李建波，羅永鋒

0引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，是世界范圍內(nèi)工齡成人視力喪失的主要原因[1]。高血糖等因素引起視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞功能障礙，從而導(dǎo)致晚期視網(wǎng)膜新生血管形成，繼發(fā)性視網(wǎng)膜脫離和玻璃體積血，最終導(dǎo)致患者視力下降[2]。越來越多的證據(jù)認為，DR是炎癥、氧化應(yīng)激等多因素參與的復(fù)雜疾病，病理機制有待逐步闡明[3]。目前，激光光凝、抗新生血管藥物和玻璃體切除術(shù)是DR治療的主要手段，但存在損害健康視網(wǎng)膜組織的風(fēng)險，且這些治療策略的療效仍不充分[4]。因此，探索DR的病理機制和新的治療策略成為近年來眼科領(lǐng)域的研究熱點[5]。胃饑餓素(ghrelin)是一種在體內(nèi)廣泛分布的腦腸肽激素，通過與生長激素分泌素受體(GHSR)結(jié)合，發(fā)揮一系列生物學(xué)效應(yīng)，主要調(diào)節(jié)與能量穩(wěn)態(tài)相關(guān)的生理過程，如食欲、胰島素信號、葡萄糖代謝和肥胖[6]。研究發(fā)現(xiàn)，胃饑餓素及其受體也在眼組織中表達，在實驗性青光眼和視網(wǎng)膜新生血管疾病中顯示出治療潛力[7-8]。血漿胃饑餓素水平的改變是糖尿病及其并發(fā)癥的潛在危險因素，據(jù)此推測靶向胃饑餓素可能是一種新的糖尿病治療策略[9]。然而,關(guān)于胃饑餓素在DR中的作用鮮有報道。雖然高血糖導(dǎo)致視網(wǎng)膜組織損傷的確切機制尚不清楚，但有證據(jù)表明，糖尿病眼的慢性低度炎癥在一定程度上驅(qū)動一系列DR癥狀的出現(xiàn)[10]。作為眼內(nèi)的先天免疫系統(tǒng)，已證實視網(wǎng)膜細胞中的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥小體參與了DR的發(fā)病機制。糖尿病患者的眼內(nèi)有多種途徑可以激活NLRP3炎癥小體信號，隨后通過上調(diào)白細胞介素(IL)-1β和IL-18的釋放而發(fā)揮有害作用[11]。在本研究中,我們在體外觀察胃饑餓素對高濃度葡萄糖條件下視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞增殖、凋亡及NLRP3炎癥小體的影響,以期為進一步研究胃饑餓素對DR的治療作用奠定實驗基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1材料人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞購自上海中喬新舟生物科技有限公司；M199培養(yǎng)基購自武漢普諾賽生命科技有限公司；胎牛血清及胰蛋白酶購自美國Gibco公司；胃饑餓素購自美國Sigma公司；CCK-8試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；Annexin-APC/7-AAD細胞凋亡試劑盒購自天津三箭生物技術(shù)股份有限公司；兔多抗NLRP3抗體購自美國Abcam公司；兔多抗Caspase-1抗體及IL-18抗體均購自美國Affinity公司；兔多抗IL-1β購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；小鼠單抗β-actin及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及分組將人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞置于含10%胎牛血清的M199培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。將生長狀態(tài)良好的細胞用高糖和不同濃度的胃饑餓素(0、5、10、20、40nmol/L)分別處理48h。根據(jù)CCK-8檢測結(jié)果，選擇胃饑餓素的最佳濃度進行后續(xù)實驗。然后將細胞隨機分為四組：正常對照組(NC，M199培養(yǎng)基中培養(yǎng))，胃饑餓素組(M199培養(yǎng)基中加入10nmol/L ghrelin)，高糖組(HG，M199培養(yǎng)基中加入30mmol/L葡萄糖)及ghrelin+HG組(M199培養(yǎng)基中加入10nmol/L ghrelin和30mmol/L葡萄糖)，四組細胞均處理48h。

1.2.2細胞增殖根據(jù)說明書使用CCK-8試劑盒檢測人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞增殖。將細胞接種于96孔板中，每孔的密度為5×103cell/mL。不同組細胞處理48h后，每孔加10μL CCK-8試劑。37℃孵育4h后，在450nm的酶標(biāo)儀上測定每孔的吸光度值(A)。計算細胞增殖率(%)為(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%。A實驗組為處理后細胞的吸光度值，A空白組為無細胞培養(yǎng)基的吸光度值，A對照組為未處理細胞的吸光度值。

1.2.3細胞凋亡采用Annexin-APC/7-AAD凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡情況。將狀態(tài)良好的細胞接種于6孔板中，每孔5×105個，37℃孵育48h。消化后收集細胞，1500r/min離心5min。然后用500μL結(jié)合緩沖液重懸細胞，加入5μL Annexin-APC和5μL 7-AAD染色。避光室溫孵育15min，1h內(nèi)流式細胞儀上機檢測。

1.2.4Westernblotting檢測細胞NLRP3和Caspase-1及IL-1β與IL-18的表達用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度后，用SDS-PAGE凝膠分離40μg樣品，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。含5%脫脂奶粉的TBST封閉膜，加入稀釋的一抗NLRP3(1∶1000)、Caspase-1(1∶5000)、IL-1β(1∶500)、IL-18(1∶500)和β-actin(1∶1000)，在4℃孵育過夜。然后，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(1∶50000)在室溫下孵育2h。ECL顯色曝光條帶，采用Bandscan 5.0軟件進行量化。

2結(jié)果

2.1胃饑餓素對高糖下人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞增殖的影響首先設(shè)置了不同濃度的ghrelin組，以篩選高糖環(huán)境下胃饑餓素對人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的最佳保護作用濃度。CCK-8檢查結(jié)果顯示，與NC組相比，HG組細胞增殖率明顯降低了近1/2，給予不同濃度胃饑餓素聯(lián)合高糖處理，細胞增殖均有一定程度的升高。胃饑餓素濃度在10nmol/L時細胞增殖最強，而20、40nmol/L的胃饑餓素處理，使高糖下的細胞增殖率又逐漸降低(圖1)。以上結(jié)果提示，濃度10nmol/L是胃饑餓素發(fā)揮保護作用的最佳濃度，因此后續(xù)研究中采用此濃度作為ghrelin組。NC組、ghrelin組、HG組及ghrelin+HG組的細胞增殖率分別為100.00%±0.00%、104.09%±0.61%、69.87%±0.68%、92.31%±3.62%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=200.83，P<0.001)。進一步組間兩兩比較顯示，ghrelin組細胞增殖率高于NC組(t=11.70，P<0.001)。HG和ghrelin+HG組細胞增殖率均低于NC組(t=-76.26，P<0.001；t=-3.68，P<0.05)和ghrelin組(t=-64.88，P<0.001；t=-5.56，P<0.01)。與HG組相比，ghrelin+HG組細胞增殖率明顯升高(t=10.56，P<0.001)，見圖2。

圖1 CCK-8法篩選ghrelin作用濃度。

圖2 CCK-8法檢測各組人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞增殖情況 與NC組相比，ghrelin組細胞增殖增強，HG組和ghrelin+HG組細胞增殖減弱；與ghrelin組相比，HG組和ghrelin+HG組細胞增殖減弱；與HG組相比，ghrelin+HG細胞增殖增強。aP<0.05 vs NC組；cP<0.05 vs ghrelin組；eP<0.05 vs HG組。

2.2胃饑餓素對高糖下人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞凋亡的影響流式檢測結(jié)果顯示，NC組、ghrelin組、HG組、ghrelin+HG組的細胞凋亡率分別為4.94%±0.15%、3.58%±0.17%、28.33%±1.37%、14.24%±0.32%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=763.57，P<0.001)。進一步組間兩兩比較結(jié)果顯示，ghrelin組細胞凋亡率低于對照組(t=-10.23，P<0.01)。

HG和ghrelin+HG組細胞凋亡率均高于NC組(t=29.30、45.51，均P<0.001)和ghrelin組(t=30.95，P<0.001；t=51.00，P<0.01)。與HG組相比，ghrelin+HG組細胞凋亡率明顯降低(t=-17.30，P<0.001)，見圖3。

圖3 流式細胞儀檢測各組人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞凋亡情況 與NC組相比，ghrelin組細胞凋亡減少，HG組和ghrelin+HG組細胞凋亡增多；與ghrelin組相比，HG組和ghrelin+HG組細胞凋亡增多；與HG組相比，ghrelin+HG細胞凋亡減少。aP<0.05 vs NC組；cP<0.05 vs ghrelin組；eP<0.05 vs HG組。

2.3胃饑餓素對高糖下人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞NLRP3炎癥小體蛋白表達的影響Western blotting結(jié)果顯示，NC組、ghrelin組、HG組、ghrelin+HG組的NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白相對表達量分別為：NLRP3(0.53±0.02、0.31±0.00、1.08±0.03、0.75±0.03)；Caspase-1(0.22±0.03、0.12±0.01、0.60±0.07、0.34±0.05)。各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(NLRP3：F=495.92，P<0.001；Caspase-1：F=64.52，P<0.001)。進一步組間兩兩比較結(jié)果顯示，ghrelin組細胞這兩種蛋白的表達均低于NC組(NLRP3：t=-16.58，P<0.001；Caspase-1：t=-5.65，P<0.01)。HG和ghrelin+HG組NLRP3的蛋白表達均高于NC組(t=23.42，P<0.001；t=10.21，P<0.01)和ghrelin組(t=38.92，P<0.001；t=24.84，P<0.01)。HG和ghrelin+HG組Caspase-1的蛋白表達均高于NC組(t=9.12，P<0.01；t=3.41，P<0.05)和ghrelin組(t=12.29，P<0.001；t=7.07，P<0.01)。與HG組相比，ghrelin+HG組兩種蛋白的相對表達明顯降低(NLRP3：t=-12.42，P<0.001；Caspase-1：t=-5.48，P<0.01)，見圖4。

圖4 Western blotting檢測各組人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞NLRP3炎癥小體蛋白的表達 與NC組相比，ghrelin組細胞表達NLRP3及Caspase-1減少，HG組和ghrelin+HG組細胞表達NLRP3及Caspase-1增多；與ghrelin組相比，HG組和ghrelin+HG組NLRP3、Caspase-1表達增多；與HG組相比，ghrelin+HG細胞NLRP3、Caspase-1表達減少。aP<0.05 vs NC組；cP<0.05 vs ghrelin組；eP<0.05 vs HG組。

2.4胃饑餓素對高糖下人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞IL-1β及IL-18蛋白表達的影響Western blotting結(jié)果顯示，NC組、ghrelin組、HG組、ghrelin+HG組炎癥蛋白的相對表達量分別為：IL-1β(0.34±0.06、0.20±0.04、0.76±0.06、0.46±0.07)；IL-18(0.39±0.03、0.18±0.01、0.79±0.07、0.55±0.04)。各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(IL-1β：F=47.44，P<0.001；IL-18：F=114.57，P<0.001)。進一步組間兩兩比較結(jié)果顯示，ghrelin組細胞這兩種蛋白的表達均低于NC組(IL-1β：t=-3.40，P<0.05；IL-18：t=-12.33，P<0.01)。HG和ghrelin+HG組IL-1β的蛋白表達均高于NC組(HG:t=8.58，P<0.01；ghrelin+HG：t=2.27，P<0.05)和ghrelin組(HG:t=12.94，P<0.001；ghrelin+HG：t=5.35，P<0.01)。HG和ghrelin+HG組IL-18的蛋白表達均高于對照組(HG:t=9.33，P<0.01；ghrelin+HG：t=6.19，P<0.01)和ghrelin組(HG:t=14.99，P<0.001；ghrelin+HG：t=16.60，P<0.01)。與HG組相比，ghrelin+HG組兩種蛋白的相對表達明顯降低(IL-1β：t=-5.33，P<0.01；IL-18：t=-5.31，P<0.01)，見圖5。

圖5 Western blotting檢測各組人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞炎癥因子IL-1β及IL-18蛋白的表達 與NC組相比，ghrelin組細胞表達IL-1β、IL-18減少，HG組和ghrelin+HG組細胞表達IL-1β、IL-18增多；與ghrelin組相比，HG組和ghrelin+HG組IL-1β、IL-18表達增多；與HG組相比，ghrelin+HG細胞IL-1β、IL-18表達減少。aP<0.05 vs NC組；cP<0.05 vs ghrelin組；eP<0.05 vs HG組。

3討論

胃饑餓素是Kojima等[12]在1999年發(fā)現(xiàn)的一種大腦肽，由28個氨基酸殘基組成，相對分子質(zhì)量為3314kDa。胃饑餓素廣泛分布于人體細胞和組織，通過與其受體GHSR結(jié)合，可促進生長激素分泌，參與能量代謝，改善胃腸功能，保護心血管系統(tǒng)[13]。GHSR廣泛分布于人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍組織[14]，在人眼睫狀體色素上皮、視網(wǎng)膜色素上皮和虹膜中均有表達[15]。以往對胃饑餓素作用的研究主要集中在GH的分泌和調(diào)節(jié)生長與能量的平衡，近年來發(fā)現(xiàn)胃饑餓素可能具有更廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，在許多眼病中的作用已引起關(guān)注。例如，胃饑餓素可減少大鼠慢性高眼壓模型的神經(jīng)節(jié)細胞凋亡[16]，而青光眼患者血清和房水中的胃饑餓素水平顯著降低[17]。對于視網(wǎng)膜血管性疾病，胃饑餓素在早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變動物模型的兩個階段都發(fā)揮有益的作用[8]。針對糖尿病血管并發(fā)癥的研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病患者血漿胃饑餓素水平明顯低于無糖尿病并發(fā)癥的患者，提示胃饑餓素在動脈粥樣硬化、微血管疾病等糖尿病性內(nèi)皮細胞功能障礙中發(fā)揮保護作用[18]。另有研究證明在糖尿病患者中內(nèi)源性胃饑餓素表達下調(diào)，而外源性胃饑餓素可增強糖尿病患者下肢動脈灌注，表明胃饑餓素可能是一種潛在的外周動脈疾病的新療法[19]。然而，胃饑餓素是否在DR這一微血管并發(fā)癥中也同樣發(fā)揮有益作用還有待研究。

為了初步探究胃饑餓素對DR的保護作用，本研究在體外觀察了胃饑餓素對高糖條件下人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞增殖及凋亡的影響。我們觀察了不同濃度胃饑餓素對高糖下細胞增殖率的影響，并選擇了最佳的作用濃度10nmol/L用于后續(xù)研究。與正常對照組相比，高糖組的細胞增殖率明顯降低，細胞凋亡率明顯升高，這一結(jié)果與文獻報道一致[20]，提示高糖環(huán)境對視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞可造成顯著損傷。聯(lián)合外源性胃饑餓素處理的細胞增殖率明顯高于高糖組，細胞凋亡率明顯低于高糖組，表明胃饑餓素對高糖損傷的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞具有明顯的保護作用。針對其他血管內(nèi)皮細胞的一系列研究表明，胃饑餓素可刺激人真皮微血管內(nèi)皮細胞、心臟微血管內(nèi)皮細胞和人臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖，當(dāng)抑制GHSR時，細胞增殖能力明顯減弱[21-24]。然而也有研究發(fā)現(xiàn)，胃饑餓素在體外和體內(nèi)均能抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖和大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞的增殖[25-26]。以上實驗結(jié)果的差異可能與不同細胞所處的病理生理環(huán)境不同有關(guān)，因此，胃饑餓素對血管內(nèi)皮細胞的作用有待進一步研究。

炎癥小體是2002年由Tschopp研究小組首次提出的細胞質(zhì)多蛋白復(fù)合物[27]。炎癥小體負責(zé)Caspase-1的激活，隨后產(chǎn)生細胞因子IL-1β和IL-18，并啟動炎性細胞死亡程序[28]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾種主要的炎癥小體，包括NLRP1、NLRP3、NLRC4[29],到目前為止對NLRP3炎癥小體的研究最為廣泛。NLRP3炎癥小體通常由NLRP3、ASC和Caspase-1組成[30]。越來越多的證據(jù)表明NLRP3炎癥小體激活參與促進內(nèi)皮細胞功能障礙[31]，因此成為DR的重要致病因素[10-11]。鑒于此，本研究觀察了NLRP3在胃饑餓素保護高糖損傷的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞中的可能角色。結(jié)果提示，NLRP3炎癥小體在高糖條件下的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮中表達增加，其下游細胞因子IL-1β和IL-18的表達也有升高，而胃饑餓素處理可顯著降低高糖下的NLRP3炎癥小體信號通路的激活。最近的研究表明胃饑餓素在多種疾病中的保護作用與抑制NLRP3炎癥小體有關(guān)[32-33]，與本研究結(jié)果相一致，這些研究均提示NLRP3炎癥小體是胃饑餓素發(fā)揮保護效應(yīng)的一種可能機制。

本研究為胃饑餓素在DR發(fā)病機制中的作用和潛在機制提供了初步證據(jù)。我們發(fā)現(xiàn)高糖抑制人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡及NLRP3炎癥小體活化，用胃饑餓素處理對細胞增殖有保護作用，對細胞凋亡和NLRP3炎癥小體激活有抑制作用。據(jù)此認為，胃饑餓素可能是一種潛在的治療靶點，以減少高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞損傷。然而，本研究僅在細胞實驗層面對胃饑餓素的作用進行了初步觀察，目前獲得的結(jié)果尚不能證明胃饑餓素是直接通過抑制NLRP3炎癥小體的激活而發(fā)揮高糖下的細胞保護作用的。此外，胃饑餓素是否在DR的動物模型和患者中也同樣發(fā)揮保護作用尚不清楚，其作用和分子機制還需要深入研究。