彭嚴(yán)芳，王 君，吳志生，劉曉娜, 喬延江

1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430065 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029 3.濱州醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，山東 煙臺 264003

引 言

中藥過程質(zhì)量控制是保證中藥臨床用藥安全性和有效性的重要措施。如何提高中藥過程質(zhì)量控制水平，促進中藥現(xiàn)代化、國際化，是中藥發(fā)展需要解決的關(guān)鍵問題之一[1]。近紅外光譜(near infrared spectroscopy，NIR)作為一種快速無損，實時可靠的過程分析技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用在工業(yè)，農(nóng)業(yè)，食品，醫(yī)藥諸多領(lǐng)域[2-6]。然而，NIR吸收強度弱，光譜重疊嚴(yán)重，且NIR易受環(huán)境和樣品狀態(tài)等因素的影響[5]，使得NIR的應(yīng)用需借助化學(xué)計量學(xué)手段進行變量篩選?；瘜W(xué)計量學(xué)變量篩選方法以結(jié)果為導(dǎo)向，所選變量重現(xiàn)性和解釋性差。中藥成分復(fù)雜，如何從NIR中解析出與目標(biāo)分析物結(jié)構(gòu)相關(guān)的信息成為NIR在中藥過程質(zhì)量評價中需要解決的關(guān)鍵問題。二維相關(guān)分析(tow-dimensional correlation spectroscopy, 2D-COS)最早用于核磁共振譜中，后Noda提出廣義的二維相關(guān)譜，將外部擾動從聲、光、電拓展到濃度、溫度、pH值等，使2D-COS廣泛用于紫外-可見，紅外，近紅外，拉曼光譜中[7]。2D-COS同步譜中自相關(guān)峰表示被分析物隨外部擾動變化的特征譜帶，交叉峰則表示待分析物中關(guān)聯(lián)較大的官能團，二維相關(guān)同步譜截取對角線可得二維同步切片譜，從中可獲取與被分析物結(jié)構(gòu)相關(guān)的特征譜帶[8-9]。

丹參酮提取物為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根及根莖經(jīng)加工制成的提取物[10]。主要含脂溶性二帖類和水溶性丹酚酸。其藥理活性主要有抗凝血、抗血小板聚集、調(diào)血脂、抗炎、抗腫瘤[11]。目前對于丹參酮提取物的質(zhì)量控制主要是依靠高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)，如郭龍[12]等采用一測多評法測定丹參酮提取物中二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA 4種丹參酮類成分含量。2020版藥典中丹參酮提取物含量測定也采用HPLC法測定丹參酮ⅡA和隱丹參酮。HPLC法具有較好準(zhǔn)確性，但費時耗力，不利于中藥現(xiàn)代化生產(chǎn)中的質(zhì)量控制。本工作采用近紅外光譜，結(jié)合2D-COS解析丹參酮ⅡA和隱丹參酮近紅外光譜特征波段，并用于復(fù)雜體系丹參酮提取物近紅外偏最小二乘(partial least square，PLS)定量模型中，以快速測定丹參酮提取物中丹參酮ⅡA和隱丹參酮含量，提高變量篩選的重現(xiàn)性和解釋性。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

儀器：丹參酮ⅡA和隱丹參酮對照品采用XDS Rapid Liquid Analyzer近紅外光譜儀檢測(瑞士萬通，中國)。光譜采集方式：以透射模式采集光譜，以儀器內(nèi)部的空氣為背景，分辨率為0.6 nm，掃描范圍400～2 500 nm，每個樣品掃描32次，每個樣品平行測定3次，取平均光譜，二維相關(guān)分析軟件2Dshige(c)Shigeaki Morita, Kwansei-Gakuin University, 2004—2005。丹參酮提取物采用美國Thermo Nicolet公司的AntarisⅠ傅里葉變換近紅外光譜儀進行光譜采集，采用積分球漫反射方式，以儀器內(nèi)部空氣為背景，光譜分辨率為8 cm-1，在4 000～10 000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)進行掃描，每個樣品掃描32次，每個樣品重復(fù)測定三次，將三次測定光譜進行平均后用于后續(xù)分析。使用Unscrambler 9.7軟件進行數(shù)據(jù)處理。1100型高效液相色譜儀包括四元泵、真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器(DAD)和HP數(shù)據(jù)處理工作站(美國Agilent公司)。

材料：氘代氯仿購于美國劍橋CIL公司(純度99.8%，質(zhì)譜級，批號13H-456), 丹參酮ⅡA和隱丹參酮對照品購于中國食品藥品檢定研究院(批號110766-200619和110852-200806)，丹參酮提取物共50份，分別購于西安宏森生物科技有限公司、山西惠能達生物科技有限公司、山西安盛生物科技股份有限公司、西安昊軒生物科技有限公司、南京澤朗科技有限公司。甲醇(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，磷酸(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，乙腈(色譜純，德國默克公司)。

1.2 方法

分別取購買于不同廠家的丹參酮提取物約5 mg, 精密稱定，置10 mL量瓶中，加甲醇使溶解，并稀釋至刻度，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液得供試品溶液，共50份。以2015版藥典為參考，以HPLC測定丹參酮提取物中丹參酮ⅡA和隱丹參酮含量，乙腈為流動相A, 以0.026%磷酸溶液為流動相B，0～20 min內(nèi)流動相A濃度由0%增加到60%，20～50 min流動相A由60%增加到80%進行梯度洗脫，檢測波長為270 nm，柱溫為30 ℃，流速0.8 mL·min-1，進樣量10 μL，測得丹參酮ⅡA標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=44.77x-19.93(R2=0.999 9，n=11，濃度范圍為0.010 4～1.83 μg)，隱丹參酮標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=46.95x-2.506(R2=0.999 9，n=11，濃度范圍為0.007 32～0.427 μg)。

分別秤取丹參酮ⅡA和隱丹參酮對照品用氘代氯仿配制成如表1所示濃度。用于后續(xù)近紅外光譜的采集。

表1 丹參酮ⅡA和隱丹參酮的氘代氯仿溶液濃度分布

2 結(jié)果與討論

2.1 丹參酮ⅡA和隱丹參酮二維相關(guān)光譜分析

氘代氯仿及丹參酮ⅡA和隱丹參酮氘代氯仿溶液近紅外原始光譜如圖1所示，由于氘代氯仿自身的強吸收，使丹參酮ⅡA和隱丹參酮的特征吸收被掩蓋，無法從原始光譜中找出丹參酮ⅡA和隱丹參酮的特征吸收。

圖1 氘代氯仿、丹參酮ⅡA和隱丹參酮溶液近紅外原始光譜圖

采用2D-COS技術(shù)，獲取丹參酮ⅡA和隱丹參酮二維相關(guān)同步譜。氘代氯仿、丹參酮ⅡA和隱丹參酮二維相關(guān)同步譜截取對角線得二維同步切片譜如圖2(a,b)。由圖2可知，丹參酮ⅡA和隱丹參酮氘代氯仿溶液近紅外二維同步切片譜分別在1 600～1 800，1 900～2 230和2 300～2 400 nm這三個區(qū)域具有特征吸收。丹參酮ⅡA和隱丹參酮分子結(jié)構(gòu)如圖3所示，結(jié)合丹參酮ⅡA和隱丹參酮結(jié)構(gòu)式，同步切片譜中1 696 nm為甲基伸縮振動二級倍頻，1 726和1 740 nm處吸收為環(huán)己烯亞甲基伸縮振動二級倍頻，2 146和2 220 nm為苯環(huán)C—C伸縮振動與C—H伸縮振動的組合頻，2 300～2 400 nm處一系列峰為甲基伸縮振動與彎曲振動組合頻吸收。丹參酮ⅡA和隱丹參酮結(jié)構(gòu)差異主要在于丹參酮ⅡA分子五元環(huán)為呋喃環(huán)，而隱丹參酮分子中五元環(huán)為四氫呋喃環(huán)。丹參酮ⅡA在1 640和2 140 nm處有呋喃環(huán)雙鍵一級倍頻和組合頻吸收，此處吸收為不同于隱丹參酮的吸收特征，以上為丹參酮ⅡA和隱丹參酮特征波段歸屬[13]。

圖2 氘代氯仿、丹參酮ⅡA和隱丹參酮二維同步切片譜(a)和切片譜局部放大圖(b)

圖3 丹參酮ⅡA和隱丹參酮化學(xué)結(jié)構(gòu)式

2.2 丹參酮提取物近紅外定量分析模型的建立

2.2.1 光譜預(yù)處理方法篩選

采集所有不同批次丹參酮提取物粉末的近紅外光譜，采用K-S(kenston)樣本劃分方法，分別選取2/3為校正集，1/3為驗正集，用于建立丹參酮提取物NIR定量模型。丹參酮提取物粉末近紅外原始光譜如圖4所示，由圖4可知光譜基線漂移嚴(yán)重，吸收特征不明顯。平滑和歸一化可以消除由光程差異所帶來的光譜變動，平滑可以提高信噪比，導(dǎo)數(shù)法使重疊峰的分辨率提高，標(biāo)準(zhǔn)正則變換則可消除固體顆粒散射的影響?？疾炝瞬煌t外光譜預(yù)處理方法(包括原始光譜Raw, Savitzky-Golay平滑SG，基線校正Baseline，歸一化Normalize，標(biāo)準(zhǔn)正則變換SNV，一階導(dǎo)數(shù)加平滑SG 1st，二階導(dǎo)數(shù)加平滑SG 2nd)對PLS建模結(jié)果的影響。

圖4 丹參酮提取物近紅外原始光譜

結(jié)果如表2所示，經(jīng)歸一化處理后隱丹參酮PLS模型預(yù)測結(jié)果最好，交叉驗證均方根誤差(root mean of square error of cross validation，RMSECV)和預(yù)測均方根誤差(root mean of square error of prediction, RMSEP)最低，分別為0.004 1和0.001 8 g·g-1。經(jīng)二階導(dǎo)數(shù)加平滑(SG 2nd)處理后丹參酮ⅡA的PLS模型預(yù)測結(jié)果最好，RMSECV和RMSEP分別為0.005 5和0.002 0 g·g-1。

表2 丹參酮ⅡA和隱丹參酮不同預(yù)處理方法PLS模型預(yù)測結(jié)果(g·g-1)

2.2.2 2D-COS和SiPLS分別篩選特征波段建模比較

使用化學(xué)計量學(xué)手段篩選與特征指標(biāo)相關(guān)性最好的光譜信息用于定量模型的建立，可以提高模型的預(yù)測性能，刪除冗余變量。組合間隔偏最小二乘法(synergy interval partial least squares, SiPLS)將全譜劃分成不同間隔數(shù)的光譜子區(qū)間，將各個子區(qū)間按一定窗口大小進行組合，然后建立不同光譜子區(qū)間組合模式下的PLS模型，以RMSECV和RMSEP為評價指標(biāo)篩選最佳子區(qū)間的組合用于建模。比較了SiPLS波段篩選方法與2D-COS光譜解析方法建模結(jié)果，采用SiPLS進行波段篩選，分別考察了窗口數(shù)目為10，12，14，…，26，28，30，組合數(shù)為3時的丹參酮ⅡA和隱丹參酮PLS定量模型。

丹參酮ⅡA經(jīng)SiPLS變量篩選后，當(dāng)窗口數(shù)為10，選取第4，9和10號窗口進行組合，對應(yīng)波段如圖5(a)，波長為1 723～1 561和1 135～1 000 nm，潛變量數(shù)目為9時，PLS模型RMSECV和RMSEP最小，預(yù)測性能最好。隱丹參酮窗口數(shù)為10，選取第1，4和9號窗口進行組合，對應(yīng)波段如圖5(b)，波長為2 500～2 177，1 723～1 561和1 135～1 063 nm，潛變量數(shù)目為9時所建模型預(yù)測性能最好。2D-COS篩選波段丹參酮ⅡA和隱丹參酮 PLS模型預(yù)測性能與SiPLS篩選波段所建模型相當(dāng)，其中丹參酮ⅡA在1 600～1 800 nm建模預(yù)測性能最好，這與結(jié)構(gòu)中呋喃環(huán)特征吸收相關(guān)。2D-COS和SiPLS分別篩選特征波段建模結(jié)果如表3所示。

圖5 SiPLS篩選波段

表3 不同波段篩選方法PLS模型結(jié)果(g·g-1)

3 結(jié) 論

以氘代氯仿為溶劑，采用2D-COS解析了丹參酮ⅡA和隱丹參酮標(biāo)準(zhǔn)品的NIR光譜，兩樣品在1 600～1 800，1 900～2 230和2 300～2 400 nm有與濃度相關(guān)的特征吸收。丹參酮ⅡA在1 640和2 140 nm處有呋喃環(huán)中雙鍵一級倍頻和組合頻吸收。1 696 nm為丹參酮ⅡA和隱丹參酮分子中甲基伸縮振動二級倍頻，1 726和1 740 nm處吸收為丹參酮ⅡA和隱丹參酮環(huán)己烯亞甲基伸縮振動二級倍頻，2 146和2 220 nm為丹參酮ⅡA和隱丹參酮苯環(huán)C—C伸縮振動與C—H伸縮振動的組合頻，2 300～2 400 nm處一系列峰為丹參酮ⅡA和隱丹參酮甲基伸縮振動與彎曲振動組合頻吸收。采集丹參酮提取物近紅外光譜，考察復(fù)雜體系下，2D-COS解析特征波段與SiPLS篩選波段PLS建模結(jié)果，二者均具有良好的模型預(yù)測性能。2D-COS解析的特征波段與結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，其中1 600～1 800 nm處丹參酮ⅡA的PLS模型預(yù)測性能比SiPLS篩波段PLS模型更好，表現(xiàn)出與分子結(jié)構(gòu)相關(guān)的高度可解釋性。驗證了2D-COS這一光譜特征解析方法所得特征吸收峰在中藥復(fù)雜體系中NIR建模的適用性，且與化學(xué)計量學(xué)特征波段篩選相比，更具有解釋性和穩(wěn)定性，為近紅外特征波段的篩選提供了借鑒和指導(dǎo)。同時，對于丹參酮提取物中結(jié)構(gòu)相似化合物丹參酮ⅡA和隱丹參酮，2D-COS可解析出結(jié)構(gòu)差異特征吸收，一個波段可實現(xiàn)結(jié)構(gòu)類似物的同時定量測定，為中藥生產(chǎn)工業(yè)化中專業(yè)用途NIR儀器的制造提供了可行性論證，未來可以考慮將2D-COS用于NIR專業(yè)儀器制造光程的選取中。