李 暉，汪明紅，廖風(fēng)玲，劉國立

0引言

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤是臨床常見的一種惡性腫瘤且已嚴(yán)重威脅患者生命安全，目前視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，研究表明長鏈非編碼RNA(LncRNA)表達(dá)異常與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，并可能作為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤診斷及治療的潛在靶點(diǎn)[1-4]。LncRNA DLGAP1-AS2在膽管癌中呈高表達(dá)，并可促進(jìn)膽管癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲[5]。但DLGAP1-AS2與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)研究報道相對較少。Starbase預(yù)測顯示DLGAP1-AS2與miR-1193存在結(jié)合位點(diǎn)，研究表明miR-1193上調(diào)表達(dá)可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移[6]。但DLGAP1-AS2與miR-1193在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤發(fā)生及發(fā)展過程中的作用機(jī)制尚未可知。因此，本研究主要探討DLGAP1-AS2是否可通過靶向調(diào)控miR-1193表達(dá)而調(diào)節(jié)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤HXO-Rb44增殖、遷移和侵襲。

1材料和方法

1.1材料收集病理確診且臨床資料完整的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織標(biāo)本25例，其中男15例，女10例，年齡8月齡～10歲(平均5.68±1.25歲)。同時選取因外傷摘除眼球的正常視網(wǎng)膜組織9例為對照，其中男5例，女4例，年齡9月齡～10歲(平均5.22±1.16歲)。兩組研究對象年齡、性別比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審核。

人正常視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞ACBRI-181、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤HXO-Rb44購自美國ATCC；DMEM培養(yǎng)液與胎牛血清購自美國Gibco；Trizol試劑購自美國Thermo Fisher；cDNA合成及qRT-PCR試劑及引物購自大連寶生物；Lipofectamine 2000、Transwell小室、Matrigel基質(zhì)膠購自北京索萊寶；CCK-8試劑購自上海碧云天生物；DLGAP1-AS2小分子干擾RNA(si-DLGAP1-AS2)及其陰性對照(si-NC)、miR-1193寡核苷酸模擬物(miR-1193 mimic)及陰性對照mimic NC序列(miR-NC)、miR-1193寡核苷酸抑制物(miR-1193 inhibitor)購自廣州銳博生物；兔抗人E-cadherin、N-cadherin抗體與二抗購自美國CST。

1.2方法

1.2.1石蠟切片HE染色將烤好的組織切片置于新鮮二甲苯中脫蠟10min×3次；依次放入體積分?jǐn)?shù)100%、95%、85%、70%乙醇中各3～5min后蒸餾水沖洗；Harry蘇木素染液染色8min，蒸餾水沖洗；體積分?jǐn)?shù)1%鹽酸酒精分色，蒸餾水沖洗，自來水沖洗20min返藍(lán)；伊紅染液染色1min，蒸餾水沖洗；依次經(jīng)體積分?jǐn)?shù)95%、100%乙醇浸泡脫水各2次，每次20s，干燥后依次置于酒精二甲苯溶液、兩缸二甲苯中各5min；迅速滴加適量中性樹膠，蓋玻片封固;顯微鏡下觀察、照相。

1.2.2實驗分組ACBRI-181細(xì)胞、HXO-Rb44細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素與100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2體積分?jǐn)?shù)培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80%融合度時進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期HXO-Rb44細(xì)胞接種于96孔板(3×103個/孔)，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作。將si-DLGAP1-AS2 A、si-DLGAP1-AS2 B、si-DLGAP1-AS2 C分別轉(zhuǎn)染至HXO-Rb44細(xì)胞，分別記為si-DLGAP1-AS2 A組、si-DLGAP1-AS2 B組、si-DLGAP1-AS2 C組，采用qRT-PCR法檢測細(xì)胞中DLGAP1-AS2表達(dá)量，選取干擾效果較好的進(jìn)行后續(xù)實驗。將si-NC、si-DLGAP1-AS2、miR-NC、miR-1193 mimic、si-DLGAP1-AS2與miR-1193 inhibitor(共轉(zhuǎn)染)分別轉(zhuǎn)染至HXO-Rb44細(xì)胞，分別記為si-NC組、si-DLGAP1-AS2組、miR-NC組、miR-1193 mimic組、si-DLGAP1-AS2+miR-1193 inhibitor組。同時將正常培養(yǎng)的HXO-Rb44細(xì)胞記為control組。

1.2.3qRT-PCR檢測DLGAP1-AS2和miR-1193的表達(dá)水平用Trizol試劑分別提取正常視網(wǎng)膜組織、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織、ACBRI-181細(xì)胞、HXO-Rb44細(xì)胞與轉(zhuǎn)染后各組HXO-Rb44細(xì)胞總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計測定RNA濃度。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min循環(huán)1次，95℃變性15s，60℃退火60s，72℃延伸30s，共循環(huán)40次。應(yīng)用ABI StepOnePlus熒光定量PCR儀檢測DLGAP1-AS2、miR-1193相對表達(dá)量。

1.2.4雙熒光素酶報告實驗檢測DLGAP1-AS2與miR-1193的靶向關(guān)系由美國Promega公司構(gòu)建含有DLGAP1-AS2與miR-1193互補(bǔ)序列的野生型報告基因載體WT-DLGAP1-AS2和含有突變序列的突變型報告基因載體MUT-DLGAP1-AS2，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-NC/WT-DLGAP1-AS2、miR-NC/MUT-DLGAP1-AS2、miR-1193 mimic/WT-DLGAP1-AS2、miR-1193 mimic/MUT-DLGAP1-AS2分別共轉(zhuǎn)染至HXO-Rb44細(xì)胞，加入20μL 1×Passive Lysis Buffer，加入100μL Luciferase Assay Reagent Ⅱ，于熒光發(fā)光儀檢測Firefly Luciferase活性值，加入100μL Stop&Glo Reagent于熒光發(fā)光儀檢測Renilla Luciferase活性值，以海腎熒光素酶報告基因活性值為內(nèi)參，計算各組細(xì)胞熒光素酶活性值。

1.2.5CCK-8實驗檢測細(xì)胞增殖取各組HXO-Rb44細(xì)胞接種于96孔板(4×103個/孔)，每孔加入10μL CCK-8溶液，于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h，用酶標(biāo)儀檢測各孔光密度值(OD 450nm)并計算細(xì)胞增殖抑制率[(對照組OD-實驗組OD)/(對照組OD-空白組OD)×100%]。

1.2.6平板克隆形成實驗取各組HXO-Rb44細(xì)胞接種于6孔板(500個/孔)，于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)14d，每隔2d更換一次培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定20min(-20℃)，1%結(jié)晶紫染色15min，PBS洗滌后晾干，觀察集落形成數(shù)。

1.2.7Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移與侵襲遷移實驗：取各組HXO-Rb44細(xì)胞(1×105cell/mL)按照每孔200μL的密度加入小室的上室，按照每孔600μL的密度將含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液加入下室，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，多聚甲醛固定20min，用0.1%結(jié)晶紫染液染色20min，顯微鏡下觀察遷移細(xì)胞數(shù)。侵襲實驗：Matrigel基質(zhì)膠稀釋液按照每孔40μL的密度加入小室的上室，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)固定5h，后續(xù)實驗步驟同遷移實驗。

1.2.8Westernblot檢測E-cadherin和N-cadherin蛋白表達(dá)量各組HXO-Rb44細(xì)胞加入500μL RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，密封2h，加入E-cadherin(1∶500)、N-cadherin(1∶500)、GAPDH抗體(1∶1000)稀釋液4℃孵育24h，TBST洗膜40min，加入二抗稀釋液(1∶3000)37℃孵育1h，TBST洗膜40min，ECL試劑與DNR BioImaging System觀察PVDF膜上蛋白條帶，用凝膠圖像處理系統(tǒng)軟件分析蛋白條帶灰度值。

2結(jié)果

2.1病理形態(tài)特征檢測與正常視網(wǎng)膜組織細(xì)胞相比，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織中腫瘤細(xì)胞核大，染色較深，細(xì)胞呈橢圓或梭形，可見核分裂，排列不規(guī)則，見圖1。

2.2DLGAP1-AS2和miR-1193表達(dá)的檢測與正常視網(wǎng)膜組織比較，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織中DLGAP1-AS2的表達(dá)量升高(P<0.05)，miR-1193的表達(dá)量降低(P<0.05)，見表1。與ACBRI-181細(xì)胞比較，HXO-Rb44細(xì)胞中DLGAP1-AS2的表達(dá)量升高(P<0.05)，miR-1193的表達(dá)量降低(P<0.05)，見表2、圖2。

表2 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞HXO-Rb44中DLGAP1-AS2和miR-1193表達(dá)的檢測

圖2 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織和細(xì)胞中DLGAP1-AS2和miR-1193表達(dá)的檢測 A：與正常視網(wǎng)膜組織相比，DLGAP1-AS2在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織中高表達(dá)；B：與正常視網(wǎng)膜組織相比，miR-1193在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織中低表達(dá)；C：與ACBRI-181細(xì)胞相比，DLGAP1-AS2在HXO-Rb44細(xì)胞中高表達(dá)；D：與ACBRI-181細(xì)胞相比，miR-1193在HXO-Rb44細(xì)胞中低表達(dá)。aP<0.05 vs 正常視網(wǎng)膜組織組；cP<0.05 vs ACBRI-181組。

2.3沉默DLGAP1-AS2處理后DLGAP1-AS2表達(dá)的檢測與control組、si-NC組比較，si-DLGAP1-AS2 A組、si-DLGAP1-AS2 B組、si-DLGAP1-AS2 C組DLGAP1-AS2的表達(dá)量降低(P<0.05)，見表3、圖3。其中si-DLGAP1-AS2 A組DLGAP1-AS2的表達(dá)量相對較低，因而選用si-DLGAP1-AS2 A進(jìn)行后續(xù)實驗。

表3 沉默DLGAP1-AS2后DLGAP1-AS2表達(dá)的檢測

圖3 沉默DLGAP1-AS2后DLGAP1-AS2表達(dá)的檢測 1：control組；2：si-NC組；3：si-DLGAP1-AS2 A組；4：si-DLGAP1-AS2 B組；5：si-DLGAP1-AS2 C組。aP<0.05 vs control組；cP<0.05 vs si-NC組。

2.4DLGAP1-AS2和miR-1193靶向關(guān)系Starbase預(yù)測顯示DLGAP1-AS2與miR-1193存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖4A。miR-1193過表達(dá)可抑制野生型載體WT-DLGAP1-AS2的熒光素酶活性(P<0.05)，而未能抑制突變型載體MUT-DLGAP1-AS2的熒光素酶活性，見表4、圖4B。

表4 雙熒光素酶報告實驗

圖4 DLGAP1-AS2和miR-1193的互補(bǔ)序列及熒光素酶活性檢測 A：DLGAP1-AS2和miR-1193的互補(bǔ)序列；B：雙熒光素酶報告實驗檢測熒光素酶活性。aP<0.05 vs miR-NC組。

2.5各個處理組對HXO-Rb44中miR-1193及增殖的影響與control組、si-NC組比較，si-DLGAP1-AS2組miR-1193的表達(dá)量升高(P<0.05)，細(xì)胞增殖抑制率升高(P<0.05)，集落形成數(shù)減少(P<0.05)；與miR-NC組比較，miR-1193 mimic組miR-1193的表達(dá)量升高(P<0.05)，細(xì)胞增殖抑制率升高(P<0.05)，集落形成數(shù)減少(P<0.05)；與si-DLGAP1-AS2組比較，si-DLGAP1-AS2+miR-1193 inhibitor組miR-1193的表達(dá)量降低(P<0.05)，細(xì)胞增殖抑制率降低(P<0.05)，集落形成數(shù)增多(P<0.05)，見表5、圖5。

表5 HXO-Rb44細(xì)胞中miR-1193、抑制率和集落形成數(shù)的檢測

圖5 HXO-Rb44細(xì)胞中miR-1193、抑制率和集落形成數(shù)的檢測 A：miR-1193表達(dá)的檢測；B：HXO-Rb44細(xì)胞抑制率的檢測；C：HXO-Rb44細(xì)胞集落形成數(shù)的檢測。1：control組；2：si-NC組；3：si-DLGAP1-AS2組；4：miR-NC組；5：miR-1193 mimic組；6：si-DLGAP1-AS2+miR-1193 inhibitor組。aP<0.05 vs control組；cP<0.05 vs si-NC組；eP<0.05 vs miR-NC組；gP<0.05 vs si-DLGAP1-AS2組。

2.6各個處理組對HXO-Rb44遷移和侵襲的影響與control組、si-NC組比較，si-DLGAP1-AS2組遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)；與miR-NC組比較，miR-1193 mimic組遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)；與si-DLGAP1-AS2組比較，si-DLGAP1-AS2+miR-1193 inhibitor組遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)增多(P<0.05)，見圖6、表6。

表6 HXO-Rb44細(xì)胞遷移和侵襲的檢測 個)

圖6 HXO-Rb44細(xì)胞遷移、侵襲的檢測 1：control組；2：si-NC組；3：si-DLGAP1-AS2組；4：miR-NC組；5：miR-1193 mimic組；6：si-DLGAP1-AS2+miR-1193 inhibitor組。aP<0.05 vs control組；cP<0.05 vs si-NC組；eP<0.05 vs miR-NC組；gP<0.05 vs si-DLGAP1-AS2組。

2.7各個處理組對HXO-Rb44中E-cadherin和N-cadherin表達(dá)的影響與control組、si-NC組比較，si-DLGAP1-AS2組E-cadherin蛋白水平升高(P<0.05)，N-cadherin蛋白水平降低(P<0.05)；與miR-NC組比較，miR-1193 mimic組E-cadherin蛋白水平升高(P<0.05)，N-cadherin蛋白水平降低(P<0.05)；與si-DLGAP1-AS2組比較，si-DLGAP1-AS2+miR-1193 inhibitor組E-cadherin蛋白水平降低(P<0.05)，N-cadherin蛋白水平升高(P<0.05)，見圖7、表7。

圖7 E-cadherin和N-cadherin蛋白表達(dá)的檢測 1：control組；2：si-NC組；3：si-DLGAP1-AS2組；4：miR-NC組；5：miR-1193 mimic組；6：si-DLGAP1-AS2+miR-1193 inhibitor組。aP<0.05 vs control組；cP<0.05 vs si-NC組；eP<0.05 vs miR-NC組；gP<0.05 vs si-DLGAP1-AS2組。

表7 HXO-Rb44中E-cadherin和N-cadherin蛋白表達(dá)的檢測

3討論

LncRNA在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展過程中可發(fā)揮重要調(diào)控作用，例如，沉默LncRNA ANRIL可通過調(diào)節(jié)miR-99a和c-Myc而抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長并促進(jìn)其凋亡[7]。LncRNA XIST通過競爭性結(jié)合miR-101而促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[8]。敲低LncRNA PVT1可抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的進(jìn)展[9]。LncRNA CANT1可抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖[10]。

DLGAP1-AS2在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中的表達(dá)尚未可知。研究表明抑制DLGAP1-AS2表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞遷移及侵襲[11]。DLGAP1-AS2通過上調(diào)YAP1表達(dá)而促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生[12]。DLGAP1-AS2在Wilms腫瘤中表達(dá)上調(diào)，并可能作為Wilms腫瘤診斷的潛在生物學(xué)標(biāo)記物[13]。本研究結(jié)果顯示，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織與細(xì)胞系中DLGAP1-AS2的表達(dá)量升高，沉默DLGAP1-AS2可增高視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖抑制率，集落形成數(shù)減少，提示沉默DLGAP1-AS2可抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖及克隆形成。表明DLGAP1-AS2高表達(dá)可促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖及增強(qiáng)細(xì)胞克隆形成能力從而促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的發(fā)生及發(fā)展。E-cadherin與N-cadherin表達(dá)失調(diào)可調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞轉(zhuǎn)移[14]。本研究結(jié)果顯示，沉默DLGAP1-AS2后視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)減少，E-cadherin蛋白水平升高，N-cadherin蛋白水平降低，提示沉默DLGAP1-AS2可抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞遷移及侵襲。表明DLGAP1-AS2高表達(dá)可促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞遷移及侵襲從而發(fā)揮癌基因作用。

本研究證實DLGAP1-AS2可靶向結(jié)合miR-1193，并可負(fù)向調(diào)控miR-1193的表達(dá)。提示DLGAP1-AS2可能通過靶向miR-1193而促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤發(fā)展。研究表明miR-1193表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)展[15]。miR-1193通過直接靶向跨膜9超家族3(TM9SF3)抑制人T細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖和侵襲[16]。抑制miR-1193表達(dá)可促進(jìn)成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的發(fā)生[17]。本研究結(jié)果顯示，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織與細(xì)胞系中miR-1193的表達(dá)量降低，上調(diào)miR-1193表達(dá)可抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲，而抑制其表達(dá)可恢復(fù)沉默DLGAP1-AS2對視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲的抑制作用。提示DLGAP1-AS2可能通過靶向miR-1193而促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織與細(xì)胞系中DLGAP1-AS2表達(dá)上調(diào)，而miR-1193表達(dá)下調(diào)，DLGAP1-AS2與miR-1193存在靶向調(diào)控作用，沉默DLGAP1-AS2可通過促進(jìn)miR-1193表達(dá)而抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲，DLGAP1-AS2/miR-1193在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展過程中可發(fā)揮重要調(diào)控作用，并可能作為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤治療的潛在靶點(diǎn)，還可能為進(jìn)一步揭示視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的發(fā)病機(jī)制奠定實驗基礎(chǔ)。但DLGAP1-AS2基因序列上富含多個miRNA的結(jié)合位點(diǎn)，其是否可通過靶向調(diào)控其他miRNA而參與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤發(fā)生及發(fā)展過程仍需進(jìn)一步探究。