任 杰，林 泠，湯德元，曾智勇，王 彬，禹光美，鄭如雯，吳道義，黃 濤

(1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025；2.畢節(jié)市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，畢節(jié) 551700)

牛病毒性腹瀉(bovine viral diarrhea，BVD)是由牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)感染引起的牛的一種病毒性傳染病，于1946年在紐約首次發(fā)現(xiàn)[1]。現(xiàn)代養(yǎng)牛業(yè)的集約化、規(guī)?；B(yǎng)殖及新品種的引進(jìn)導(dǎo)致該病的發(fā)病率逐漸增加，目前該病已廣泛流行于全世界。據(jù)統(tǒng)計，發(fā)生該病的動物病死率可高達(dá)35%，給養(yǎng)牛業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。當(dāng)前防控該病最有效的措施仍是疫苗免疫，而在售的商品疫苗主要有減毒疫苗和滅活疫苗，由于傳統(tǒng)疫苗的局限性導(dǎo)致該病免疫失敗率較高，結(jié)果尚不理想，使研究針對該病新的高效疫苗成為了當(dāng)前亟需解決的問題[4]。

研究表明，腺病毒載體疫苗可攜帶具有保護(hù)性抗原的基因，使相應(yīng)宿主產(chǎn)生特異的免疫反應(yīng)，但又不整合到宿主基因、無需佐劑，并能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液及細(xì)胞免疫反應(yīng)[5-7]，為BVDV基因工程疫苗的研究指引了一個新的方向。1999年，Elahi等[8]利用BVDV C蛋白基因構(gòu)建重組腺病毒，將其免疫小鼠后能產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，但后續(xù)并未對C蛋白基因做進(jìn)一步深入研究，國內(nèi)也鮮見BVDV腺病毒載體疫苗相關(guān)報道。E0、E2基因是BVDV的囊膜糖蛋白和保護(hù)性抗原控制基因，其中E0基因具有高度保守性，在病毒正常生理活性方面發(fā)揮重要作用，而E2基因則具有保守的糖基化位點，是BVDV的主要保護(hù)性抗原蛋白和主要抗原區(qū)域與宿主細(xì)胞識別、吸附的重要部位[7-8]。與C蛋白相比，BVDV E0和E2蛋白研究更深入，且良好的抗原性也得到眾多學(xué)者的認(rèn)可[9-10]。本研究結(jié)合腺病毒載體疫苗的優(yōu)勢及E0和E2蛋白良好的抗原性及高度保守性，以人腺病毒5型為載體將BVDVE0及E2基因融合后構(gòu)建重組腺病毒Ad5-E0-E2，并對其免疫效果進(jìn)行綜合評估，旨在為BVDV的疫苗研制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞及菌株 BVDVE0、E2基因克隆質(zhì)粒均由貴州大學(xué)臨床獸醫(yī)學(xué)實驗室保存；人5型腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC316-mCMV-EGFP、AdMax腺病毒系統(tǒng)均購自北京擎科生物科技有限公司；低代次人胚腎細(xì)胞系HEK293T細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司；大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.2 試驗動物 6～8周齡SPF級體重18～20 g健康昆明小鼠各40只，雌雄各半(動物合格證書：No.110324210102606873),購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司。文中所涉及的動物試驗研究均已通過貴州大學(xué)實驗動物倫理與福利委員會審查。

1.1.3 主要試劑 牛血清白蛋白 BSA-Ⅴ、Tris、十二烷基硫酸鈉、甘氨酸、PVDF膜(0.45 μm、0.22 μm)25*15 cm均購自北京索萊寶科技有限公司；Hind Ⅲ、SalⅠ核酸內(nèi)切酶均購自TaKaRa公司；牛BVDV陽性血清、辣根過氧化物酶(HRP)、山羊抗牛IgG (H+L)二抗，細(xì)胞培養(yǎng)板96孔標(biāo)準(zhǔn)型、T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BVDV抗體檢測試劑盒購自IDEXX公司；Anti-Mouse CD3ε、Anti-Mouse CD4、Anti-Mouse CD8α流式抗體均購自聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的擴(kuò)增 根據(jù)BVDVE0(GenBank登錄號：EU709763)和BVDVE2(GenBank登錄號：KX170165)基因序列設(shè)計擴(kuò)增引物，其中BVDV E0-F、BVDV E2-R分別加入SalⅠ和HindⅢ酶切位點，引物序列見表1。引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。以BVDVE0、E2基因組為模板,PCR擴(kuò)增相應(yīng)目的片段。PCR反應(yīng)體系25 μL：2×PfuMasterMix(Dye) 12.5 μL，基因組模板2.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 9 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，膠回收PCR產(chǎn)物。

表1 引物信息

1.2.2 重組穿梭載體構(gòu)建與驗證 以回收的E0、E2基因片段為模板，用引物E0-F和E2-R進(jìn)行重疊延伸PCR，擴(kuò)增反應(yīng)條件同1.2.1，E0-E2融合基因片段預(yù)期擴(kuò)增大小為1 819 bp。PCR產(chǎn)物回收后使用Hind Ⅲ、SalⅠ對E0-E2融合基因與pDC316-mCMV-EGFP進(jìn)行雙酶切后回收，運用T4 DNA連接酶將回收的E0-E2融合基因片段和pDC316-mCMV-EGFP載體線性化片段連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)后，挑取陽性菌落轉(zhuǎn)液體培養(yǎng)，后期提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切及測序進(jìn)行鑒定。 將鑒定成功的穿梭質(zhì)粒命名為pDC316-E0-E2。

1.2.3 重組腺病毒包裝 將穿梭質(zhì)粒pDC316-E0-E2與AdMax腺病毒系統(tǒng)的骨架質(zhì)粒pBHGlox(delta)E1，3Cre混勻后共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，并于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長形態(tài)直至出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，待一半細(xì)胞出現(xiàn)CPE后收存于2 mL凍存管中。-80和37 ℃水浴反復(fù)凍融3次，每次10 min,渦旋1 min，釋放出腺病毒顆粒。4 ℃、12 000×g離心5 min，0.22 μm過濾收獲上清液，驗證腺病毒的包裝。將獲得的重組腺病毒命名為Ad5-E0-E2。

1.2.4 重組腺病毒Ad5-E0-E2表達(dá)鑒定 用重組腺病毒Ad5-E0-E2感染HEK293T細(xì)胞，待細(xì)胞產(chǎn)生大量CPE時收集細(xì)胞，使用裂解液使其裂解釋放腺病毒。取上清液進(jìn)行12% SDS-PAGE，分離蛋白。經(jīng)轉(zhuǎn)膜后用TBST配制好的5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，取膜用TBST洗滌3次,10 min/次；1∶1 000稀釋的牛BVDV陽性血清作為一抗，4 ℃孵育過夜。取膜用TBST配制好的HRP標(biāo)記的山羊抗牛IgG按1∶1 000稀釋后作二抗，37 ℃孵育2 h。用ECL發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色曝光并拍照。

1.2.5 腺病毒滴度的測定 將純化后的病毒液進(jìn)行10倍倍比稀釋，接種于96孔板中已培養(yǎng)至致密單層HEK293T細(xì)胞上，按照Reed-Muench法測定所分離病毒的滴度。

1.2.6 牛病毒性腹瀉E0-E2基因重組腺病毒免疫原性評價 選取40只6～8周齡小鼠作為評價模型，分為4組，肌內(nèi)注射、皮下注射PBS對照組和肌內(nèi)注射、皮下注射Ad5-E0-E2試驗組，記作1、2、3、4組,隔離飼養(yǎng)，每組10只，雌雄各半；按照表2免疫程序進(jìn)行免疫，首免后7 d后進(jìn)行二免，二免后7 d進(jìn)行免疫原性檢測。

1.2.7 BVDV抗體檢測 待小鼠二免后7 d尾尖采血離心收集血清，采用BVDV抗體檢測試劑盒按照使用說明書檢測小鼠血清抗體水平。經(jīng)酶標(biāo)儀測定樣品D450 nm值并計算S/P值。S/P>0.30判定為陽性，S/P<0.20判定為陰性。

1.2.8 T淋巴細(xì)胞亞群檢測 小鼠經(jīng)過首免和二免后尾尖采血收集于抗凝管中，按流式細(xì)胞儀使用步驟上機(jī)檢測。比較分析重組腺病毒首免和二免小鼠后CD4+、CD8+含量及 CD4+/CD8+變化，分別于首免、二免后1周對小鼠尾尖采血于EDTA抗凝管中。運用反向加樣法將50 μL抗凝全血加入流式試管中混勻。 取20 μL CD3+、CD4+、CD8+抗體加入試管中旋渦混勻，置于室溫避光放置20 min。加入450 μL 1*FACS溶血素混勻室溫放置10 min。再通過流式細(xì)胞儀檢測CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群。

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析。P<0.01表示差異極顯著。

表2 小鼠免疫程序

2 結(jié) 果

2.1 目的基因擴(kuò)增結(jié)果

以 BVDVE0、E2基因組為模板擴(kuò)增BVDVE0、E2基因，PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果顯示，分別在約681及1 122 bp處出現(xiàn)2條目的條帶(圖1)，與預(yù)期相符。以E0、E2基因為模板，使用引物E0-F及E2-R進(jìn)行重疊延伸PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，得到大小約為1 819 bp的E0-E2融合基因(圖2)，將所得產(chǎn)物經(jīng)純化回收并送測序分析，測序結(jié)果與預(yù)期E0-E2融合基因擴(kuò)增大小結(jié)果一致。

M，DL2000 DNA Marker；1，E0基因；2，E2基因M，DL2000 DNA Marker；1，E0 gene；2，E2 gene圖1 E0、E2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of E0 and E2 genes

圖2 E0-E2融合基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification result of E0-E2 fusion gene

2.2 重組穿梭載體構(gòu)建與驗證結(jié)果

用Hind Ⅲ、SalⅠ限制性內(nèi)切酶對構(gòu)建的pDC316-E0-E2進(jìn)行雙酶切，結(jié)果同時出現(xiàn)1 819及5 879 bp的2條目的條帶(圖3)。經(jīng)測序分析，其結(jié)果與E0-E2融合基因及pDC316-mCMV-EGFP相符，表明穿梭質(zhì)粒pDC316-E0-E2構(gòu)建成功。

M1,DL15000 DNA Marker；1,pDC316-mCMV-EGFP；2,pDC316-E0-E2雙酶切結(jié)果；M2,DL2000 DNA MarkerM1,DL15000 DNA Marker；1,pDC316-mCMV-EGFP；2,Double enzyme digestion results of pDC316-E0-E2；M2,DL2000 DNA Marker圖3 pDC316-E0-E2酶切鑒定結(jié)果Fig.3 Identification results of pDC316-E0-E2 enzyme digestion

2.3 穿梭質(zhì)粒與腺病毒共轉(zhuǎn)染包裝檢測結(jié)果

將構(gòu)建好的穿梭質(zhì)粒pDC316-E0-E2與AdMax腺病毒系統(tǒng)骨架質(zhì)粒混勻后轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染7～10 d后觀察到細(xì)胞后產(chǎn)生串聯(lián)、空泡、圓縮并脫離培養(yǎng)皿底壁等細(xì)胞病變，鏡檢細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光與預(yù)期結(jié)果相符(圖4)，證明重組腺病毒Ad5-E0-E2包裝成功。

A,轉(zhuǎn)染重組穿梭質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞;B,HEK293T細(xì)胞對照A,HEK293T cells transfected with recombinant shuttle plasmid;B,HEK293T cell control圖4 重組穿梭質(zhì)粒pDC316-E0-E2在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染情況(100×)Fig.4 Transfection of recombinant shuttle plasmid pDC316-E0-E2 in HEK293T cells (100×)

2.4 重組腺病毒表達(dá)蛋白Western blotting檢測結(jié)果

Western blotting檢測果顯示，在約65 ku處出現(xiàn)特異性條帶(圖5)，說明重組病毒能正常表達(dá)目的蛋白，表達(dá)的蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～3，Ad5-E0-E2蛋白M，Protein Marker；1-3，Ad5-E0-E2 protein圖5 重組腺病毒的Western blotting驗證Fig.5 Western blotting verification of recombinant Adenovirus

2.5 腺病毒滴度測定結(jié)果

通過Reed-Muench法測定Ad5-E0-E2滴度為1.1×1010PFU/mL。

2.6 BVDV E0和E2基因重組疫苗免疫原性探究結(jié)果

2.6.1 BVDV抗體ELISA檢測結(jié)果 試驗組注射Ad5-E0-E2后 S/P值均>0.30,血清抗體水平為陽性，且肌內(nèi)注射組S/P值高于皮下注射組。PBS對照組S/P值<0.20，為陰性(表3)。 說明注射Ad5-E0-E2后小鼠激發(fā)BVDV抗體產(chǎn)生特異性體液免疫反應(yīng)。

表3 ELISA檢測BVDV抗體S/P結(jié)果

2.6.2 T淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果 首免后試驗組CD4+水平均極顯著高于PBS組(P<0.01)，二免后各組CD4+水平均有上升，但試驗組仍極顯著高于PBS對照組(P<0.01)，首免和二免后試驗組CD8+水平均極顯著低于PBS對照組(P<0.01)(表4)；首免和二免后試驗組CD4+/CD8+比值均極顯著高于PBS對照組(P<0.01)(表5)。 說明構(gòu)建的重組腺病毒能刺激機(jī)體增加CD4+T淋巴細(xì)胞含量。

表4 全血T淋巴細(xì)胞亞群CD4+和CD8+含量

表5 全血T淋巴細(xì)胞亞群CD4+/CD8+的比值

3 討 論

20世紀(jì)80年代至20世紀(jì)90年代，BVD在許多國家發(fā)生大規(guī)模感染，平均感染率可達(dá)60%以上[2-3]。近年來，國內(nèi)學(xué)者對BVD的感染發(fā)病情況做了大量調(diào)查研究，2014年李智勇等[11]采用ELISA方法檢測甘肅部分養(yǎng)殖場和屠宰場220份血清，BVDV抗體陽性率為56.36%；2016年曲萍等[12]對中國新疆、青海、寧夏、甘肅和四川的感染情況進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，BVD的平均感染率在60%以上；2017年陳新諾等[13]用PCR方法檢測四川和西藏地區(qū)部分牧場149份臨床癥腹瀉的牦牛糞便樣品，抗原陽性率分別為12.66%和29.14%；2019年姚志蘭等[14]檢測江浙部分地區(qū)145份具有腹瀉癥狀的犢奶牛血清，BVDV抗原陽性率為13.1%；2021年石柯等[15]運用PCR方法對貴州地區(qū)224份鼻拭子樣品檢測結(jié)果顯示，36份為抗原陽性，陽性率為16.07%。以上調(diào)查結(jié)果均表明中國BVD的發(fā)病率較高，防控形勢嚴(yán)峻。20世紀(jì)90年代中國也進(jìn)行了BVDV疫苗的探索研究，但由于成本和成效等各方面的原因，目前尚無較高效和經(jīng)濟(jì)疫苗普遍投入使用?；诖?，本研究利用腺病毒疫苗的高效性成功組裝了BVDVE0、E2基因重組腺病毒疫苗，以期為BVDV疫苗研究提供依據(jù)。

陳文龍[10]研究表明，BVDV侵入動物機(jī)體后損傷宿主細(xì)胞的同時改變了宿主細(xì)胞的正常生理學(xué)功能，導(dǎo)致細(xì)胞受到損傷和持續(xù)性感染。感染型的BVDV能引起細(xì)胞的自吞噬及細(xì)胞中BVDV的囊膜蛋白E0、E2的表達(dá)量顯著升高，結(jié)構(gòu)蛋白E0和E2免疫原性好，刺激機(jī)體的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，產(chǎn)生有效的抗體[16-17]。因此，本試驗在構(gòu)建BVDV重組腺病毒疫苗時選用了E0、E2基因作為融合基因。孫凡婷[18]將優(yōu)化的E0基因和截短的E2基因通過重疊延伸PCR融合，構(gòu)建BVDV E0-E2融合基因重組卡介苗，獲得的目的蛋白具有反應(yīng)原性。馬小靜等[19]將BVDVE0基因和牛傳染性鼻氣管炎病(IBRV)gD基因連接到真核表達(dá)載體pVAXI-IRES中，構(gòu)建pVAXI-E0-FIRES-gD重組真核表達(dá)載體,通過免疫熒光檢測構(gòu)建的基因能成功表達(dá)，表達(dá)的蛋白接種小鼠后能產(chǎn)生抗體。 梁霄勇[20]將BVDVE0基因插入到pVAX1真核表達(dá)載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pVAX1-E0，首次免疫后產(chǎn)生抗體，加強(qiáng)免疫后抗體水平隨之增加。本研究對不同途徑免疫動物抗體水平進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，肌內(nèi)、皮下注射Ad5-E0-E2均能產(chǎn)生較高的抗體水平；T淋巴細(xì)胞亞群檢測顯示，肌內(nèi)注射組和皮下注射Ad5-E0-E2組CD4+水平高于對照組，首免和二免CD4+/CD8+值均高于對照組，說明構(gòu)建的重組腺病毒疫苗具有較好的免疫原性。本試驗結(jié)果初步說明所構(gòu)建的重組腺病毒Ad5-E0-E2具備BVDV疫苗毒株候選條件，其本體試驗和攻毒試驗還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究以人腺病毒5型為載體將BVDV E0及E2蛋白基因進(jìn)行融合后構(gòu)建重組腺病毒Ad5-E0-E2，且具有良好的反應(yīng)原性和免疫原性，具備BVDV疫苗毒株的基本條件，可運用到本體動物進(jìn)行試驗研究。