黃 斌，杜功志，候華毅，黃文娟，陳相柏

武漢工程大學光學信息與模式識別湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430205

引 言

NADH(reduced nicotinamide adenine dinucleotide)是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的還原態(tài)，N指煙酰胺，A指腺嘌呤，D是二核苷酸。NADH在維持細胞生長、分化和能量代謝以及細胞保護等各方面起著重要的作用, 可以降低因輻射、藥物、有毒物質、劇烈運動、缺血等各種因素引起的細胞的氧化應激，從而保護血管內皮細胞、肝細胞、心肌細胞、成纖維細胞、神經元等[1-3]。因此分析檢測人體內NADH水平具有非常重要的意義[4]。

拉曼光譜作為一種分子指紋分析技術，具有快速、準確、無損等優(yōu)點，而且可獲得物質物理化學及深層結構信息，已廣泛應用于生物醫(yī)學、物理、化學、材料、食品科學等領域[5-6]。密度泛函理論(DFT)是一種研究多電子體系結構的量子力學方法，在研究物質光譜方面得到了廣泛應用[7-8]。近年來，NADH無創(chuàng)在體檢測得到了越來越多關注[9-10]。運用激光拉曼光譜方法非常有希望實現NADH的快速準確無創(chuàng)在體檢測。但目前對NADH拉曼光譜的研究較為缺乏。本文運用激光拉曼散射實驗和DFT計算研究了200～3 300 cm-1光譜范圍內NADH分子的振動模式特性，討論了實驗觀察所得NADH拉曼光譜的分子振動模式歸屬，并分析了NADH分子中腺嘌呤、煙酰胺、及二核苷酸的特征振動模式。

1 實驗部分

實驗所用NADH樣品從阿拉丁生化科技有限公司購買。拉曼散射實驗采用賽默飛世爾科技有限公司的激光共焦顯微拉曼光譜儀，本實驗采用了532和785 nm兩種不同波長的激光進行測量，實驗條件相同，光譜采集波數范圍為200～3 200 cm-1，積分時間為10 s，積分次數為6次，激光功率為2 mW。

DFT計算采用常用的Becke交換泛函方法，同時結合Becke的三參數混合交換泛函并使用了Lee，Yang和Parr(B3LYP)的LYP相關泛函[11]。在幾何優(yōu)化和解析振動頻率計算中，采用了極化6-311+G(d,p)基組。量子力學計算使用了Gaussian09程序[12]。計算數據分析和拉曼光譜繪制采用了Multiwfn_3.4.1(dev)程序[13]，每個拉曼峰的線型選用洛倫茲曲線，峰半高寬選用4 cm-1。

2 結果與討論

圖1顯示了在200～3 200 cm-1光譜范圍內NADH在532和785 nm兩個不同波長激光激發(fā)下的拉曼光譜。NADH分子有兩個主要吸收峰，分別約為340和260 nm[9]。拉曼散射所用激光波長遠離NADH吸收峰。在非共振條件下，拉曼散射強度與激發(fā)光波長四次方成反比，因此532 nm比785 nm更容易觀察到NADH振動模式。圖1中可清楚地觀測到24個振動模式。NADH分子式為C21H29N7O14P2，分子結構如圖2所示，可分為煙酰胺、腺嘌呤、及二核苷酸三個部分，分別用N-藍色、A-紅色及D-黑色表示。由于NADH分子包含很多個原子且分子結構復雜，確定圖1中24個拉曼峰的分子振動模式并找到NADH分子的特征拉曼峰對未來運用拉曼光譜方法實現NADH的無創(chuàng)在體檢測具有非常重要的意義。本文運用DFT計算分析了圖1中24個拉曼峰的分子振動模式，并討論了NADH分子中腺嘌呤、煙酰胺、及二核苷酸的特征振動模式。

圖1 NADH在532和785 nm兩個不同波長激光激發(fā)下的拉曼光譜

圖2 NADH的分子結構

為了準確地分析NADH的分子振動模式和頻率，DFT計算中首先運用B3LYP/6-311+G(d,p)理論對NADH分子的基態(tài)結構進行了幾何優(yōu)化。優(yōu)化后的幾何結構為勢能表面的最低點，計算結果沒有產生虛頻。

為了使DFT計算結果與拉曼散射實驗結果很好的吻合，即計算所得振動模式波數與實驗觀測拉曼峰波數差別小而且有很好線性相關性，運用波數線性標度方法對所有計算所得振動模式波數重新進行了標度。波數線性標度方法中，考慮到DFT計算中非諧性，計算所得波數應乘以一個略小于1的比例因子，通常不同光譜范圍內比例因子會有小的差別。本文發(fā)現NADH分子在200～3 300 cm-1范圍內計算所得波數都可以用同一比例因子0.982 0很好的標度。該比例因子也和文獻常用比例因子0.961 3很接近[14]。重新標度后，計算所得振動模式波數與實驗觀測拉曼峰波數都吻合的很好，差別大部分小于5 cm-1，僅峰強存在一定差異。圖3(a)和(b)分別比較了200～1 800和1 800～3 300 cm-1光譜范圍內拉曼實驗和DFT計算的結果。圖4具體的比較了拉曼實驗觀測到的24個拉曼峰與DFT計算所得振動波數的關系。如圖4所示，在200～3 300 cm-1整個光譜范圍內拉曼實驗和DFT計算結果之間都具有很好的線性相關性，R2為0.999 81。

圖3 200～1 800 cm-1(a)和1 800～3 300 cm-1(b)光譜范圍內拉曼散射光譜和DFT計算光譜的比較

圖4 DFT計算波數與Raman實驗波數的線性擬合

表1詳細對比了拉曼散射實驗、DFT計算、及文獻中NADH分子的拉曼峰，并對圖1中所觀測到的24個拉曼峰所代表的振動模式對應的分子基團做了歸屬。為了便于分析，同時找到NADH分子的特征振動模式，從而用于拉曼光譜法實現NADH的快速準確無創(chuàng)在體檢測；NADH分子分為了三個部分，即腺嘌呤、煙酰胺和二核苷酸，分別標記為A、N和D，如圖2所示。根據NADH分子的三個部分，圖1中所觀測到的24個拉曼峰被分為了三組。NADH分子中三個部分的振動頻率與實際三個基團獨立存在時的振動頻率存在一些差異，這些差異是由于每個基團之間的相互作用造成了峰的偏移。

表1 實驗觀察和理論計算的NADH拉曼峰及它們的振動模式

NADH分子中腺嘌呤(A)是一個含氮雜環(huán)，其中包含多個碳氮雙鍵及一個氨基。圖1中位于531，732，1 309，1 339，1 374，1 507及3 073 cm-1等處的拉曼峰與腺嘌呤的振動模式相關。其中位于732 cm-1處的拉曼峰散射信號強度強，而且該峰在高頻和低頻方向受其他拉曼峰的干擾都較小。同時該峰不僅與腺嘌呤分子呼吸振動相關，還與腺嘌呤和二核苷酸的相互作用相關。因而位于732 cm-1處的拉曼峰可以選為NADH分子的一個最特征的振動模式，用來實現拉曼光譜法的NADH快速準確無創(chuàng)在體檢測。

NADH分子中二核苷酸(D)包含兩個核苷酸，其中有兩個五碳糖和兩個磷酸分子。圖1中位于324，876，916，1 086，1 339，1 457和3 073 cm-1等處的拉曼峰與二核苷酸的振動模式相關。其中位于1 086和1 339 cm-1兩處的拉曼峰散射信號強度強，1 086 cm-1處的拉曼峰與二核苷酸中磷酸分子的振動相關，1 339 cm-1處的拉曼峰與二核苷酸基團和腺嘌呤基團的相互作用相關。這兩個拉曼峰在高頻和低頻方向都受到其他拉曼峰的干擾，為了更準確的實現拉曼光譜法的NADH無創(chuàng)在體檢測，可以將1 086和1 339 cm-1兩處的拉曼峰作為一個組合特征振動模式。

運用拉曼光譜法檢測某種物質時，僅采用該物質的某一個特征的拉曼振動模式很難實現準確分析。為了運用拉曼光譜法實現NADH快速準確無創(chuàng)在體檢測，可以首先運用位于732 cm-1處NADH分子的最特征振動模式進行快速檢測，然后再運用位于1 690 cm-1及1 086和1 339 cm-1的組合等特征振動模式進行準確的分析。

3 結 論

研究了還原態(tài)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的激光拉曼散射實驗光譜和DFT理論計算光譜，對200～3 300 cm-1光譜范圍內的拉曼峰所對應的振動模式進行了初步的歸屬。實驗與計算結果符合得很好：大部分振動模式計算與實驗之間偏差都小于5 cm-1，而且在200～3 300 cm-1整個光譜范圍內，計算與實驗結果都有非常好的線性相關性，R2為0.999 81。同時本文分析了NADH分子中腺嘌呤、煙酰胺、及二核苷酸的特征振動模式，為未來運用激光拉曼光譜方法實現NADH的無創(chuàng)在體檢測提供了基礎。