陳 耕 倪育軍 鐘 敏 徐莉娜 郭薇丹

(1. 湖南省產(chǎn)商品評審中心，湖南 長沙 410111；2. 湘潭市食品藥品檢驗所，湖南 湘潭 411101；3. 中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004)

研究[1-3]表明，食品中的不飽和醛對人體健康有負面影響。例如，食品中的糖基化反應(yīng)、蛋白質(zhì)氧化和脂肪氧化所產(chǎn)生的丙酮醛與一些口腔疾病如牙周病有關(guān)[4]；二羰基醛類化合物與慢性糖尿病有關(guān)[5]；丙烯醛、巴豆醛可誘導(dǎo)基因突變以及抑制DNA修復(fù)[6]。醛脫氫酶(ALDH,EC l.2.1)是一種可催化內(nèi)源和外源性醛類化合物脫氫的胞內(nèi)酶[7]，常用于消減食品中的不飽和醛從而減輕因攝入不飽和醛而給機體帶來的危害。目前，ALDH主要來源于動物肝臟，存在穩(wěn)定性差、成本高、催化效率低等問題[8]，因此其應(yīng)用受到限制。大量微生物具有較高的ALDH活性，如酵母[8-9]、醋酸菌[10]、乳酸菌[11]以及深海細菌[12]，利用微生物提取ALDH并采用固定化的方式來穩(wěn)定酶活是一種有效解決上述問題的方法。付湘晉[13]研究發(fā)現(xiàn)，用葡萄酒酵母細胞處理魚糜2 h后，魚糜中丙二醛含量下降了70%，2,4-庚-二烯醛和2,4-癸-二烯醛的含量低于檢出限。劉薇叢[14]從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選出的6株具有耐冷凍特性的異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)菌株J3、J7、J8、J9、J12、J18可消減魚肉中的脂肪氧化產(chǎn)物丙二醛，是潛在的魚肉、肉類生物保鮮劑。研究擬測定上述6株(J3、J7、J8、J9、J12、J18)酵母菌株的ALDH活性，并采用海藻酸鈉—氯化鈣法對ALDH進行包埋，分析游離ALDH及包埋ALDH在冷藏、模擬胃腸道環(huán)境中的穩(wěn)定性，以期為開發(fā)可用于消減胃腸道內(nèi)活性醛的產(chǎn)品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)菌株J3、J7、J8、J9、J12、J18：中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院實驗室。

1.2 材料與試劑

二硫蘇糖醇：分析純，上海如吉生物科技有限公司；

氯化鈣、葡萄糖：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

NAD+：上海如吉生物科技有限公司；

海藻酸鈉、蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

胃蛋白酶：1 200 U/g，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

胰蛋白酶：500 U/g，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

液體培養(yǎng)基:2%葡萄糖，2%蛋白胨，1%酵母浸粉；

固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入2%瓊脂。

1.3 儀器與設(shè)備

微生物培養(yǎng)箱：SPK-150BⅢ型，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；

立式自動壓力蒸汽滅菌鍋：G154DWS型，廈口致微儀器有限公司；

超凈工作臺：SW-CJ-IFD型，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；

紫外可見分光光度計：BluestarB型，北京萊伯泰科儀器股份有限公司；

超聲波細胞破碎儀：JY92-ⅡN型，寧波新芝有限公司；

離心機：TG25KR型，長沙東旺實驗儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 酵母菌活化和擴大培養(yǎng) 參照劉薇叢[14]的方法并稍作修改，將斜面培養(yǎng)基的酵母接種于液體培養(yǎng)基，在28 ℃，150 r/min條件下培養(yǎng)24 h進行活化，再以5%的接種量進行擴大培養(yǎng)得到酵母菌懸液。

1.4.2 酵母菌粗酶液制備與檢測

(1) 酵母菌粗酶液制備：參照衣海龍[15]的方法并稍作修改，取1.4.1中培養(yǎng)好的菌液100 mL，在4 ℃下以8 000 r/min 離心15 min，棄上清液，并用0.05 mol/L、pH 8.0的磷酸鉀緩沖溶液30 mL洗滌酵母菌細胞泥1次，然后在4 ℃下以10 000 r/min離心10 min 收集得到酵母泥。將濕酵母按m濕酵母∶m緩沖液=1∶30重懸浮于0.05 mol/L PBS (pH 8.0)緩沖液中，于冰水浴中超聲波破碎。超聲參數(shù)：超聲功率300 W、超聲時間7 s、間歇5 s、全程時間15 min。將細胞破碎物于4 ℃下以12 000 r/min 離心15 min，取上清液進行醛脫氫酶活性和蛋白濃度測定。

(2) 醛脫氫酶活性檢測:參照Okibe等[16]的方法。酶活反應(yīng)體系組成：2.52 mL Tris-HCl緩沖液(0.05 mol/L，pH 8.0)、0.1 mL 3 mol/L KCl溶液、0.1 mL 0.02 mol/L NAD+溶液、0.1 mL 0.05 mol/L EDTA溶液、0.03 mL 0.05 mol/L 二硫蘇糖醇溶液、0.05 mL 0.1 mol/L乙醛溶液、0.1 mL粗酶液。酶活性測定體系和待測酶液分別在25 ℃下恒溫水浴5 min，將待測酶液迅速加入酶活反應(yīng)體系中混勻，立即放入分光光度計中，每隔l min讀取340 nm 處的吸光度值，持續(xù)5 min。定義每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmol 的底物所需酶量為一個酶活力單位(U)。

(3) 粗蛋白含量檢測:參照萬茵等[11]的方法。用緩沖液的吸光度作為空白值，分別測定蛋白溶液在260 nm及280 nm處的吸光度，按式(1)計算蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

(1)

式中：

C——蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL；

A280 nm——蛋白溶液在280 nm處的吸光度；

A260 nm——蛋白溶液在260 nm處的吸光度。

1.4.3 比活力計算 按式(2)計算比活力。

(2)

式中：

A——比活力，U/mg；

式(2)就是輸送臂關(guān)節(jié)1，2的運動學(xué)方程，它表明了輸送臂的末端在空間的位置和姿態(tài)。用4×1的位置向量表示為

E——酶活力，U；

P——蛋白質(zhì)含量，mg。

1.4.4 酶的包埋 參照劉天龍[17]的海藻酸鈉—氯化鈣包埋法，將10 mL海藻酸鈉溶液加熱溶解，冷卻后與5 mL 的游離酶液混合均勻，用一次性的注射器將海藻酸鈉與酶液混合液勻速滴入氯化鈣溶液中，形成大小均一的光滑顆粒，固化1 h后過濾取出，用蒸餾水洗滌，4 ℃下靜置硬化2 h。

1.4.5 包埋酶的活性測定 稱取1 g包埋酶的海藻酸鈉—氯化鈣顆粒，加入0.05 mol/L、pH 8.0的PBS緩沖液4 mL，充分碾磨，于4 ℃下以12 000 r/min離心15 min，取上清液0.1 mL按1.4.2中方法測定醛脫氫酶活性。

1.4.6 包埋酶冷藏穩(wěn)定性 分別取包埋酶和游離酶保存于4 ℃冰箱中，連續(xù)5 d內(nèi)每天定時定量取出測定兩者的殘余酶活。

1.4.7 包埋酶在模擬胃腸液中的酶活變化 參考萬茵等[11]的方法制備模擬胃液、模擬腸液。

在模擬胃液中加入粗酶液或包埋酶，置于37 ℃、160 r/min 的搖床振180 min，于0，10，20，30，40，50，60，90，180 min 時，測定消化液中ALDH酶活。以未經(jīng)消化的粗酶液和包埋酶活性視作100%酶活，計算酶活性保留率。

在模擬腸液中加入粗酶液或包埋酶，于0，10，20，30，40，50，60 min時測定ALDH酶活。以未經(jīng)消化的粗酶液和包埋酶活性視作100%酶活，計算酶活性保留率。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有試驗均重復(fù)3次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Excel軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計、繪圖，采用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 異常威克漢姆酵母菌ALDH活性

6株W.anomalus菌株J3、J7、J8、J9、J12、J18的ALDH酶測定結(jié)果見圖1。J9的比活力[(482.14±14.62) U/mg]顯著高于其他5株的，選用酶活最高的J9進行后續(xù)試驗。9號菌株與干酵母0.465 U/mg[8]、釀酒酵母120 U/mg[9]、醋酸菌20.25 U/mg[10]、醋化醋桿菌0.893 U/mL[18]、深海細菌52.44 U/mg[12]相比也具有明顯的優(yōu)勢。

2.2 海藻酸鈉添加量對ALDH酶活性的影響

設(shè)定氯化鈣的添加量為3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，分別與2.0%，2.5%，3.0%，3.5%，4.0%的海藻酸鈉對ALDH酶進行包埋，得到的酶活見圖2。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖1 6株異常威克漢姆酵母ALDH活性Figure 1 ALDH activity of 6 Wickerhamomyces anomalus strains

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖2 海藻酸鈉添加量對包埋酶酶活的影響Figure 2 Effect of sodium alginate concentration on enzyme activity

由圖2可知，當(dāng)海藻酸鈉添加量為3%時，包埋效果顯著高于其他添加量的。隨著海藻酸鈉添加量的增加，包埋酶酶活呈上升趨勢，當(dāng)海藻酸鈉添加量高于3.0%時，隨著海藻酸鈉添加量的增加，酶活呈下降趨勢?？赡苁且驗楹Ｔ逅徕c含量較低時包埋的凝膠結(jié)構(gòu)不夠緊密導(dǎo)致包埋率低，隨著海藻酸鈉含量的增加，形成的凝膠強度增加，內(nèi)部結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定從而提高了包埋率。但是高含量的海藻酸鈉形成的凝膠強度過大，硬度上升，導(dǎo)致注射器擠壓出的顆粒呈不規(guī)則的圓形并有拖尾的現(xiàn)象，影響了酶的包埋和釋放效果從而影響酶活[19]。

2.3 氯化鈣添加量對ALDH酶活性的影響

設(shè)定海藻酸鈉添加量為3.0%，分別與2.0%，2.5%，3.0%，3.5%，4.0%的氯化鈣對ALDH酶進行包埋，得到的酶活見圖3。由圖3可知，不同氯化鈣添加量下的包埋酶酶活差異顯著。其中，添加3.0%的氯化鈣包埋效果顯著優(yōu)于其他添加量的。隨著氯化鈣添加量的增加，包埋效果提高，當(dāng)氯化鈣添加量高于3.0%時，包埋效果下降?？赡苁堑秃康穆然}與海藻酸鈉形成的海藻酸鈣凝膠強度較小，會導(dǎo)致酶流失[12]。氯化鈣添加量過高可能使海藻酸鈣凝膠的內(nèi)部網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而影響底物分子與酶分子的相互結(jié)合與作用，使酶活受到影響[19]。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖3 氯化鈣添加量對包埋酶酶活的影響Figure 3 Effect of calcium chloride concentration on enzyme activity

2.4 包埋酶的冷藏穩(wěn)定性

由圖4可知，未進行包埋的游離酶在5 d內(nèi)相對酶活下降至44.13%，而包埋酶的相對酶活僅下降了6.69%，游離酶的酶活下降速率明顯快于包埋酶的，說明用海藻酸鈉和氯化鈣進行包埋對酶起到了較好的保護效果。

圖4 游離酶與包埋酶穩(wěn)定性的比較Figure 4 Comparison of the stability of free enzyme and embedding enzyme

2.5 模擬胃腸道環(huán)境下酶活變化

未進行包埋的游離酶經(jīng)胃液消化10 min后已檢測不出酶活，說明該酶在胃液環(huán)境中極不穩(wěn)定。而利用海藻酸鈉與氯化鈣進行包埋后的酶在模擬胃液消化環(huán)境下表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性，包埋酶經(jīng)胃液消化3 h后，酶活仍然保留了56.39%(圖5)。在模擬腸液消化環(huán)境下，包埋酶在前30 min表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，相對酶活保持在90%以上，之后酶活下降速度加快，降至60%以下(圖6)，與萬茵等[11]的研究結(jié)果一致?？赡苁且驗楹Ｔ逅徕}顆粒的結(jié)構(gòu)受到了破壞，導(dǎo)致內(nèi)部包埋的酶滲出，但是酶活仍然被較好保留，說明海藻酸鈉與氯化鈣的包埋起到了較好的保護效果，有效增加了ALDH在胃腸道環(huán)境下的穩(wěn)定性。

圖5 包埋酶在模擬胃液消化環(huán)境下的酶活變化Figure 5 Enzyme activity changes of embedding enzymes in simulated gastric juice digestion

圖6 包埋酶在模擬腸液消化環(huán)境下的酶活變化Figure 6 Enzyme ativity changes of embedding enzyme in simulated intestinal juice dig

3 結(jié)論

對6株W.anomalus酵母的ALDH酶活進行測定，發(fā)現(xiàn)J9酵母菌株的ALDH酶活最高。選取J9作為研究對象，優(yōu)化ALDH酶包埋工藝，最終結(jié)果顯示3.0%海藻酸鈉與3.0%氯化鈣的包埋效果最佳，包埋酶在冷藏及在胃腸道環(huán)境下有很好的穩(wěn)定性?？纱龠M酵母菌醛脫氫酶在食品領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，對于降低加工類食品中的一些有害醛類從而降低食品中的風(fēng)險具有深遠意義。后續(xù)可進一步研究ALDH酶體內(nèi)活性及清除活性醛的效果。