黑鱸生長(zhǎng)，顯著降低肝臟脂肪含量，并能提高肝臟抗氧化能力，對(duì)魚體健康有積極作用。