石建存，李繼開，賈 琳，呂建存，商子涵，張 鐵，王春光

(1.石家莊市欒城區(qū)職業(yè)技術(shù)教育中心，石家莊 051430；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，保定 071000；3.石家莊市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法支隊(duì)，石家莊 050025)

應(yīng)用新型微生物技術(shù)開發(fā)中藥已經(jīng)成為養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的必然趨勢(shì)。中藥作為天然植物經(jīng)微生物發(fā)酵后會(huì)提高藥效、降低毒性、產(chǎn)生新成分，可作為綠色飼料添加劑更好地替代抗生素[1]。中藥因其來(lái)源于天然物質(zhì)、毒副作用低、不良反應(yīng)小等深受國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[2-3]，其含有眾多對(duì)動(dòng)物的生產(chǎn)和免疫力有著廣泛影響的活性成分[4]。益生菌含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可以在腸道內(nèi)通過(guò)和致病菌互作來(lái)抵御致病菌對(duì)腸道黏膜的黏附，調(diào)節(jié)菌群平衡，影響?zhàn)つっ庖?。此外，益生菌的代謝產(chǎn)物可以增加腸道的屏障功能，抑制炎癥反應(yīng)及調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)維持和改善健康以及降低某些疾病的風(fēng)險(xiǎn)。微生物發(fā)酵中藥將兩者有機(jī)結(jié)合起來(lái)，通過(guò)益生菌的代謝產(chǎn)物和酶解作用使中藥活性成分大大增加[5]。中藥經(jīng)過(guò)發(fā)酵后可改變理化特性，進(jìn)而提高適口性和消化利用率，在提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能、增強(qiáng)免疫力、改善肉質(zhì)水平等方面都取得良好的效果。李宗杰[6]用多種益生菌發(fā)酵混合中藥粉劑，采用飲水方式飼喂肉雞，結(jié)果表明發(fā)酵中藥能明顯提高肉雞的生長(zhǎng)性能和免疫指標(biāo)。近年來(lái)，傳統(tǒng)中藥作為免疫增強(qiáng)劑往往單獨(dú)應(yīng)用于畜禽，且中藥經(jīng)過(guò)發(fā)酵后的效果優(yōu)于純中藥。李欣澤等[7]在肉雞飼糧中添加純中藥與發(fā)酵中藥后，結(jié)果顯示，肉雞的平均日采食量均有所提高，料重比均有所降低，其中發(fā)酵中藥組檢測(cè)指標(biāo)均優(yōu)于中藥組?，F(xiàn)有研究主要集中于單菌對(duì)中藥進(jìn)行發(fā)酵，其作用效果不能最大限度地發(fā)揮出來(lái)，且與單一菌株發(fā)酵相比，雙菌混合發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生更好的發(fā)酵性能。因此，本試驗(yàn)選用具有增強(qiáng)免疫力、提高生產(chǎn)性能的植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌對(duì)黃芪、絞股藍(lán)、馬齒莧組成的中藥組方進(jìn)行混菌發(fā)酵，并按一定比例添加在雞飼料中，觀察其對(duì)雞的生長(zhǎng)性能、抗體水平和腸道菌群的影響，以期為禁抗后雞的高效、綠色、天然、無(wú)殘留的飼料添加劑研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1日齡科寶蛋雞公雛購(gòu)自大午集團(tuán)有限公司；植物乳桿菌購(gòu)自廣東省微生物菌種保藏中心；枯草芽孢桿菌購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；黃芪、絞股藍(lán)、馬齒莧均購(gòu)自河北安國(guó)藥材市場(chǎng)；黃芪多糖購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；雞新城疫活疫苗La Sota株購(gòu)自瑞普生物藥業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)菌種的活化與平板計(jì)數(shù) 將植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌分別于相應(yīng)的固體培養(yǎng)基平板上劃線接種，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種于裝有5 mL相應(yīng)液體培養(yǎng)基的試管中，植物乳桿菌培養(yǎng)溫度為37 ℃，靜態(tài)培養(yǎng)；枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)溫度為37 ℃，在150 r/min搖床上進(jìn)行培養(yǎng)。 將培養(yǎng)菌液分別吸取100 μL接入5 mL相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，獲得發(fā)酵用種子液，4 ℃?zhèn)溆谩?經(jīng)平板計(jì)數(shù)，植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌的菌落總數(shù)分別為1.5×108和2.0×108CFU/mL。

1.2.2 復(fù)方中藥液的制備 分別取黃芪、絞股藍(lán)、馬齒莧3種中藥經(jīng)過(guò)超微粉碎后，過(guò)300目篩，制備發(fā)酵中藥培養(yǎng)基：復(fù)方中藥粉(3種中藥粉按1∶1∶1混合)10 g、過(guò)60目篩黑豆粉(提供氮源)3 g、葡萄糖(提供碳源)2 g、100 mL蒸餾水，滅菌備用。

1.2.3 發(fā)酵中藥的制備 取制備好的復(fù)方中藥液置于發(fā)酵罐中，加入植物乳桿菌與枯草芽孢桿菌發(fā)酵種子液，以中藥發(fā)酵液中粗多糖得率(苯酚-硫酸法測(cè)定)為指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)確定發(fā)酵工藝參數(shù)：接菌比例2∶1、接種量4%、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時(shí)間48 h，按此工藝制備發(fā)酵中藥液。

1.2.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將84只1日齡試驗(yàn)雞預(yù)飼13 d，14日齡開始正式試驗(yàn)，試驗(yàn)雞隨機(jī)分為7組，每組單籠飼養(yǎng)，每籠12只，分別為空白對(duì)照組(A組)，復(fù)方中藥組(B組)，發(fā)酵中藥低劑量組(C組)、中劑量組(D組)、高劑量組(E組)，發(fā)酵菌液組(F組)，對(duì)照藥物黃芪多糖組(G組)。試驗(yàn)期間，雞自由采食與飲水，記錄每日給料量和剩料量。試驗(yàn)第1(14日齡)、14(28日齡)、28(42日齡)天清晨空腹稱重，計(jì)算各階段平均日增重(average daily gain，ADG)、平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)及料重比(feed to gain ratio,F/G)。用雞新城疫活疫苗La Sota株進(jìn)行免疫，試驗(yàn)第7、14、21、28天翅下靜脈采血，用于抗體效價(jià)檢測(cè)。動(dòng)物分組及給藥劑量詳情見表1，按設(shè)計(jì)的給藥劑量添加于飼糧中進(jìn)行攪拌混飼。

表1 動(dòng)物分組及給藥劑量

續(xù)表

1.2.5 血清抗體效價(jià)檢測(cè) 用血凝和血凝抑制(HA-HI)試驗(yàn)檢測(cè)雞血清NDV抗體效價(jià)，通過(guò)HA試驗(yàn)測(cè)定出4單位抗原，檢測(cè)各樣本的抗體效價(jià)，其血清抗體效價(jià)采用log2表示[8]。

1.2.6 腸道菌群的檢測(cè) 試驗(yàn)結(jié)束后選取同等給藥劑量的空白對(duì)照組、復(fù)方中藥組、發(fā)酵中藥中劑量組、發(fā)酵菌液組及對(duì)照藥物黃芪多糖組，每組無(wú)菌采取5只雞的盲腸內(nèi)容物，編號(hào)后放入10 mL離心管，立即放入液氮中保存，采樣結(jié)束后-80 ℃保存，送上海派森諾公司進(jìn)行腸道菌群測(cè)序(16S rDNA高通量測(cè)序)。為了能較為全面地評(píng)估微生物群落的Alpha多樣性，本流程以Chao1和Observed species指數(shù)來(lái)度量每個(gè)樣品中物種的菌群相對(duì)豐度，以Shannon和Simpson指數(shù)來(lái)度量每個(gè)樣品中物種的菌群多樣性。應(yīng)用mother軟件分析每個(gè)樣品在OTU列表中的物種豐度，統(tǒng)計(jì)和分析各組的生物多樣性指數(shù)。通過(guò)QIIME軟件對(duì)各樣本進(jìn)行物種分類學(xué)組成分析，主要目的是統(tǒng)計(jì)每組中各個(gè)樣品具體的菌群結(jié)構(gòu)。通過(guò)統(tǒng)計(jì)物種分類學(xué)組成分析表，繪制各樣本在門、綱、目、科、屬、種等分類水平上的組成分布柱狀圖。將OTU數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)處理后繪制物種聚類熱圖，可通過(guò)物種聚類熱圖的不同顏色來(lái)表示表格中的數(shù)據(jù)信息，更加直觀地展示腸道微生物菌群在種類和數(shù)量上的差異。每個(gè)樣品的物種豐度由熱圖上相對(duì)應(yīng)的色塊來(lái)代表，每個(gè)樣品在群落組成的相似性和差異性通過(guò)顏色深度的變化來(lái)反映。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì) 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 21.0軟件處理分析。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示，采用Excel統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)繪圖。采用One-Way ANOVA進(jìn)行方差分析，再通過(guò)Duncan氏法進(jìn)行多重比較，P<0.05表示差異顯著；以P<0.01表示差異極顯著；P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 發(fā)酵中藥對(duì)雞生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知，試驗(yàn)第1～14天，D、E組雞的ADFI均極顯著高于A、F、G組(P<0.01)；C、D、E組的ADG均有所升高，其中E組的ADG極顯著高于A、F組(P<0.01)，顯著高于B、G組(P<0.05)，D組的ADG顯著高于A、F組(P<0.05)；F、G組的F/G最低，極顯著低于其他各組(P<0.01)，且B組的F/G顯著高于A、C、E組(P<0.05)。試驗(yàn)第15～28天，C、E組的ADFI均顯著高于B、F組(P<0.05)；B組的ADG極顯著高于其他各組(P<0.01)，E組的ADG顯著高于A組(P<0.05)；B組的F/G極顯著低于其他各組，D、E、F、G組極顯著低于A組(P<0.01)。

2.2 發(fā)酵中藥對(duì)雞血清抗體效價(jià)的影響

由表3可知，試驗(yàn)第7天，各組雞血清抗體效價(jià)均無(wú)顯著差異(P>0.05)；試驗(yàn)第14天，各組雞血清抗體效價(jià)達(dá)到試驗(yàn)全期的峰值，且E組顯著高于A、F、G組(P<0.05)；試驗(yàn)第21、28天，E組雞血清抗體效價(jià)高于其他各組，且顯著高于A組(P<0.05)。表明發(fā)酵中藥高劑量能顯著提高雞血清中新城疫的抗體滴度。

表2 試驗(yàn)各階段雞的生長(zhǎng)性能

表3 各組雞血清抗體效價(jià)(log2)

2.3 發(fā)酵中藥對(duì)雞腸道菌群的影響

2.3.1 盲腸微生物Alpha多樣性分析 由表4可知，D組的Chao1和Observed species指數(shù)最高，說(shuō)明其菌群相對(duì)豐富度最高，但與其他組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表4 各組雞盲腸腸道Alpha多樣性系數(shù)

2.3.2 盲腸物種分類學(xué)組成分析

2.3.2.1 門水平分類學(xué)組成 圖1中主要體現(xiàn)相對(duì)豐度比例排在前10的菌門，其他所有菌門在圖中用Others來(lái)表示，其中相對(duì)豐度較大的菌門主要包括厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、柔壁菌門(Tenericutes)和藍(lán)藻門(Cynaobacteria)等，每組樣品中厚壁菌門和擬桿菌門的相對(duì)豐度比例最高，占總微生物量的98%以上，屬于雞腸道內(nèi)最常見的細(xì)菌類群。5個(gè)組別樣品中厚壁菌門和擬桿菌門的相對(duì)豐度見表5。由表5可知，A組的厚壁菌門相對(duì)豐度最高，顯著高于D和G組(P<0.05)；擬桿菌門相對(duì)豐度最低，顯著低于D和G組(P<0.05)。門水平上各組物種豐度聚類熱圖見圖2，其中厚壁菌門占比較高。

圖1 門水平上各組物種分布圖Fig.1 The distribution of species in each group at the phylum level

表5 各組厚壁菌門和擬桿菌門的豐度比例

圖2 門水平上各組物種豐度聚類熱圖Fig.2 Clustering heat map of species abundance in each group at the phylum level

2.3.2.2 屬水平分類學(xué)組成 由圖3可知，各組的主要菌有糞便菌屬(Faecalibacterium)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、顫螺菌屬(Oscillospira)、擬桿菌屬(Bacteroides)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、勞特氏菌(Blautia)、巴恩斯氏菌屬(Barnesiella)及丁酸桿菌屬(Butyricicoccus)等，其中巴恩斯氏菌屬(Barnesiella)為G組盲腸所特有，且占比較高。各組前5種菌屬的相對(duì)豐度見表6。由表6可知，各組糞便菌屬、乳桿菌屬、顫螺菌屬和瘤胃球菌屬均無(wú)顯著差異(P>0.05)，其中D組擬桿菌屬的相對(duì)豐度顯著高于A和F組(P<0.05)。屬水平上各組物種豐度聚類熱圖見圖4，其中巴恩斯氏菌屬占比較大。

圖3 屬水平上各組物種分布圖Fig.3 Distribution of species in each group at the genus level

表6 各組樣品中菌屬的豐度比例

圖4 屬水平上各組物種豐度聚類熱圖Fig.4 Cluster heat map of species abundance of each group at the genus level

3 討 論

3.1 發(fā)酵中藥對(duì)雞生長(zhǎng)性能的影響

生長(zhǎng)性能是衡量發(fā)酵中藥在雞上應(yīng)用是否有效的最重要指標(biāo)，中草藥在動(dòng)物機(jī)體代謝過(guò)程中會(huì)提供豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。本試驗(yàn)選用的發(fā)酵菌是植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌，具有益生作用，可促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)[9]。所用中藥黃芪性味甘，補(bǔ)肺健脾，具有補(bǔ)氣消腫之功效；絞股藍(lán)具有補(bǔ)益元?dú)?、生津健脾、平喘等功效；馬齒莧味酸、性寒，主治熱痢膿血，具有解毒消炎的功效[10-12]。這些中藥經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵后可促進(jìn)藥材細(xì)胞壁的裂解，提高多糖含量，而中藥多糖能促進(jìn)腸道消化分泌物及微生物的產(chǎn)生，增強(qiáng)免疫，從而達(dá)到提高禽類生長(zhǎng)性能的目的[13-15]。李萌等[16]研究表明，將用微生態(tài)制劑配制的發(fā)酵中藥飼料飼喂雞，其平均日增重顯著提高。汪鵬[17]以枯草芽孢桿菌對(duì)健雞散進(jìn)行發(fā)酵后應(yīng)用于白羽肉雞，結(jié)果顯示對(duì)其采食量有很好的促進(jìn)效果。本試驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，在雞飼糧中添加發(fā)酵中藥可提高適口性，進(jìn)而提高雞的采食量和日增重。由此可見，發(fā)酵中藥可提高雞的生長(zhǎng)性能。

3.2 發(fā)酵中藥對(duì)雞抗體效價(jià)的影響

抗體效價(jià)的高低水平是衡量機(jī)體體液免疫功能的重要指標(biāo)，決定雞群的抵抗力及感染程度。中藥多糖具有促進(jìn)抗體產(chǎn)生、增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)等重要作用[18]。抗體是由效應(yīng)B細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)，主要通過(guò)抗體的分泌來(lái)參與機(jī)體的免疫反應(yīng)，抗體效價(jià)水平可反映免疫能力的高低及體液免疫的狀態(tài)。溫建新等[19]研究表明，將2株乳酸桿菌以不同劑量灌服雛雞，再進(jìn)行新城疫免疫后，各組抗體水平均顯著或極顯著高于對(duì)照組，對(duì)雛雞免疫機(jī)能有促進(jìn)作用。張進(jìn)隆等[20]研究表明，在雞飼糧中添加不同劑量復(fù)方中藥，能明顯提高抗雞新城疫抗體水平，且特異性抗體水平的高低與復(fù)方中藥的添加劑量呈正相關(guān)，本試驗(yàn)結(jié)果與其一致，在發(fā)酵中藥3個(gè)劑量組之間，抗體水平隨著劑量的增加而提升。本研究中，試驗(yàn)第7天，各組雞血清抗體水平差異不顯著，其原因可能是各組還沒有產(chǎn)生相應(yīng)的抗體和藥效；試驗(yàn)第14、21、28天，發(fā)酵中藥高劑量組雞血清抗體效價(jià)高于其他組，顯著高于空白對(duì)照組。發(fā)酵中藥在不同試驗(yàn)中應(yīng)用效果并不一致，其原因可能與發(fā)酵菌種、活菌數(shù)量和發(fā)酵工藝等有關(guān)。

3.3 發(fā)酵中藥對(duì)雞腸道菌群的影響

機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收主要是在胃腸道中進(jìn)行，且腸道對(duì)入侵的致病菌有一定的防御功能。腸道菌群是促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素，其代謝活性受多種外界因素的影響，雞腸道內(nèi)各種微生物菌群影響著宿主的多項(xiàng)生理機(jī)能[21-22]。在雞消化道內(nèi)，由于胃腸液的沖刷作用使得機(jī)體的前端腸段微生物數(shù)量較少，而盲腸腸段的封閉性環(huán)境能夠更長(zhǎng)時(shí)間地儲(chǔ)存內(nèi)容物[23]，其內(nèi)部的微生物菌群豐富程度較高。機(jī)體的免疫系統(tǒng)能通過(guò)腸道中的大量細(xì)菌進(jìn)行調(diào)控。研究表明，添加益生菌會(huì)使生物體腸道微生物多樣性增高，通過(guò)改善機(jī)體腸道菌群組成以減少腸道疾病[24]。厚壁菌門和擬桿菌門是禽類盲腸中最具優(yōu)勢(shì)的菌群，其主要在宿主營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收和機(jī)體生理學(xué)中起到非常重要的作用[25]，本試驗(yàn)中，各組所有樣本的厚壁菌門和擬桿菌門相對(duì)豐度比例最高，占總微生物量的98%以上。厚壁菌門類菌群能夠促進(jìn)腸道內(nèi)的多糖發(fā)酵[26]，擬桿菌門類菌群主要參與機(jī)體的多種重要代謝活動(dòng)，促進(jìn)機(jī)體對(duì)脂類、蛋白、多糖等物質(zhì)的消化吸收。本試驗(yàn)運(yùn)用高通量測(cè)序方法檢測(cè)雞盲腸中門水平與屬水平上微生物分布情況，結(jié)果顯示，發(fā)酵中藥提高了雞盲腸中的群落豐富度，顯著提高了雞盲腸中擬桿菌門和擬桿菌屬的相對(duì)豐度。因此，將發(fā)酵中藥應(yīng)用于雞，能夠調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，給機(jī)體帶來(lái)積極影響。

4 結(jié) 論

在本試驗(yàn)條件下，中、高劑量發(fā)酵中藥可提高雞的平均日采食量和平均日增重，降低料重比；高劑量發(fā)酵中藥可顯著提高血清中新城疫抗體效價(jià)，且發(fā)酵中藥在一定程度上能夠增加雞盲腸中菌群的物種多樣性。