黃建敏 云艷芳 楊桂新 陳海燕 蔣勇明 黃東旭 劉潔 莫曉榕 李雪斌

右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（廣西百色 533000）

急性缺血性腦卒中（acute ischemic stroke，AIS）具有高發(fā)病率、高致殘率和高病死率的特點，最近幾年已成為中國居民首位死亡原因，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢，給人類健康帶來沉重的負擔［1］。在時間窗內(nèi)，即使采用靜脈、動脈阿替普酶溶栓或血管內(nèi)機械血栓切除術等標準治療方案，但是仍有很多患者預后不良［2］。造成這種預后不良的關鍵因素之一是側支循環(huán)代償能力不足。因此，深入研究腦側支循環(huán)發(fā)生發(fā)展的病理生理機制對改善AIS 患者預后具有重要現(xiàn)實意義。研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細胞（vascular endothelial cells，VECs）不僅提供一個光滑細胞表面，還可分泌抗凝、抗血小板物質(zhì)和纖溶蛋白，防止血栓形成，同時分泌多種細胞因子調(diào)節(jié)血管緊張度，抑制血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）遷移和增殖，抑制中性粒細胞、單核細胞等炎癥細胞向血管壁黏附聚集，保護血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、保證血管通暢起重要作用［3-6］。但是，也有研究發(fā)現(xiàn)VECs 存在細胞活性低、生長及更新速度慢、分裂增殖慢和細胞容易凋亡等自身缺陷［7］，極大程度限制其臨床應用。生存素（Survivin）是由BIRC5 基因編碼，既能抑制細胞凋亡，又能調(diào)控細胞有絲分裂雙重功能的蛋白質(zhì)因子。在體內(nèi)和體外實驗中發(fā)現(xiàn)，Survivin 具有增強細胞活力和遷移能力、減少凋亡和刺激新生血管生成等多重功能［8］。動物研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細胞（vascular endothelial cells，VECs）內(nèi)的Survivin 缺乏可導致胚胎時血管生成、心臟發(fā)生和神經(jīng)管閉合等方面缺陷［9］?；A研究發(fā)現(xiàn)，大鼠VECs BIRC5 基因過表達在體內(nèi)可促進血管新生，有利于機體側支循環(huán)的建立［10］。MA 等［11］在類風濕性關節(jié)炎細胞模型中研究發(fā)現(xiàn)，Survivin 通過激活NOTCH 通路促進類風濕性關節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞增殖、提高血管生成相關蛋白表達和抑制細胞凋亡?？梢姡珺IRC5 基因及其表達Survivin可以克服VECs 自身缺陷，促進新生血管生成，在腦側支循環(huán)代償進程中可能起重要的調(diào)控作用。內(nèi)皮抑素（endostatin，ES）及血小板反應蛋白?1（thrombospondin?1，TSP?1）是兩種較強的內(nèi)源性血管新生抑制因子，而血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是最有效的促血管生成因子，他們之間相互作用、相互影響參與新生血管的形成，改善組織供血［12-14］，提示這種血管新生抑制因子和促血管生成因子的相互作用可能是腦側支循環(huán)發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)控機制之一。本實驗通過建立腦缺血大鼠模型，采用Survivin 抑制劑YM155 進行干預，檢測腦組織中微血管密度（microvessel density，MVD）和血管新生相關Survivin、VEGF、ES、TSP?1 基因及其蛋白表達的變化，探討Survivin、VEGF、ES、TSP?1 表達與血管新生的關系，為側支循環(huán)發(fā)生發(fā)展的病理生理機制以及AIS 側支循環(huán)治療新靶點的研發(fā)提供實驗基礎和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑 120 只健康SPF 級SD雄性大鼠購自江蘇艾凌菲生物科技公司（許可證號：SYXK（蘇）2019?0314），體質(zhì)量200 ～ 300 g，鼠齡10～12 周；尼龍線購自上海禾豐制藥有限公司；CD31 一抗（貨號：orb10314，濃度：1∶100）購自上海復申生物科技有限公司；DAB 試劑盒購自上?？道噬锟萍加邢薰?；cDNA 第一鏈合成試劑盒購自北京百奧萊博生物科技有限公司；Survivin（貨號：BK?K5040，濃度：1∶100）、VEGF（貨號：5363?100，濃度：1∶200）、ES（貨號：YM?x0547p，濃度：1∶300）、TSP?1（貨號：BK?K5541，濃度：1∶200）一抗購自上海恒遠生物科技有限公司；辣根過氧化物酶二抗購自上海李記生物科技有限公司；Survivin 抑制劑YM155 購自北京欣興唐生物科技有限公司；PCR儀、凝膠成像儀、BXM?950 光學顯微鏡及蛋白印跡設備購自美國Bio Rad 公司。

1.2 模型建立及分組處理 將120 只SD 雄性大鼠隨機分4 組（n= 30）：假手術組（Sham 組）、模型組（Model 組）、YM155 組（YM 組）和生理鹽水對照組（NS 組）。Model 組：參考文獻［15］以大腦中動脈線栓法建立腦缺血模型，大鼠麻醉后，取0.285 mm直徑的尼龍線，將大腦中動脈主干及其側支結扎阻斷血流2 h，制造MCA 局部缺血，在整個過程大腦前動脈及大腦后動脈血流完全沒有影響，隨后抽回尼龍線，大腦中動脈血流恢復后，完成大鼠大腦中動脈阻塞造模。Sham 組不做血管結扎或阻塞，其余操作同Model 組。造模后第1 天開始，YM組大鼠按6.5 mg/kg 劑量的YM155 充入Alzet 滲透式膠囊泵中，無菌條件下于大鼠腹部皮下切一1 cm 左右的縱行小口，將該泵與切口垂直方向植入大鼠腹部皮下，縫合切口。NS 組按YM 組方法將等量生理鹽水植入大鼠腹部皮下。本研究經(jīng)右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院倫理委員會批準，批準文號：YYFY?LL?2019?008。

1.3 檢測指標

1.3.1 免疫組化法檢測MVD 根據(jù)文獻［16］，通過測定CD31 陽性細胞表達確定大鼠腦組織MVD。各組大鼠給予相應處理后飼養(yǎng)2周，隨機選取10只大鼠行免疫組化檢測。方法：處死大鼠，取梗死側腦組織，40 g/L 多聚甲醛固定，石蠟包埋，5 μm 厚切片，脫蠟后，以梯度酒精（高到低）依次浸泡處理，然后以蒸餾水漂洗，加入0.3% H2O2，室溫孵育30 min，加入5% 血清，室溫孵育2 h，加入CD31 一抗，4 ℃孵育過夜，TBS 漂洗3 次，采用大鼠二步法免疫組化試劑盒及DAB 試劑盒做免疫組化染色，操作步驟參照說明書，然后以蒸餾水漂洗、梯度酒精脫水（低到高）、透明后封片，在光學顯微鏡下觀察半暗帶區(qū)并計數(shù)10 個高倍鏡視野（10×40）中的CD31 陽性細胞數(shù)，取均值即為該標本每高倍鏡視野中的陽性細胞數(shù)。

1.3.2 RT?PCR 檢測Survivin、VEGF、ES、TSP?1mRNA 的表達 各組大鼠給予相應處理后飼養(yǎng)2 周，隨機選取10 只大鼠行RT?PCR 檢測。取50～100 mg 梗死側新鮮大腦組織經(jīng)研磨后加入1 mL核酸提取劑，按trizol 試劑盒說明書提取總RNA，使用微量分光光度儀檢測RNA 純度和濃度，要求D（λ）260/D（λ）280 比值在1.8～2.0 之間。根據(jù)cDNA 第一鏈合成試劑盒說明，進行逆轉錄合成cDNA，利用熒光實時定量PCR 儀進行擴增，用PCR 試劑盒檢測Survivin、VEGF、ES、TSP?1 mRNA的表達水平。PCR 反應條件：95 ℃預變性15 min，94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72℃延伸30 s，40 個循環(huán)。以β?action 作為內(nèi)參照，引物序列：β?actin上游引物：5′?CCCATCTATGAGGGTTACGC?3′，下游 引 物：5′?TTTAATGTRCACGCAVGATTTC?3 ′；Survivin 上游引物：5′?TAAGCCACTTGTCCCAGCTT?3′，下游引物：5′?CTCATCCACTCCCTTCCTCA?3′；VEGF 上游引物：5′?TGCCCCTAATGCGGTGT?3′，下游引物：5′?TGCTGGCTTTGGTGAGGTT?3′；ES 上游引物：5′?：GCCCAATCAGCTTTCCATGT?3 ′，下游引物：5′?TGCATACCTGTGTGTTTGGC?3 ′；TSP?1 上游引物：5′?TGACCCTGGACTTGCTGTAG?3 ′，下游引物：5′?：CCAGCATAGTCGTCATCCCT?3 ′。采用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA 相對表達量。

1.3.3 免疫印跡法檢測Survivin、VEGF、ES、TSP?1蛋白表達 各組大鼠給予相應處理后飼養(yǎng)2 周，隨機選取10 只大鼠行免疫印跡檢測。取梗死側新鮮大腦組織，置于研缽中研碎，加入蛋白裂解液于冰浴中，采用勻漿機勻漿，取勻漿液，3 000 r/min 4 ℃離心20 min，取上清液，參照BCA 試劑盒說明，以其測定上清液中總蛋白濃度，根據(jù)結果調(diào)整各組蛋白濃度使之相同，煮沸變性后取20 μL 蛋白使用電泳儀SDS?PAGE 電泳，將蛋白轉移至聚偏氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）上，加入5%脫脂奶粉，室溫封閉2 h，分別以Survivin、VEGF、ES、TSP?1 一抗（1∶500）4 ℃孵育過夜，經(jīng)TBST 溶液漂洗3 次后，辣根過氧化物酶二抗（1∶1 000）室溫孵育2 h，TBST 再漂洗3 次，采用增強化學發(fā)光法顯色，用Image master VDS 成像系統(tǒng)攝影，圖像分析軟件（Total lab V101）行灰度掃描分析。以目的蛋白與GAPDH 蛋白產(chǎn)物條帶灰度的比值表示。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料表示為均數(shù)±標準差，組間比較行單因素方差分析，兩兩比較行LSD 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 YM155干預對MVD的影響 與Sham組比較，Model 組和NS 組CD31 免疫陽性MVD 顯著增高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與Model組比較，YM 組CD31 免疫陽性MVD 值顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表1、圖1。

表1 4 組大鼠缺血腦組織CD31 免疫陽性MVD 比較Tab.1 Comparison of CD31 positive MVD in ischemic brain tissue of rats among 4 groups ±s

表1 4 組大鼠缺血腦組織CD31 免疫陽性MVD 比較Tab.1 Comparison of CD31 positive MVD in ischemic brain tissue of rats among 4 groups ±s

注：與Sham 組比較，*P ＜0.01；與Model 組比較，#P ＜0.01

組別Sham 組Model 組YM 組NS 組例數(shù)10 10 10 10 MVD 8.9±3.14 15.5±3.66*9.5±2.27#14.7±2.41*

圖1 免疫組化觀察4 組大鼠缺血腦組織CD31 免疫陽性細胞表達（×400）Fig.1 Expression of CD31 positive cells in ischemic brain tissue of rats among 4 groups was observed by immunohistochemistry（×400）

2.2 YM155 干預對Survivin、VEGF、ES、TSP?1 mRNA 表達的影響 本研究采用RT?PCR 法檢測缺血腦組織YM155 干預前后Survivin、VEGF、ES、TSP?1 mRNA 表達，結果顯示，與Sham 組比較，Model 組和NS 組Survivin、VEGF mRNA 表達顯著增加，而ES、TSP?1 mRNA 表達顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與Model 組比較，YM 組Survivin、VEGF mRNA 表達顯著降低，而ES、TSP?1 mRNA 表達顯著增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠缺血腦組織Survivin、VEGF、ES、TSP?1 mRNA 表達比較Tab.2 Comparison of survivin，VEGF，ES and TSP?1 mRNA expression in ischemic brain tissue of rats among 4 groups ±s

表2 各組大鼠缺血腦組織Survivin、VEGF、ES、TSP?1 mRNA 表達比較Tab.2 Comparison of survivin，VEGF，ES and TSP?1 mRNA expression in ischemic brain tissue of rats among 4 groups ±s

注：與Sham 組比較，*P ＜0.01；與Model 組比較，#P ＜0.01

組別Sham 組Model 組YM 組NS 組Survivin 1.09±0.07 1.18±0.04*0.63±0.04#1.20±0.04*VEGF 1.19±0.03 1.25±0.02*0.66±0.04#1.28±0.05*ES 1.00±0.04 0.89±0.06*1.56±0.06#0.86±0.04*TSP?1 1.01±0.05 0.88±0.02*1.52±0.04#0.90±0.03*

2.3 YM155 干預對Survivin、VEGF、ES、TSP?1蛋白表達的影響 本研究采用免疫印跡法檢測缺血腦組織YM155 干預前后Survivin、VEGF、ES、TSP?1 蛋白表達，結果顯示，與Sham 組比較，Model組與NS 組Survivin、VEGF 蛋白表達顯著增加，而ES、TSP?1 蛋白表達顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與Model 組比較，YM 組Survivin、VEGF 蛋白表達顯著降低，而ES、TSP?1 蛋白表達顯著增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表3和圖2。

表3 各組大鼠缺血腦組織Survivin、VEGF、ES、TSP?1蛋白表達比較Tab.3 Comparison of survivin，VEGF，ES and TSP?1 protein expression in ischemic brain tissue of rats among 4 groups ±s

表3 各組大鼠缺血腦組織Survivin、VEGF、ES、TSP?1蛋白表達比較Tab.3 Comparison of survivin，VEGF，ES and TSP?1 protein expression in ischemic brain tissue of rats among 4 groups ±s

注：與Sham 組比較，*P ＜0.01；與Model 組比較，#P ＜0.01

組別Sham 組Model 組YM 組NS 組Survivin 2.72±0.14 2.87±0.18*1.54±0.10#2.85±0.13*VEGF 2.54±0.02 2.72±0.03*1.59±0.03#2.73±0.02*ES 1.03±0.14 0.88±0.03*1.60±0.26#0.85±0.03*TSP?1 1.03±0.03 0.85±0.02*1.58±0.03#0.83±0.03*

圖2 免疫印跡法觀察4 組大鼠缺血腦組織Survivin、VEGF、ES、TSP?1 蛋白表達Fig.2 Expressions of survivin,VEGF,ES and TSP?1 protein in ischemic brain tissue of rats among 4 groups were observed by Western blot

3 討論

腦側支循環(huán)是在顱內(nèi)動脈發(fā)生嚴重狹窄或閉塞時起代償作用的內(nèi)源性吻合通路，可將血液供應重新定向到缺血區(qū)，以維持血流灌注并可挽救缺血半暗帶神經(jīng)細胞功能，對腦梗塞患者預后具有重要的臨床意義［17-18］。臨床資料顯示，良好側支循環(huán)能夠縮小AIS 梗死灶體積、延長治療時間窗、提高患者治療獲益［19-20］。腦側支循環(huán)分三級，一級側支循環(huán)為Willis 環(huán)，二級側支循環(huán)為顱內(nèi)?顱外血管吻合支和顱內(nèi)動脈吻合支，三級側支循環(huán)是新生血管，當一級、二級側支循環(huán)供血不良時，成為挽救缺血腦細胞死亡的最后環(huán)節(jié)，是目前臨床研究腦側支循環(huán)的熱點。因此，深入研究腦側支循環(huán)發(fā)生發(fā)展的病理生理機制對AIS 患者創(chuàng)新性治療手段、改善預后具有重大現(xiàn)實意義。

VECs 是構成血管壁重要細胞，在促進新生血管生成、維持側支循環(huán)內(nèi)膜穩(wěn)定性、保證管腔長期通暢等方面起重要的調(diào)控作用［21-22］。然而，成熟VECs 活性低、生長緩慢、更新速度慢等缺陷限制了其功能發(fā)揮。Survivin 是凋亡抑制蛋白家族中分子量最小抗凋亡作用最強的蛋白分子。研究表明，其通過抑制細胞凋亡、調(diào)節(jié)細胞有絲分裂和使細胞適應不利環(huán)境來保護細胞，促進新生血管生成［8］。動物體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，BIRC5 基因轉染VECs后可以減少G1/M 期細胞合成，增加G2/M 期細胞含量，調(diào)控G1/S 蛋白，促進微血管生成，有助于機體側支循環(huán)的建立［10］。在小鼠模型中，將BIRC5基因轉染主動脈VECs 并培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)該細胞的細胞周期蛋白、Survivin mRNA 及其蛋白表達、細胞增殖顯著增加，同時發(fā)現(xiàn)細胞侵襲性和遷移活性顯著增強［23］。這些研究結果顯示BIRC5 基因及其表達Survivin 可以克服VECs 自身缺陷，促進新生血管生成，提示這一途徑在側支循環(huán)新生血管生成、內(nèi)膜穩(wěn)定性以及管腔血流通暢中可能起重要調(diào)節(jié)作用。

梗死后微血管新生是決定缺血性神經(jīng)元存活的關鍵因素，對促進神經(jīng)功能恢復、改善預后具有重要意義。在血管新生研究中，MVD 是普遍采用的能夠直觀和有效反映新生血管的數(shù)目和側支循環(huán)建立的指標。CD31 是表達于VECs 間緊密連接處的一種血小板?VECs 黏附分子，參與介導血管生成，可反映MVD 大小，因此可作為檢測MVD 的標記物［16］。本實驗結果一方面發(fā)現(xiàn)，Model 組和NS組的Survivn 和MVD 比Sham 組顯著增加，顯示腦梗塞急性期新生血管生成增多，其機制可能是腦梗塞急性期微血管新生自我保護的結果，這與國外學者GREGORIUS 等［24］報道相類似；另一方面發(fā)現(xiàn)，YM 組Survivin 和MVD 明顯低于Model 組，表明Survivin 抑制劑YM155 可以抑制腦梗死后的微血管新生，使新生血管生成減少，導致MVD 下降，因此，本實驗在動物體內(nèi)證實Survivin 參與新生血管生成。

VEGF 是具有促血管新生作用的細胞因子，能夠增加腦卒中病灶內(nèi)側支循環(huán)的數(shù)目并為神經(jīng)功能修復提供所需的養(yǎng)分，在微血管形成的中間環(huán)節(jié)具有重要調(diào)控作用。ES 是目前已知最強的內(nèi)源性血管新生抑制因子，腦缺血損傷后主要表達于海馬、側腦室周圍、紋狀體等區(qū)域。目前已廣泛證實ES 可特異性作用于VECs，抑制VECs 增殖和遷移及誘導其細胞凋亡，在抑制血管生成方面發(fā)揮著重要作用，其機制大致表現(xiàn)為ES 下調(diào)VEGF 表達，競爭性阻斷VEGF 信號傳遞并減少VEGF 受體數(shù)量和生物學活性，從而發(fā)揮抑制腦VECs 增殖作用［25］。TSP?1 可以抑制VEGF 下游信號轉導，對VEGF 受體2 加速降解，抑制VEGF 受體2 和eNOS磷酸化作用，導致血管新生受到阻礙；其次，抑制VEGF、bFGF 與其受體的結合，從而抑制VECs 增生［26］。本實驗結果發(fā)現(xiàn)，促血管生成因子Survivin、VEGF mRNA 及其蛋白表達水平在Model 組和NS組顯著高于Sham 組，而在YM 組中表達明顯低于Model 組，與MVD 高表達呈現(xiàn)一致結果；血管新生抑制因子ES、TSP?1mRNA 及其蛋白表達水平在Model 組均低于Sham 組，而在YM 組中表達明顯高于Model 組，與MVD 高表達呈現(xiàn)相反的結果，提示新生血管生成與促血管生成因子Survivin、VEGF上調(diào)和新生血管抑制因子ES、TSP?1 下調(diào)有關，它們之間可能存在密切的相互作用、相互影響，參與腦側支循環(huán)建立和形成。

綜上所述，本實驗結果發(fā)現(xiàn)Survivin 抑制劑YM155 可以下調(diào)Survivin、VEGF 表達和上調(diào)ES、TSP?1 表達，進而降低MVD，提示這些因子之間相互作用、相互影響可能是腦側支循環(huán)建立和形成的重要機制之一。但是本研究還具有一定的局限性，僅僅從負性調(diào)控機制進行研究以及觀察某個特定時間點的變化，對于正性調(diào)控機制和時空模式變化規(guī)律需要進一步深入研究。